Abstract
Fundo
O β1,3-N-acetilglucosaminiltransferase -3 gene (
B3GNT3
) codifica um membro da família B3GNT que funciona como a estrutura do esqueleto de dimérico sialil-Lewis a e está envolvida na biossíntese do L-selectina ligando, direcção dos linfócitos e o tráfico de linfócitos. B3GNT3 tem sido implicado como um elemento importante para o desenvolvimento de certos cancros. No entanto, as características de B3GNT3 no desenvolvimento e progressão do cancro permanecem em grande parte desconhecida. Assim, nosso estudo teve como objetivo investigar o padrão de expressão e o valor prognóstico da B3GNT3 em doentes com cancro do colo do útero em estágio inicial.
Métodos
Os níveis de mRNA e de proteína de
B3GNT3
expressão foram examinados em oito linhas celulares de cancro do colo do útero e dez tumores de cancro cervical emparelhados, utilizando PCR em tempo real e western blotting, respectivamente. A imuno-histoquímica (IHQ) foi utilizado para analisar a expressão da proteína B3GNT3 em tecidos embebidos em parafina de pacientes com câncer cervical 196 em fase inicial. As análises estatísticas foram aplicados para avaliar a associação entre o
B3GNT3
pontuações de expressão e parâmetros clínicos, bem como a sobrevida do paciente.
Resultados
B3GNT3
expressão era significativamente regulada positivamente em linhas celulares de cancro do colo do útero e das lesões em comparação com as células normais não cancerosas e tecidos cervicais adjacentes. Nos 196 casos de amostras de cancro do colo do útero em estágio inicial testados, o nível de proteína B3GNT3 foi positivamente correlacionada com tipos de alto risco do vírus do papiloma humano (HPV) infecção (P = 0,026), estágio FIGO (P 0,001), o tamanho do tumor (P = 0,025), recorrência do tumor (P = 0,004), o estado vital (P 0,001), quimioterapia concomitante e radioterapia (P = 0,016), o envolvimento espaço linfovascular (P = 0,003) e, mais importante, metástase linfonodal (P = 0,003 ). Pacientes com alta expressão B3GNT3 teve uma menor sobrevida global (SG) e sobrevida livre de doença (DFS) em comparação com aqueles com baixa expressão desta proteína. A análise multivariada sugeriu que a expressão B3GNT3 é um indicador prognóstico independente para pacientes com câncer cervical.
Conclusões
Nosso estudo demonstrou que a expressão B3GNT3 elevado está associado a metástases nos linfonodos pélvicos e os resultados pobres em início de carreira pacientes com câncer cervical. B3GNT3 pode ser um novo marcador de prognóstico e alvo terapêutico para o tratamento do cancro do colo do útero
Citation:. Zhang W, Hou T, Niu C, Song L, Zhang Y (2015) B3GNT3 expressão é um Correlated novo marcador com pélvica Linfonodo Metástase e prognóstico clínico na fase inicial do cancro do colo do útero. PLoS ONE 10 (12): e0144360. doi: 10.1371 /journal.pone.0144360
editor: Valli De Re, Centro di riferimento oncológico, IRCCS Instituto Nacional do Câncer, ITALY
Recebido: 16 de junho de 2015; Aceito: 17 de novembro de 2015; Publicação: 28 de dezembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Em mulheres, o câncer cervical é o terceiro tumor maligno mais comumente diagnosticado do trato reprodutivo em todo o mundo, sendo responsável por um número estimado de 274.000 mortes no mundo por ano [1]. Numerosos estudos têm indicado que os tipos de alto risco de infecção por vírus do papiloma humano (HPV) é um risco principal para o desenvolvimento do colo do útero, mas continua a ser insatisfatório no diagnóstico e avaliação do prognóstico [2]. Avanços nos métodos terapêuticos e ferramentas de diagnóstico diminuíram a incidência e mortalidade do cancro cervical [3]. No entanto, ainda é a principal causa de morte relacionada ginecológico-oncologia nos países em desenvolvimento, especialmente os pacientes com metástases em linfonodos [4]. Além disso, metástase linfonodal é o fator prognóstico mais forte para o cancro do colo do útero em estágio inicial (estágio FIGO Ib-IIa) e determina a estratégia de tratamento para o cancro do colo do útero [5]. expressões alteradas de oncogenes, tais como
Bmi-1 |,
URG4
e
C14ORF166
[6-8], foram identificados como potenciais marcadores prognósticos em câncer cervical. No entanto, o poder de muitos biomarcadores identificados para prever metástase linfática e evolução clínica de tumores individuais é limitada. Assim, a identificação de novos e biomarcadores específicos para a detecção precoce e previsão de metástases em linfonodos e prognóstico no câncer do colo do útero é importante.
O gene que codifica β1,3-N-acetilglucosaminiltransferase-3 (B3GNT3), anteriormente 1β3GlcNAcT chamado núcleo, está localizado no cromossoma 19q13.1 e compreende três exões [9]. Ele é um membro da família β3GlcNAcT com um ARNm de comprimento completo de 2720 pb que codifica uma proteína de 43 kDa altamente conservada, que é classificada como uma proteína transmembranar de tipo II [10]. A família β3GlcNAcT compreende pelo menos oito β3GlcNAcTs diferentes que estão associados com transformação maligna [11]. Regulação negativa da B3GNT1 está associada com mau prognóstico no adenocarcinoma ductal pancreático [12]. Etcheverry [13] descobriu que B3GNT5 foi superexpresso com um promotor hypomethylated em tecidos de glioblastoma em comparação com tecidos de controle do cérebro. Shibata [14] mostrou que B3GNT7, que funciona na biossíntese do antigénio HMOCC-1, é expresso em mais elevado em células de cancro do ovário humano, com relação aos ovários normais. O nível de transcrição B3GNT8 foi marcadamente aumentada e pode estar envolvido na malignidade em leucemia, carcinoma da laringe, do cólon e cancro gástrico [15, 16, 17, 18].
B3GNT3 expressão foi observada em tecido normal, incluindo do cólon, jejuno, do estômago, do esófago, traqueia placenta e [19]. Recentemente, Ho [20] relataram que B3GNT3 pode desempenhar um papel importante na supressão do fenótipo maligno de células de neuroblastoma, incluindo a migração e a invasão, por supressão da FAK, Akt e ERK, que são importantes moléculas de sinalização a jusante para integrinas e receptores de factor de crescimento de numerosas . No entanto, é relatado que a proteína B3GNT3 participa no desenvolvimento e progressão de cancros humanos, tais como o linfoma não-Hodgkin (NHL), câncer de cólon, câncer de células escamosas do esôfago (CEB), e de pâncreas e câncer hepatocelular [10,19,21 ]. Por exemplo, ele [21] encontraram uma associação entre o
B3GNT3
lugar, os níveis de CA19-9 eo sialil Lewis Um antígeno, que pode ser o mecanismo potencial no CCEO, pâncreas e câncer hepatocelular. Na etiologia de NHL, B3GNT3 desempenha um papel dominante em L-selectina biossíntese de ligando, que é importante para a sobrevivência de células tumorais e metástases [10]. B3GNT3 é susceptível de ser o candidato mais provável envolvidos na biossíntese da estrutura de espinha dorsal de sialil dimérico de Lewis A (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc), que é um antigénio associado glicoesfingolipídio cancro em tecidos de cancro do cólon humano e a linha celular de cancro do cólon Colo205 [19]. Além disso, Yeh et ai. [9] relataram que B3GNT3 dirige a extensão do núcleo de um O-glicanos de mucina-tipo, o que muitas vezes faz a sialil-Lewis x antigénio 6-sulfo, um epitopo expressa em vénulas de alto endotélio (HEV) e funciona como um ligando L-selectina necessária para homing linfócitos. Estas descobertas sugerem que B3GNT3 podem desempenhar diferentes papéis no desenvolvimento e progressão de vários cancros. No entanto, os estudos sobre a associação entre B3GNT3 e os cancros são raros, e não há nenhum relatório publicado sobre as características de expressão B3GNT3 e sua clínica significado /prognóstico no câncer de colo uterino, particularmente a correlação entre a expressão B3GNT3 e linfática pélvica metástase (PLNM).
Aqui, nós teve como objetivo explorar o padrão de expressão de B3GNT3 em linhas celulares de cancro do colo do útero e em início de carreira amostras de cancro cervical. Além disso, investigamos a relação entre ele e os parâmetros clínico e analisar o seu valor no prognóstico dos doentes com cancro do colo do útero em estágio inicial com base em dados de resultados clínicos.
Métodos
declaração Ética
a comissão de ética em pesquisa do Centro de Câncer, Sun Yat-Sen University (China), desde a aprovação ética para este estudo, e todos os pacientes fornecidos consentimento informado por escrito. Todos os espécimes foram manipulados e armazenados de forma anônima de acordo com padrões éticos e legais.
As linhas celulares
linhas celulares de cancro do colo do útero foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, MD, EUA). As linhas celulares de cancro do colo do útero, incluindo células HeLa, HeLa229, HCC94, SiHa, ME-180, MS751, CaSki e C-33A, foram mantidas em meio RPMI-1640 (Gibco BRL, Rockville, MD) suplementado com soro de bovino fetal a 10% ( FBS) (Hyclone, Logan, UT, EUA) e 1% de antibióticos (100 U /ml de penicilina e 100 lg /ml de estreptomicina). células cervicais normais primárias epiteliais (NC) foram isoladas a partir de tecido epitelial não cancerosa do colo uterino e foi cultivada em meio KeratinocyteSFM completo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Para o uso de materiais clínicos para fins de investigação, antes consentimentos informados por escrito foram obtidas de pacientes e aprovação foram obtidos a partir Comitê de Ética em Sun Yat-sen University Cancer Center Institutional Research.
Amostras e características clínicas
Todos os pacientes deram consentimento informado por escrito para análise dos seus tecidos para para fins de investigação, eo estudo foi aprovado pelo Cancer Center Institutional Review Board Sun Yat-sen University. Um total de 193 amostras de cancro do colo do útero paraffinembedded foram obtidos do Departamento de Patologia da Sun Yat-sen University Cancer Center entre 2007 e 2009. estadiamento do tumor e classificação clínico-patológico foram realizados de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia, 2009 (FIGO) classificação do carcinoma do colo uterino. Os 193 pacientes estavam em câncer cervical estágio IB1-IIA2 e todos receberam uma histerectomia radical e linfadenectomia sem radioterapia pré-operatório, quimioterapia ou terapia hormonal. No nosso estudo, os pacientes com qualquer dos factores de alto risco recebido quimioterapia e /ou radioterapia pós-operatória. Em detalhe, os factores de “alto risco” incluiu PLNM, alto grau de diferenciação, envolvimento parametrial positiva, o envolvimento espaço linfovascular positivo, margem cirúrgica positiva, invasão estromal profunda e tamanho do tumor grande ( 4 cm). Além disso, pacientes com invasão estromal única profunda ou margens cirúrgicas positivas receberam radioterapia. Pacientes com apenas uma participação linfovascular espaço, alto grau de diferenciação, ou o tamanho do tumor grande ( 4 cm) receberam quimioterapia. dados clínico-patológicos foram coletados de registros médicos impacientes e resumidos na Tabela 1. Todos os pacientes tinham registros de acompanhamento de mais de 5 anos e o prazo de acompanhamento foi de janeiro de 2014. Survival tempo foi contado a partir da data da cirurgia para o seguimento -se prazo ou a data da morte (geralmente o resultado de recorrência do câncer ou metástase). O tempo médio de follow-up para a coorte de câncer cervical primário foi de 51 meses, com um intervalo de tempo de seguimento de 3 a 99 meses. O HPV pré-operatória testar nosso hospital utilizados para examinar o estado de infecção de pacientes foi polimerase de reacção em cadeia de detecção de HPV. Nesta coorte, 153 pacientes com câncer cervical mostrou a infecção pelo HPV (+), enquanto que 40 pacientes com câncer cervical foram infecção pelo HPV (-). Dezesseis frescos câncer cervical e emparelhados tecidos cervicais não cancerosas adjacentes (ANT) foram coletadas para PCR em tempo real, Western blot e imunohistoquímica (IHC).
qPCR
O ARN celular total foi isolado a partir de células cultivadas e dezesseis do cancro do colo do útero e as amostras de tecido fresco emparelhados adjacentes não cancerosas cervicais utilizando o Reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) como o fabricante instruído. Estas amostras de ARN foram pré-tratados com DNase isenta de RNase, e 2 ug de ARN de cada amostra foi utilizada para a síntese de ácido desoxirribonucleico complementar (ADNc) priming com hexâmeros aleatórios. Os iniciadores foram desenhados por Primer Expresso software v 2.0 (Applied Biosystems). Foram utilizados os seguintes iniciadores: B3GNT3, 5′-GCCGGAGATACTTCATCCTG-3 ‘e 5′-GAGAGGAGCAGGTAGAGGGG-3′; desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) de genes, 5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3 ‘e 5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’. O reagente de detecção usada nesta experiência foi de SYBR verde. O volume total de cada amostra foi 10 ul: 2 * SYBR mix Verde: 5 ul; ADNc: 1UL; iniciador directo: 0.5ul; Reverter 0.5ul primário; ddH2O 3UL. Para a amplificação mediada por PCR de B3GNT3 ADNc, uma amplificação inicial, utilizando iniciadores específicos do B3GNT3 foi realizada com um passo de desnaturação a 95 ° C durante 10 min, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 60 s, emparelhamento das escorvas a 55 ° C durante 30 s, e prolongamento do iniciador a 72 ° C durante 30 s. Após a conclusão das etapas de bicicleta, um passo final de extensão a 72 ° C durante 5 min foi feito antes de a mistura de reacção foi armazenada a 4 ° C. PCR em tempo real foi então utilizado para determinar o aumento de vezes de ARNm B3GNT3 em linhas celulares de cancro do colo do útero em relação a células epiteliais cervicais normais e em cada um dos tumores primários do colo do útero em relação ao tecido normal adjacente feita a partir do mesmo paciente. Cada experiência foi efectuada em triplicado e repetidos pelo menos três vezes. A expressão de ARNm de B3GNT3 foi normalizado para GAPDH.
Western blotting
A proteína total foi preparado utilizando os kits de extracção total de proteína de células de acordo com as instruções do fabricante (Millipore, Bedford, MA). Quantidades iguais de cada extracto de proteína (30 ug) foram separados por electroforese em géis de SDS 9,5% de poliacrilamida. Após transferência para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA), as membranas foram bloqueadas durante 1 h à temperatura ambiente com leite isento de gordura a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20 (TBST) . As membranas foram então incubadas com anticorpo anti-B3GNT3 (1: 1000, Proteintech, 18098-1-PA) durante a noite a 4 ° C. anticorpo IgG peroxidase de rábano conjugado com anti-coelho (1: 2000, Santa Cruz, SC-2004) foi usada para determinar a expressão B3GNT3. Finalmente, a expressão B3GNT3 foi detectado usando reagente ECL privilegiada Ocidental blotting detecção (Amersham) de acordo com as instruções do fabricante. membranas riscados foram retirados e re-sondada com um anticorpo anti-alfa-tubulina (Sigma, Saint Louis, MO) como um controlo de carga.
imuno-histoquímica (IHC) análise
coloração imuno-histoquímica foi realizada para avaliar o padrão de expressão da proteína em B3GNT3 193 tecidos de cancro cervical humanos embebidos em parafina. Os procedimentos foram realizados com protocolos clássicos. Em resumo, os blocos de tecido embebidos em parafina a partir de doentes com cancro cervical foram cortadas em secções de 4 um de espessura e cozido a 65 ° durante 30 min. Os cortes foram desparafinados em xileno e re-hidratadas seguido por na água. As lâminas foram imersas em tampão de EDTA e depois recuperação antigénico microondas foi processado para a recuperação de antigénio. Em seguida, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada por peróxido de hidrogénio a 3% durante 15 min, seguido por incubação com 1% de albumina de soro de bovino para bloquear a ligação não específica. Os espécimes foram incubados durante a noite a 4 ° C com um anticorpo policlonal de coelho contra B3GNT3 (Upstate Biotechnology, 1: 100, Proteintech, 18098-1-AP). Para controlos negativos, o anticorpo anti-B3GNT3 foi substituído por soro de cabra normal. Após lavagem com PBST, as lâminas de tecido foram sequencialmente incubadas com um anticorpo biotinilado anti-coelho secundário (Sigma) à temperatura ambiente durante 30 min, seguido de nova incubação com estreptavidina-peroxidase de rábano complexo (Sigma) à temperatura ambiente durante 30 min. As secções de tecido foram imersas em 3-amino-9- acetato de carbazole e contrastadas com hematoxilina 10% de Mayer, desidratadas e montadas em Crystal Mount.
A avaliação do grau de imunocoloração foi avaliada e teve independentemente por dois patologistas cego para as características histopatológicas e os dados do paciente de amostras. Para a análise semi-quantitativa, a pontuação de cada amostra de tecido foi determinada com base na percentagem de células de tumor coradas positivamente e a intensidade da coloração. Os resultados imunocoloração para B3GNT3 foram pontuados com base nos seguintes critérios: (i) a proporção de células tumorais positivas em tecido tumoral: 0 (0%), 1 (1% -10%), 2 (11% -50%) , 3 (51% -75%) e 4 (76% -100%); (Ii) intensidade de coloração: 0 (nenhuma coloração), 1 (coloração fraca = amarelo claro), 2 (coloração moderada = amarelo marrom), 3 (forte coloração = marrom). O índice de marcação foi calculado como o produto da percentagem de células positivas para o marcador × intensidade da coloração (intervalo de 0 a 12). valores de corte para expressão B3GNT3 foram escolhidos com base em uma medida de heterogeneidade com a análise estatística de log-rank de ensaio em relação à sobrevivência global. Um valor de corte ideal foi identificada como segue:. A pontuação do índice de coloração of≥ 6 foi considerado como tumores com expressão alta B3GNT3 e ≤4 foi considerado como tumores com baixa expressão de B3GNT3
Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software estatístico SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, EUA). O teste do qui-quadrado e teste exato de Fisher foram aplicados para avaliar a relação entre a expressão B3GNT3 e características clínico-patológicas. correlações bivariadas entre as variáveis foram calculados através do coeficiente de correlação de Spearman. As curvas de sobrevida foram traçadas pelo método de Kaplan-Meier e as diferenças foram analisadas pelo teste de log-rank. Um modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para análise uni e multivariada para determinar a significância independente de co-variáveis clínicas relevantes. Os valores de
P 0
.
05
em todos os casos foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
expressão elevada de B3GNT3 em linhas celulares de cancro do colo do útero
Real- PCR em tempo e western blotting foram utilizados para examinar os níveis de expressão B3GNT3 em oito linhas celulares de cancro do colo do útero (HeLa, HeLa 229, HCC 94, C33A, CaSki, MS751, ME-180 e SiHa) em comparação com uma linha celular epitelial cervical normal (NC ).
a análise Western blot mostrou que todas as oito linhas celulares de cancro do colo do útero (MS751, C33A, Hela, HeLa229, SiHa, HCC94, CaSki, e me-180) apresentaram níveis significativamente mais elevados de proteína B3GNT3 comparação com NC ( Fig 1A).
B3GNT3
expressão de ARNm foi de pelo menos 3,5 vezes maior nas linhas celulares de cancro do colo do útero comparados com NC (Fig 1B). Estes resultados demonstraram que B3GNT3 é regulada positivamente em linhas celulares de cancro do colo do útero.
(a e b) Expressão de ARNm e proteína B3GNT3 em linhas celulares de cancro do colo do útero (C33A, Ca Ski, HeLa, HeLa 229, MS751, Me- 180, SiHa e HCC 94) e linhas de células cervicais normais foram examinados por transferência western (a) e quantitativa PCR em tempo real (qPCR) (b). Os níveis de expressão foram normalizados contra α-tubulina e GAPDH, respectivamente. As barras de erro representam o desvio padrão da média (DP) calculado a partir de três experiências em paralelo. * P 0,05.
B3GNT3 é overexpressed em tecidos de cancro cervical
Depois disso, se a regulação positiva B3GNT3 encontrados em linhas celulares de cancro do colo do útero foi clinicamente relevante foi confirmada por quantitativa PCR em tempo real (qPCR ) e análise de transferência de western em 10 tecidos de cancro do colo do útero (T) combinados com amostras de tecidos não cancerosos adjacentes (ANT). Como mostrado na Fig 2B, a expressão de
B3GNT3
ARNm foi dramaticamente mais elevada nas 10 amostras de tecido de cancro do colo do útero do que nos tecidos normais emparelhados, com o nível de expressão diferencial que varia de 4.2- a 17,4 vezes. Consistente com estes resultados, a proteína B3GNT3 apresentaram maior abundância em todas as 10 amostras de cancro do colo do útero, em comparação com o ANT combinados (Fig 2A).
(A) Imagens representativas de análises de transferência de Western da expressão da proteína B3GNT3 em dez combinados pares de tecidos cervicais cancerosas (T) e tecidos não cancerosos adjacentes (ANT). ácido a-tubulina foi utilizada como controlo de carga. (B) O T média /rácios ANT de
B3GNT3
expressão de mRNA no câncer cervical emparelhado (T) e os tecidos não cancerosos adjacentes (ANT) foram quantificados por quantitativa PCR em tempo real (qPCR) e normalizados contra a GAPDH. As barras de erro representam o desvio padrão da média (DP) calculado a partir de três experiências em paralelo. (C) métodos de imunohistoquímica da expressão da proteína B3GNT3 em dez pares de tecidos de câncer do colo do útero combinados. * P 0,05.
Associação entre B3GNT3 superexpressão e características clínicas de câncer cervical
A imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada para investigar o padrão de proteína B3GNT3 expressão em uma coorte retrospectivo de 193 casos de câncer cervical , incluindo 85 casos de IB1 estágio (44,1%), 29 casos de IB2 estágio (15,0%), 56 casos de IIA1 estágio (29,0%) e 23 casos de IIA2 estágio (11,9%). Como mostrado na Fig 3A, a imunorreactividade da proteína B3GNT3 foi detectada em níveis variáveis e localizada principalmente no plasma celular. A coloração positiva para a proteína B3GNT3 foi observada em 78 casos (40,4%) dos 193 inscritos amostras de pacientes, enquanto 115 casos (59,6%) coradas de forma negativa ou apenas fracamente para B3GNT3 proteína (Tabela 1). intensa expressão de proteína B3GNT3 foi observada em 24,7% (21/85), 41,4% (12/29), 58,9% (33/56) e 52,2% (12/23) de câncer do colo do útero da FIGO estágio Ib1, Ib2, IIa1and IIa2, respectivamente (
P Art 0,05, χ
2 de teste). Curiosamente, os dados de coloração IHC quantitativos revelaram que os valores de densidade óptica média (MOD) de coloração B3GNT3 no grupo de metástases em linfonodos foram estatisticamente maior do que no grupo livre de metástases em linfonodos (P 0,001, Fig 3B).
B3GNT3 positiva de coloração foi observado principalmente no citoplasma das células de cancro do colo do útero. (A), a e b, B3GNT3 expressão não foi detectada em tecidos normais do colo do útero; c e d, imagens representativas de coloração B3GNT3 fraco em tecidos de câncer do colo do útero; E e F, imagens representativas de coloração B3GNT3 moderada em tecidos de câncer do colo do útero; G e H, imagens representativas de coloração B3GNT3 forte em tecidos de cancro do colo do útero. (B) As análises estatísticas da densidade média média óptica (MOD) de coloração B3GNT3 no grupo de metástases em linfonodos e o grupo livre de metástases em linfonodos. * P 0,05. curvas (C) de Kaplan-Meier de dados de análise univariada (teste log-rank) .A sobrevida global (SG) e sobrevida livre de doença (DFS) para os pacientes de alta e baixa expressão B3GNT3.
IHC coloração de B3GNT3 níveis de expressão de proteína foi analisada ainda mais para determinar sua relação com as características clinicopatológicas de câncer cervical. Conforme resumido na Tabela 2, a expressão da proteína de alta B3GNT3 tendem a ser fortemente correlacionada com a infecção pelo HPV, fase FIGO, tamanho do tumor, a recorrência do tumor, estado vital, quimioterapia concomitante e radioterapia, envolvimento do espaço linfovascular e, mais importante, metástase de nódulo linfático (Tabela 2) . Estes dados foram confirmados por análise de correlação de Spearman (Tabela 3). No entanto, nenhuma relação significativa foi encontrada entre a expressão da proteína B3GNT3 e idade do paciente, grau de diferenciação histológica, antígeno de carcinoma de células escamosas, tipo histológico, quimioterapia, radiação, invasão miométrio, propriedades da margem cirúrgica e infiltração de órgãos parauterine nos pacientes com cancro do colo do útero .
expressão alta B3GNT3 prediz mau prognóstico de doentes com cancro do colo do útero em estágio inicial
em nossa coorte do estudo, o impacto prognóstico da expressão da proteína B3GNT3 no cancro do colo do útero foi explorada usando a análise de Kaplan-Meier eo teste de log-rank. O teste de log-rank mostrou que o tempo de sobrevivência era significativamente diferente entre os grupos de expressão de proteínas B3GNT3 baixas e altas (ambos p 0,001, Figura 3C). Pacientes com níveis elevados B3GNT3 tiveram uma sobrevida significativamente mais curto global (SG) e sobrevida livre de doença (DFS) do que aqueles com níveis baixos. Os cumulativos OS e DFS taxas foram 90,5% e 97,2%, respectivamente, no grupo de baixo B3GNT3, enquanto que eles foram apenas 65,7% e 84,7%, respectivamente, no grupo de alto B3GNT3. Empregou-se um coorte de validação para avaliar melhor o valor prognóstico da B3GNT3 para subgrupos específicos de pacientes, que foram estratificados de acordo com a idade, a infecção pelo HPV, FIGO Palco, PLNM, antígeno de carcinoma epidermóide, o tamanho do tumor, grau de diferenciação, quimioterapia, radiação, concorrente quimioterapia e radioterapia, invasão miométrio, propriedades da margem cirúrgica, infiltração de órgãos parauterine e envolvimento do espaço linfovascular. A expressão da proteína B3GNT3 foi fortemente associada com a duração OS de pacientes sem PLNM (teste-rank de log, P 0,001), com antígeno carcinoma de células escamosas ≥ 1,5 ng /ml (teste-rank de log, P = 0,002), com infecção pelo HPV (teste-rank de log, P = 0,001), com invasão profunda do estroma (teste-rank de log, P = 0,028), com o estágio clínico (fase Ib1-Ib2, teste log-rank, P = 0,004; Stage IIa1-IIa2 ,-log rank test, P = 0,040), com grau de diferenciação histológica (grau 1-2, teste log-rank, P prova de grau 2-3, log-rank, P = 0,001) e com a quimioterapia (; 0,001 teste log-rank, P = 0,004) (Fig 4). A análise de regressão univariada de Cox revelou que em um nível mais elevado de B3GNT3, PLNM, antígeno de carcinoma de células escamosas, o envolvimento espaço linfovascular e recorrência prever um prognóstico pobre para início de carreira pacientes com câncer cervical (Tabela 4). Em seguida, a análise multivariada, utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox para todas as variáveis que foram significativas na análise univariada revelou que a expressão B3GNT3, PLNM e recorrência servido fatores prognósticos independentes para pacientes com câncer cervical (Tabela 4). Assim, nossos resultados indicaram que a proteína B3GNT3 pode representar um indicador prognóstico potencial para pacientes com câncer cervical em estágio inicial.
(a) A sobrevida global (OS) dos pacientes sem metástase ganglionar de alta e baixa expressão B3GNT3 . (B) O SO para os pacientes com antigénio de carcinoma de células escamosas 1,5 ng /ml de alta e baixa expressão B3GNT3. (C) O sistema operacional para os doentes com infecção por HPV de alto versus baixa expressão B3GNT3. (D) O sistema operacional para os pacientes com invasão estromal profunda de alta e baixa expressão B3GNT3. (E) O sistema operacional para os pacientes em estágios Ib1-Ib2 com alta versus baixa expressão B3GNT3. (F) O sistema operacional para os pacientes em estágios IIa1-IIa2 com alta versus baixa expressão B3GNT3. (G) O sistema operacional para os pacientes na diferenciação 1-2 de alta e baixa expressão B3GNT3. (H) O sistema operacional para os pacientes na diferenciação 2-3 de alta e baixa expressão B3GNT3. (I) O sistema operacional para os pacientes de alta e baixa expressão B3GNT3 que receberam quimioterapia.
Discussão
No presente estudo, nós mostramos, pela primeira vez, que a expressão da proteína B3GNT3 é regulada no cancro do colo do útero e se correlaciona com características clínicas, especialmente PLNM de doentes com cancro do colo do útero em estágio inicial. Além disso, a expressão da proteína de alta B3GNT3 reduziu o OS e DFS desses pacientes, especialmente aqueles que receberam quimioterapia. A análise multivariada revelou que a expressão B3GNT3 pode ser um indicador independente de prognóstico de sobrevivência em doentes com cancro do colo do útero.
B3GNT3 está envolvida na biossíntese das cadeias de poli-N-acetillactosamina e a biossíntese da estrutura de espinha dorsal de sialil Lewis A dimérica . Os papéis essenciais da B3GNT3 em tumorigênese foram revelados recentemente [10, 19, 20, 21]. Shiraishi [19] demonstraram que B3GNT3 foi altamente expressa na linha celular de cancro do cólon Colo205. Eles relataram que os tecidos cancerígenas do cólon humano e a linha de células do cancro do cólon Colo205 conter glicoesfingolipídios associados ao câncer com antígenos diméricas Lewis A (Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1-3Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc) e B3GNT3 é provável que ser o candidato mais provável envolvidos na biossíntese da estrutura de espinha dorsal de sialil dimérico de Lewis a (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc). Cerhan [10] verificaram que B3GNT3 está relacionada com a função imune e inflamação, e desempenha um papel importante no tráfico de linfócitos e migração, que conduzem para a sobrevivência de células tumorais e metástases em NHL. Outro estudo indicou que o
B3GNT3
lócus está associada com níveis CA19-9 no cancro pancreático [21]. B3GNT3 é um β-1, 3-N-acetylglucosmaniyltransferase envolvida na produção da estrutura de espinha dorsal de sialil dimérico Lewis A, que é o epítopo antigénico de hidratos de carbono de CA19-9. Portanto, este pode ser o potencial mecanismo subjacente à associação entre variantes no
B3GNT3
lócus e concentrações CA19-9. O estudo [21] sugeriu que B3GNT3 desempenha um papel oncogênico em certos tipos de câncer. No entanto, Ho [20] relataram que B3GNT3 pode desempenhar um papel crítico na supressão das propriedades malignas de neuroblastomas e sua expressão alterada pode contribuir para a patogénese de neuroblastoma. É comum que certos genes possuem funções oncogénicas em vários tipos de cancros, mas têm papéis anti-oncogénicas em outros tipos de cancros. Por exemplo, PTK6 é sobre-expresso no carcinoma invasivo ductal da mama, carcinoma do ovário seroso, carcinoma pulmonar de células não pequenas, carcinoma do cólon e cancros da cabeça e pescoço [22-26]. Em contraste, PTK6 pode ser um supressor tumoral importante em vários cancros humanos, tais como carcinoma de células escamosas da laringe humano e carcinoma de célula escamosa esofágica [27, 28]. Além disso, o papel de B3GNT3in carcinoma cervical é pouco claro. Portanto, avaliamos se B3GNT3 é regulada no cancro do colo do útero e é clinicamente associada ao desenvolvimento e progressão do câncer cervical. Em nosso estudo, nós reportamos que o mRNA e proteína B3GNT3 foram sobre-expressos em linhas celulares de cancro do colo do útero e amostras de cancro do colo do útero (estádios Ib-IIA). Um anticorpo disponível comercialmente contra B3GNT3 foi usado em imunohistoquímica. IHC mostrou coloração negativa ou apenas fracamente no tecido cervical normal. No entanto, a coloração positiva para a proteína B3GNT3 foi observada em amostras de cancro do colo do útero. Além disso, os resultados de nossas Realtime-PCR, Western Blot e IHC foram consistentes. Portanto, este anticorpo policlonal reconhece especificamente B3GNT3 única em tecidos de cancro do colo do útero. Além disso, verificou-se que a expressão B3GNT3 se correlaciona com características clínicas de pacientes com cancro do colo do útero em estágio inicial, como a infecção pelo HPV, o estágio FIGO, tamanho do tumor, recorrência do tumor, status vital, quimioterapia concomitante e radioterapia, o envolvimento espaço linfovascular e mais importante, linfonodo metástase.