Abstract

A estrutura de solução de RMN de alta qualidade é apresentado para a proteína hMcl-1 (171-327), que compreende os resíduos 171-327 da proteína anti-apoptótica humana Mcl-1 (hMcl-1) . Uma vez que esta construção contém os motivos de sequência de três Bcl-2 homologia (BH) que participam na formação de um local de ligação para inibidores de hMcl-1, que é considerada crucial para a concepção baseada na estrutura de drogas anti-cancerosas novos bloqueiam o MCL1 relacionada via anti-apoptótica. Enquanto as coordenadas de uma estrutura de RMN solução para uma construção correspondente do homólogo de rato (MMCL-1) estão disponíveis ao público, a estrutura é a primeira estrutura de resolução atómica relatado para a ‘forma apo’ da proteína humana. A comparação das duas estruturas revela que hMcl-1 (171-327) apresenta um /inibidor sulco pouco mais larga a ligação do ligando, bem como uma distribuição de cargas diferentes no interior do sulco de ligação de BH3. Estes resultados sugerem fortemente que a disponibilidade da estrutura humana é de importância crítica para apoiar futura concepção de medicamentos contra o câncer

Citation:. Liu G, Poppe L, Aoki K, Yamane H, Lewis J, Szyperski T (2014 ) Estrutura RMN de alta qualidade da Human Anti-apoptóticos Protein Domínio Mcl-1 (171-327) para o cancro Drug design. PLoS ONE 9 (5): e96521. doi: 10.1371 /journal.pone.0096521

editor: Annalisa Pastore, Instituto Nacional de Pesquisa Médica, Medical Research Council, Londres, Reino Unido

Recebido: 17 de dezembro de 2013; Aceito: 08 de abril de 2014; Publicado em: 02 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Amgen Inc. (www.amgen.com). LP, KA, HY e JL são funcionários da Amgen Inc. e Amgen Inc. desempenhou um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar e preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Este estudo foi financiado pela Amgen Inc., mas não há interesse concorrente que podem influenciar este trabalho. Esta filiação não altera a adesão dos autores para as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O mau funcionamento da apoptose celular [1] é uma grande marca de câncer. A regulação da apoptose depende da família de proteínas Bcl-2, que contêm um ou vários homologia de Bcl-2 (BH) motivos de sequência. Com base na sua função e a similaridade dos seus respectivos motivos de sequência BH, estas proteínas podem ser agrupados em três classes [2], [3]: (i) com vários domínios de proteínas pró-apoptóticas, tais como Bax e Bak, (ii) anti (ou seja, pró-sobrevivência) -apoptotic proteínas tais como Mcl-1, Bcl-1, Bcl-x

L, Bcl-w e Bfl-1 /A1, todos os quais exibem uma arquitectura semelhante como Bax e Bak, e (iii) diversas proteínas pró-apoptóticos que compreendem apenas um único motivo de sequência BH3 como Bid, Bad, Bim, Puma, Noxa, HRK, Bmf e Nbk /Bik ( ‘BH3-only’ proteínas). O motivo de BH3 da classe (iii) proteínas constitui um α-hélice anfipática, que interage especificamente com uma bolsa hidrofóbica formada em ambos classe pró-apoptótica (I), e da classe anti-apoptótica (ii) proteínas com participação dos respectivos motivos BH [ ,,,0],2], [3]. A inibição da formação de complexos proteína-proteína resultante oferece uma estratégia promissora para o tratamento do cancro. Por exemplo, a pequena molécula antagonista de Bcl-2 ABT-737 [4] inibe a classe de anti-apoptótica (ii) proteínas Bcl-x

L, Bcl-w e Bcl-1, e um congénere [5] que podem ser administrado oralmente está actualmente em ensaios clínicos.

o anti-apoptótica, Pro-350-sobrevivência resíduo de proteína de Mcl-1 ( ‘1-leucemia mielóide célula’) [2] é ancorado principalmente na membrana mitocondrial externa pela e um domínio de trans-membrana C-terminal contém três domínios BH DA SEQUÊNCIA: BH3 (resíduos 209-223), BH1 (252-272) e BH2 (resíduos 304-319) [2]. Mcl-1 inibe a apoptose induzida pelo receptor de morte por se ligarem selectivamente ao Bid truncado (tBid) [6] e podem sequestrar endógena Bak para bloquear a morte celular de Bak-mediada. Além disso, Mcl-1 interage com diversas proteínas BH3-only (Bim, Bid e Puma, Noxa e Bak). Assim, Mcl-1 desempenha um papel inicial na resposta aos sinais que dirigem quer a sobrevivência celular ou a morte celular [2], e tem sido mostrado para ser regulada para cima em numerosos tumores malignos. Abordagens que revoga a função anti-aptototic do Mcl-1 quer reduzindo sua abundância ou por inactivação sua BH3-ligante do sulco mostram a grande promessa funcional para o tratamento do câncer [2], [4], [6], [7]. Aqui nós apresentamos a alta qualidade estrutura de solução de RMN de segmento polipeptídeo 171-327 da humana Mcl-1 (hMcl-1), que compreende os três BH motivos considerado crucial para a concepção de medicamentos estrutura baseada.

Resultados e discussão

a estrutura de RMN de alta qualidade de hMcl-1 (171-327) foi obtida (Tabela 1) e as coordenadas foram depositados no APO [8] (2mhs código de adesão). A estrutura compreende sete hélices α-α1-a7 (resíduos 173-191, 204-235, 240-253, 262-280, 284-301, 303-308 e 311-319), disposta para formar a característica ‘de Bcl-2 do núcleo «estrutura [9] (Figura 1). As hélices são localmente como globalmente bem definido, ao passo que o terminal C (resíduos 320-327) e as ansas ligando, respectivamente, e hélices α1 α2, hélices e α3 α4, e hélices α4 e α5 são flexível desordenada. O α4 hélice central é cercado por outros seis hélices, com α1, α2, α3 e α5 embalados em torno de um lado, e α6 e α7 embalado contra seu N-terminal. Hélices α2, α3, α4 e α7 participar na formação do sulco de ligação BH3. O potencial de superfície de proteína electrostática é positiva em ambas as extremidades do sulco de ligação de BH3 (devido à presença de Arg 233, Lys 234, Arg 248 e Arg 263) e negativa no lado do lado α3 hélice (devido a Asp 256) (Figura 2). Isto mostra que a distribuição de carga no sulco de ligação de BH3 hMcl-1 (171-327) difere distintamente a partir de outras proteínas anti-apoptóticas [10].

(A) Backbone dos confórmeros 20 representam a solução cyana estrutura do hMcl-1 (171-327), após superposição de backbone N, C

átomos das hélices para RMSD mínima C ‘α e. Os três motivos de sequência BH são coloridos de verde (BH3), vermelho (BH1) e azul (BH2), respectivamente. desenho (B) da fita do menor conformer energia do hMcl-1 (171-327). α-hélices α1-α7 são rotulados e colorido diferente, e a N- e C-terminais são rotulados como “

N ‘

” e “

C’

“. Os números foram gerados usando os programas molmol [36] e PyMOL [37].

(A) Para humana hMcl-1 (171-327) na orientação mostrada na Figura 1 (à esquerda) e depois da rotação de 180 ° em torno do eixo vertical (para a direita). cores da superfície (azul para carregado positivamente; vermelhas para carga negativa) indicaram o potencial eletrostática calculada usando PyMOL [37] e do seu protocolo electrostatics vácuo padrão. (B) O mesmo que em (A), mas para rato MMCL-1 (152-308).

incluindo o nosso hMcl-1 (171-327) estrutura, vinte estruturas de resolução atômicas contendo diferentes construções de Mcl-1 estão actualmente depositado no PDB. Além de proteínas as duas ‘APO hMcl-1 (171-327) e rato MMCL-1 (152-308) [10] [código adesão PDB 1wsx, 89% de identidade de sequência com a proteína humana], as estruturas de dezenove complexos foram depositados ligando-proteína (Tabela 2) [9], [11] – [18]. Claramente, o grande número de estruturas disponíveis reflecte o interesse notável no Mcl-1 como um alvo para o desenvolvimento de novos medicamentos contra o câncer. Sobreposição das hélices revela, como esperado, grande semelhança estrutural para todas as estruturas de proteínas Mcl-1 (Figura 3): O desvio quadrático médio (RMSD) valores variam de 1,05 a 1,54 um parente para hMcl1-1 (171-327 ) (Mesa 2). No entanto, a comparação das duas estruturas de proteínas de apo hMcl-1 (171-327) e MMCL-1 (152-308) com as estruturas complexas que mostra a bolsa de ligação é alargado mediante a formação do complexo (Tabela 2): as distâncias entre o C

α-átomos de resíduos Sua 224 em α2 hélice (His 205 em MMCL-1) e Sua 252 (His 233 em MMCL-1) na extremidade C-terminal da hélice α3 são, respectivamente, -16 Â e ~ 14 a em hMcl-1 (171-327) e MMCL-1 (152-308), e ~18-21 Å nos complexos.

(a) Estruturas de hMcl-1 (171-327) (verde) e MMCL-1 (152-308) (ciano, adesão PDB código 1wsx) após a superposição de a espinha dorsal N, C

átomos das hélices para RMSD mínima C ‘α e. (B) da fita desenho (zoom em (A)), mostrando as diferentes larguras de sulco de ligação de rato proteína (ciano) humana (verde) e. As distâncias entre os átomos de C-alfa-de resíduos Sua 224 em α2 hélice (HIS 205 em MMCL-1) e seu 252 (His 233 em MMCL-1) no C-terminal de α3 hélice se destacam: -16 a No hMcl- 1 (171-327) e ~14 Å MMCL-1 (152-308) (C) a superposição como em (a) de hMcl-1 (171-327) (verde) e MMCL-1 (152-308) (ciano , 1wsx) e seis MCL-1 estruturas complexas selecionados (ver também Quadro 2): Mcl-1 humano complexada com Bim BH3 (magenta, 2nla); quimérico rato-humano LHD-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) complexado com o mouse mNoxaB BH3 (amarelo, 2rod); rato MMCL-1 (152-308) complexado com o mouse NoxaA BH3 (rosa, 2roc); rato MMCL-1 (152-308) complexado com o mouse Puma BH3 (cinza, 2jm6); rato MMCL-1 (152-308) complexado com o mouse NoxaB BH3 (roxo, 2rod); quimérico rato-humano MMCL-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) complexado com humano Bim BH3 (laranja, 2nl9); quimérico rato-humano MMCL-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) complexado com humano Bim BH3 (L62A, F68) (verde claro, 3d7v) .Os dados foram elaborados com os programas molmol [36] e PyMOL [37].

o facto de a proteína apo humana exibe um sulco pouco mais largo do que o homólogo de ligação de ratinho (Tabela 2) pode ser, pelo menos parcialmente, atribuída à cadeia lateral de Leu 246 na proteína humana que não está enterrado tão profundamente quanto a correspondente cadeia lateral de Phe em a proteína de rato. Além disso, ao comparar a proteína de rato humano e, as diferenças são observadas para as distribuições de carga na ranhura de BH3 de ligação (Figura 2): a proteína humana tem uma carga negativa no lado de α3 hélice, enquanto que a superfície correspondente da proteína de rato é carregado positivamente. Esta diferença decorre do Ser 255 correspondente a Lys 236 na proteína mouse. Notavelmente, hMcl-1 (171-327) é estruturalmente mais semelhantes ao hMcl1 (171-327) -hBim complexo de BH3 (Figura 3) do que a apo MMCL-1 (152-308) (Tabela 2).

Tomadas em conjunto, as comparações estruturais mostram que, apesar da identidade de sequência de 89% entre a proteína humana e de ratinho, a disponibilidade do (171-327) estrutura hMcl-1 humana pode-se esperar que seja de importância crítica para suportar futura concepção de medicamentos contra o câncer.

Materiais e Métodos

RMN Preparação de amostras

estudos preliminares mostraram que hMcl-1 (171-327) (UniProtKB /Swiss-Prot ID Q07820 /MCL1_HUMAN ) não é estável em solução. No entanto, o mutante de Cys 286 Ser → é estável durante várias semanas a concentrações ~ 0,7 mM, e tanto o tipo selvagem e mutante de ligação ao péptido de BIM-BH3 com a mesma afinidade (K

d ~ 60 pM) num ensaio Biacore . Por isso, resolvemos a estrutura de RMN do hMcl-1 (171-327) Cys 286 → Ser referido como hMcl-1 (171-327) nesta publicação.

hMcl-1 (171-327) foi clonado, expresso, redobrada e purificada de acordo com protocolos convencionais para produzir uma uniformemente

13C,

amostra de proteína marcada com 15N [19]. Resumidamente, o gene foi clonado num plasmídeo pSR482-21.1 pET21d (Novagen) obtendo-se derivado. A construção resultante contém sete resíduos não nativos na extremidade C-terminal (LHHHHHH) para facilitar a purificação de proteína.

Escherichia coli

BL21 (DE3) células pMGK, um codão estirpe melhorada, foram transformadas com pMcl1-21.1, e cultivadas em meio mínimo MJ9 [20], que contém (

15NH

4)

2SO

4 e

U Restaurant –

13 C-glicose como únicas fontes de azoto e carbono. corpos de inclusão que contenham duplas lavada hMcl-1 (171-327) foram solubilizados em 8 M de cloridrato de guanidina tamponada (VWR) contendo DTT 5 mM, lentamente, diluída em nove volumes de Tris-HCl 20 mM, NaCl 250, ureia 0,5 M, 10% de glicerol, pH 7,4, e redobrado no prazo de 72 horas a 4 ° C. hMcl-1 (171-327) foi purificado utilizando uma resina de afinidade com Talon (Clontech) aplicado a uma coluna HiTrap SP Alto Desempenho (GE Healthcare). O rendimento final de Purificou

L

–

13C,

proteínas 15N ( 98% homogéneo por SDS-PAGE; 20,3 kDa por espectrometria de massa MALDI-TOF) ~ 25 mg /L. Além disso, um

U Restaurant –

15N e 5% biossinteticamente dirigido fractionally

amostra marcado com 13C [21] foi gerado para a atribuição específica do aparelho de som de grupos metílicos isopropílico. as amostras de RMN foram preparadas a uma concentração de proteína de 0,7 mM. Um tempo de rotação geral isotrópico correlação de ~ 10 ns foi inferida a partir

vezes 15N rodada de relaxamento indicando que hMcl-1 (171-327) é monomérica em solução.

espectroscopia de RMN

NMR Os espectros foram registados a 25 ° C. Cinco G-matriz de Fourier transformam experiências (GFT) RMN [22], [23] e uma simultânea 3D

15 N /

13 C

alifático /

13 C

NOESY aromático resolvido [24] [25], espectro (tempo de mistura de 60 ms, o tempo de medição: 48 horas) foram adquiridos em um Varian INOVA espectrômetro de 750 MHz equipado com uma sonda convencional. 2D em tempo constante [

13 C,

1H] espectros -HSQC (18 horas) foram registados para a 5% biossinteticamente dirigido fractionally

amostra marcado com 13C em um Varian INOVA espectrômetro de 600 MHz equipado com uma sonda criogênica como foi descrito [21], [26]. Os espectros foram processados ​​e analisados ​​utilizando os programas NMRPipe [27] e XEASY [28].

backbone específico Sequence (H

N, H

α, N, C

α) e H

β /C

beta atribuições de ressonância foram obtidas usando (4,3) D HNNC

αβC

α (63 horas) /(4,3) DC

αβC

α (CO) NHN (62 horas) e (4,3) DH

αβC

αβ (CO) NHN (69 horas) [23] junto com o programa AutoAssign [29]. deslocamentos químicos cadeia lateral mais periféricos foram atribuídos com alifáticos (4,3) D CODIP (87 horas) [23] e 3D

15 N /

13 C

alifático /

13 C

aromático resolvido [

1H,

1H] -NOESY [24], [25]. No geral, as atribuições foram obtidos por 96% do backbone e

1H

β /

13 C

beta ressonâncias e por 93% das ressonâncias de cadeias laterais que possam ser cedidas com as experiências de RMN listados acima (excluindo o N-terminal NH

3

+, Pro

15N,

13C ‘anterior resíduos prolil, Lys NH

3

+, Arg NH

2, OH, cadeia lateral

13 C ‘e aromática 13C

γ). Além disso, 100% /100% de Val e Leu porções isopropilo com não degeneradas desvios químicos de protões foram estereo-especificamente atribuído (Tabela 1). Os desvios químicos foram depositados na BioMagResBank [30] (código adesão 19654).

1H-

1H distância superior restrições limite para cálculos de estrutura foram obtidos a partir NOESY (Tabela 1). Além disso, a coluna vertebral constrangimentos ângulo diedro foram derivadas dos desvios químicos utilizando o programa TALOS [31] para os resíduos localizados nos elementos da estrutura secundária bem definidas (Tabela 1). O programas cyana [32], [33] e AUTOSTRUCTURE [34] foram usadas em paralelo para atribuir NOEs de longo alcance [24]. Os cálculos de estrutura finais foram realizadas utilizando cyana seguido de banho de refinamento de água explícito usando o programa CNS [35].

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Janet Cheetham para a sugestão valiosa para considerar o mutante C286S de hMcl-1 (171-327) para a determinação da estrutura de RMN.