Abstract
Fundo
As recentes notícias sobre
Propionibacterium acnes
(
P. acnes
) sugerem que esta bactéria é prevalente na próstata, está associada à inflamação da próstata aguda e crónica, e pode ter um papel na carcinogênese de próstata.
Métodos
para avaliar o papel patogênico desta bactéria indígena, nós analisamos para a bactéria em amostras de prostatectomia radical utilizando imuno-histoquímica da enzima com um romance
P. acnes
anticorpo monoclonal espec�ico (anticorpo PAL), em conjunto com um anticorpo do factor-kappa anti-B nuclear (NF-kB). Examinamos formalina-fixo e cortes de tecido embebidos em parafina de prostatectomia radical espécimes de 28 pacientes com câncer de próstata e 18 pacientes controle pareados por idade com cancro da bexiga, mas sem câncer de próstata.
Resultados
a imuno-histoquímica com o anticorpo PAL revelou pequenos corpos redondos dentro de alguns não-cancerosas epitélio e estroma macrófagos glandulares na maioria das amostras da próstata. amostras de câncer de próstata tiveram freqüências mais altas de qualquer citoplasmática
P. acnes
ou expressão de NF-kB nuclear do epitélio glandular e um maior número de macrófagos estromais com
P. acnes
do que as amostras de controlo. Estes parâmetros também foram mais elevados na zona periférica do que na zona de transição da próstata, especialmente em amostras de cancro da próstata. expressão nuclear NF-kB foi mais frequente em glândulas com
P. acnes
do que nas glândulas sem
P. acnes
. O número de macrófagos estromais com a bactéria correlacionada com o grau de inflamação crônica em áreas tanto o PZ e TZ e com o grau de inflamação aguda na área de TZ.
Conclusões
A análise imunohistoquímica com um romance anticorpo monoclonal para a detecção de
P. acnes
na próstata sugeriu que intraepitelial
P. acnes
infecção nas glândulas prostáticas não-cancerosas e inflamação causada pela bactéria podem contribuir para o desenvolvimento de cancro da próstata
citação:. Bae Y, Ito T, T Iida, Uchida K, Sekine H, Nakajima Y, et al. (2014) intracelular
Propionibacterium acnes
Infecção em glandular epitélio e estroma macrófagos da próstata com ou sem câncer. PLoS ONE 9 (2): e90324. doi: 10.1371 /journal.pone.0090324
editor: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, Estados Unidos da América
Recebido: 13 de dezembro, 2013; Aceito: 29 de janeiro de 2014; Publicação: 28 de fevereiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Bae et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência Grant-in-Aid para a Investigação científica 24659402 (YE). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata é o segundo câncer mais comum em homens em todo o mundo, com uma estimativa de 900.000 casos e 258.000 mortes em 2008 [1]. Enquanto vários factores de risco para o cancro da próstata tenham sido identificados, tais como a origem étnica, idade, história familiar, e dieta [2], a etiologia exacta do cancro da próstata permanece desconhecida. Muitos estudos recentes fornecem evidências de que a inflamação crônica é um fator importante que contribui para a carcinogénese da próstata, causando danos ao DNA, promovendo a renovação celular, e criando um microambiente tecido que aumenta a replicação celular, migração e angiogênese [3], [4].
na resposta inflamatória, os factores de transcrição tais como o factor nuclear-kappaB (NF-kB) são activadas por ligação de receptores de reconhecimento de padrões (Toll-like receptors, oligomerização do domínio de ligação ao nucleótido [NOD] -like receptores, e outros ), receptores de citoquinas pró-inflamatórias (factor de necrose tumoral-α ou interleucina [IL] -1), e receptores de antigénio [5] – [8]. Apesar de NF-kB não se encaixa na definição clássica de um oncogene, que é um poderoso activador do estado maligno e regula a expressão de genes alvo importantes para a proliferação celular, sobrevivência, angiogénese, e a reparação de tecidos [8] – [12].
a exposição a fatores ambientais, tais como agentes infecciosos, substâncias cancerígenas alimentares e desequilíbrios hormonais, é pensado para levar à lesão da próstata e o desenvolvimento da inflamação crônica [3]. Relatórios recentes mostraram que
Propionibacterium acnes
(
P. acnes
) é frequentemente detectada em tecido da próstata de pacientes com cancro da próstata e prostatite, e que a bactéria está associada com a inflamação aguda e crónica da próstata e pode ter um papel na carcinogênese da próstata [13] – [21]
P.. acnes
é, um bacilo anaeróbio Gram-positivo, não-formadoras de esporos encontrada predominantemente nas áreas ricas em glândulas sebáceas da pele em adultos [22]. A bactéria nativa também é isolado a partir da conjuntiva, boca e intestino [23]. Historicamente,
P. acnes
foi pensado para ser de baixa virulência, mas foi encontrado recentemente para ser o agente causador de várias patologias.
P. acnes
é principalmente implicados na acne vulgar [24], mas a bactéria também pode ser associado com um número de condições inflamatórias, tais como endocardite, conjunta e infecções do sistema nervoso central, e sarcoidose [25] – [28].
Nós relatado anteriormente que muitos (71%) sorotipo I isolados clínicos de
P. acnes
invadir células epiteliais [29], e intra-epitelial
P. acnes
infecção activa NF-kB tanto um NOD1- e modo dependente da NOD2 [30]. Apesar acumulando evidências de
P. acnes
infecção na próstata em cultura ou polimerase métodos de reação em cadeia bacterianas, há poucos relatos em que a bactéria foi localizada nos tecidos da próstata por nos métodos de imunofluorescência situ com um anticorpo policlonal para
P. acnes
[31] ou de fluorescência multicolor em métodos de hibridização in situ visando
P. acnes
23S [14].
Para investigar mais a associação etiológica entre o
P. acnes
e inflamação ou carcinogênese, não só a bactéria, mas também a histologia do tecido da próstata precisam ser analisadas em cortes histológicos idênticos. O objetivo do presente estudo foi localizar
P. acnes
no tecido da próstata em microscopia de luz por imuno-histoquímica da enzima. Para este fim, desenvolvemos um romance anti-
P. acnes
anticorpo monoclonal que reage com as bactérias em secções fixadas em formalina e tecido de próstata embebidos em parafina. Para avaliar o papel patogênico desta bactéria indígena no desenvolvimento do câncer de próstata, que examinaram amostras de prostatectomia radical obtidas de pacientes com ou sem cancro da próstata por imuno-histoquímica com o romance anticorpo para
P. acnes
e um anticorpo para o NF-kB, o qual foi utilizado para determinar uma possível correlação entre
P. acnes
infecção e expressão NF-kB nuclear nas glândulas da próstata. Além disso, analisamos se
P. acnes
estado de infecção foi associada com o risco de câncer de próstata.
declaração de Ética Materiais e Métodos
Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Tokyo Medical and Dental University (Registo No. 1373). Porque o estudo envolveu imunocoramento clinicamente obtidos e arquivados fixados em formalina e embebidos em parafina amostra de tecido, o comité de ética aprovado dispensa do consentimento informado específico de acordo com as Diretrizes Éticas para Estudos Clínicos (emenda 31 de julho de 2008) pelo Ministério da Saúde, do Trabalho e Bem-Estar do Japão. O protocolo experimental animal utilizado neste estudo foi aprovado pelo Centro de Experimental animal de Tokyo Medical and Dental University (Registo No. 0120203A) e foi realizado de acordo com as diretrizes do centro acima.
Amostras
Foram examinados cortes de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina de amostras de prostatectomia radical de 28 pacientes (idade: 50-78 anos) com cancro da próstata que foram operados entre 2008 e 2011 no Hospital Tokyo Medical and Dental University, e a partir de 18 pacientes do grupo controle (idade: 50-80 anos) com cancro da bexiga, mas sem câncer de próstata, que foram submetidos a cirurgia entre 1994 e 2011 no mesmo hospital. Os doentes que receberam tratamento pré-operatório foram excluídos do estudo. Os perfis clinicopatológicas dos casos são mostrados na Tabela 1. Os blocos de tecido embebidos em parafina foram seleccionados a partir de blocos preparados para exame patológico de rotina. Uma seção horizontal corte da próstata incluindo o verumontanum foi identificado em cada caso, e as amostras foram incluídos no estudo quando o câncer se espalhou limitou-se à direita ou à esquerda do lobo na seção. Um dos lobos direito e esquerdo em uma secção livre de câncer foram analisados para examinar a distribuição de
P.
acnes e a activação intra-epitelial de NF-kB em tecido não canceroso, e o outro lóbulo foi analisado para detectar
P. acnes
no tecido canceroso.
Produção de anticorpo monoclonal
Um novo anticorpo monoclonal foi desenvolvido para localizar
P. acnes
nas secções fixadas em formol e dos tecidos da próstata embebido em parafina. O anticorpo foi gerado de acordo com o protocolo descrito em A Laboratory Manual [32], com modificações. ratinhos BALB /c (CLEA Japan, Tóquio, Japão) foram imunizadas com lisado bacteriano sonicado total de serotipo I
P. acnes
isolado de próstata humana em um estudo anterior [29]. linhas celulares de hibridoma que produzem anti-
P. anticorpos acnes
foram verificadas por ensaio imunossorvente ligado a enzima com os antigénios bacterianos utilizados como imunogénios. linhas celulares de hibridoma com resultados positivos foram rastreados por imunocoloração com cortes de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina de
P. acnes
fígado de rato -injected.
P. acnes
injectados fígado de rato foi obtido por injecção intravenosa de 30 mg de morta pelo calor
P. acnes
em ratos Sprague-Dawley do sexo feminino (CLEA Japan) 1 h antes de matar o rato. secções de tecido de fígado preparados de modo semelhante de ratos injectados por cada estirpe de outras bactérias de controlo também foram examinados para confirmar a especificidade para
P. acnes
. linhas celulares de hibridoma que produz o anticorpo que se gerou uma forte reacção específico para
P. acnes
em secções de fígado de rato foram seleccionados e adicionalmente rastreados por imunocoloração com secções de tecido da próstata e embebidos em parafina do espécime removido por prostatectomia fixado em formalina, em que um grande número de
P. acnes
foram cultivadas no estudo anterior [29]. O hibridoma que produz o anticorpo que gerou o produto de reacção mais específica desprovido de qualquer reactividade cruzada para os tecidos da próstata humana, incluindo os pigmentos de lipofuscina, foi seleccionado e clonado por dois ciclos de diluio limitante. Um único clone de hibridoma foi em seguida implantado no espaço intraperitoneal de ratinhos com imunodeficiência combinada grave (CLEA Japan). Em 1 ou 2 semanas após a implantação, a ascite foi recolhido e utilizado como um anticorpo não diluído sem purificação adicional. O anticorpo foi chamado PAL.
A especificidade do anticorpo PAL foi analisada por Western Blot de acordo com o método anteriormente descrito [26] com o serotipo I
P. acnes
estirpe (ATCC 6919 e ATCC 11827), o sorotipo II
P. acnes
estirpe (ATCC 11828), 19 isolados clínicos de
P. acnes
(10 amostras do sorotipo I e 9 amostras do sorotipo II) a partir de próstatas [29], outro Propionibacteria cutânea (
P. granuloso
ATCC 25564,
P. avidum
, ATCC 25577, e
P. lymphophilum
ATCC 27520), e outras bactérias de controle (
Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli
,
Bacteroides flagilis
, e
Enterrococcus faecalis
).
Imuno-histoquímica
cortes histológicos (3 mm de espessura) foram cortadas a partir de amostras fixadas em formalina e tecido embebido em parafina e montadas em lâminas com revestimento de silano (Muto Pure Chemicals , Tóquio, Japão). Depois de as secções foram de-parafinado e re-hidratadas, elas foram microondas (Processador de microondas H2850, a energia do feixe Ciências, East Granby, CT) durante 40 min a 97 ° C, em 10 mmol /L de tampão citrato (pH 6,0). As secções foram então tratadas com peróxido de hidrogénio a 3% em metanol durante 10 min. As secções foram primeiro incubadas com soro normal de cavalo (Vectastain ABC Elite Kit Universal; Vector Laboratories, Burlingame, CA) e em seguida incubadas durante a noite à temperatura ambiente com anticorpo apropriadamente diluído PAL (1:60000) ou anticorpo anti-NF-kB (1 :2000, EPITOMICS, Burlingame, CA), ou uma mistura destes dois anticorpos para o cocktail imunocoloração, numa câmara humidificada. As secções foram então incubadas durante 30 minutos com anticorpo secundário biotinilado, seguido por 30 min de incubação com o complexo (kit ABC Vectastain Elite Universal) estreptavidina-peroxidase, tanto à temperatura ambiente. Antes e depois de cada passo, as secções foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato contendo 0,5% de Tween-20. O sinal foi desenvolvido como um produto de reacção castanho usando peroxidase de substrato de diaminobenzidina (DAB HistofineSimplestain Solução; Nichirei Bioscience Inc., Tóquio, Japão). Todas as amostras foram contrastadas com hematoxilina de Mayer. seções adjacentes também foram examinados com hematoxilina e eosina para exame histopatológico convencional.
Para a identificação simultânea de citoplasmática
P. acnes
e expressão nuclear de NF-kB na mesma secção de tecido da próstata, cocktail de imunocoloração com uma mistura de anticorpo PAL e anticorpo anti-NF-kB como o anticorpo primário foi realizada em todas as amostras. Para assegurar a confiabilidade desse método, dois cortes seriados de amostras idênticas foram examinadas por imunocoloração cocktail e imunoenzimático double-coloração, respectivamente. Para o imunoenzimático double-coloração, cortes reagiram primeiro com anticorpo PAL usando o método-avidina-biotina complexo com o Kit Vectastain ABC-AP (AK-5000, VETOR) eo vetor azul alcalino fosfatase Substrato Kit III (SK-5300, VETOR ), e, em seguida, incubadas durante 5 minutos em solução desnaturante (desnaturação kit de solução, BRR001DH, Biocare Médico) e ainda incubadas durante 5 min em Dako solução real peroxidase-bloqueio (S2023, Dako, Glostrup, Dinamarca). Após estes procedimentos, as secções foram submetidas a reacção secundária com o anticorpo anti-NF-kB, seguido por imuno-histoquímica utilizando um método de polímero com EnVision + System-HRP etiquetado Polímero (K4001, Dako) e HistofineSimplestain DAB Solution.
A mesma as amostras utilizadas para imunoenzimático dupla coloração também foram analisados por imunofluorescência dupla coloração para o fenótipo das células com intracelular
P. acnes
utilizando anticorpos para as células epiteliais e fagócitos; anti-citoqueratina anticorpo monoclonal (AE1 /AE3, Dako) para as células epiteliais, anticorpo humano anti-CD68 monoclonal (clone KP1; Dako) para os macrófagos, ou anticorpo monoclonal fascina anti-humano (clone 55K-2; Dako) para as células dendríticas, de acordo com os métodos descritos anteriormente [33]
.
para confirmar que o anticorpo PAL não reagem de forma cruzada com pigmentos de lipofuscina que são frequentemente encontrados nas glândulas prostáticas, imunofluorescência com ou sem o anticorpo PAL foi comparada usando série secções de tecido da próstata e coloração imunoenzimático com o anticorpo PAL foi seguido por coloração Fontana-Masson ou a observação de fluorescência microscópica de secções de tecido da próstata idênticos.
Avaliação da imuno-histoquímica e histológicos
para avaliar
P. acnes
infecção e expressão nuclear de NF-kB em secções histológicas idênticas, as imagens ao microscópio óptico das secções imunocoradas com uma mistura de anticorpo PAL e anticorpo anti-NF-kB (cocktail imunocoloração) foram incorporadas em slides virtuais com MIRAX MIDI BF /FL digitador para 12 Slides (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemanha) e examiná-los ao Pannoramic Visualizador 1.15 Service pack 2 (3DHISTECH, Budapeste, Hungria). análises morfométricas de todas as glândulas da próstata incluídos nas seções foi realizada sob visão de alta potência dos slides virtuais. Cada glândula prostática foi considerado
P. acnes
-positivo quando os sinais positivos citoplasmáticos por anticorpo PAL foram observadas em pelo menos uma das células epiteliais da glândula. Como para a expressão de NF-kB nuclear, a glândula foi considerado positivo quando os sinais de núcleo-positivas foram observadas em pelo menos uma célula epitelial. Citoplasmática expressão de NF-kB não foi considerado positivo porque activada de NF-kB transloca desde o citoplasma para o núcleo [34], [35]. De acordo com a presença ou ausência de citoplasmática
P. acnes
e expressão NF-kB nuclear para cada glândula, todas as glândulas da próstata (número total de glândulas por seção variando 933-5519 com um número médio de 2358) localizadas nas áreas de zona periférica (PZ) ou zona de transição ( TZ) foram divididas em quatro grupos (
P acnes
/NF-kB:.. + /+, +/- – /+ e – /-), e glândulas categorizados a cada grupo foram marcados por uma cor diferente nos slides virtuais. De acordo com os resultados obtidos pela classificação de quatro-grupo, a frequência de detecção de glândulas com qualquer citoplasmática
P. acnes
ou expressão nuclear de NF-kB foi calculado para cada caso no PZ e áreas TZ, respectivamente. Todas as células estromais da próstata com sinais citoplasmáticos pelo anticorpo PAL foram contadas no PZ e áreas TZ, respectivamente, sobre as secções de deslizamento virtuais que foram imunocoradas com apenas anticorpo PAL. Para avaliar o grau de inflamação aguda e crónica, seções adjacentes foram examinados com hematoxilina e eosina e classificado em quatro categorias (0, 1+, 2+ e 3+) de acordo com os critérios utilizados por Cohen et al. [13].
Análise estatística
A frequência (%) de
P.acnes
glândulas -positivas ou glândulas NF-kB-positivos nucleares foi calculado como o número de glândulas positivos dividido pelo número total de glândulas para cada paciente; eo número de
P. acnes
macrófagos -positivas foi contado para cada paciente. Estes parâmetros foram resumidos como mediana [th 25
e 75
th percentis] para cada PZ e área de TZ e comparados entre amostras de controlo e de câncer de próstata utilizando um teste de Mann-Whitney. Os parâmetros em cada amostra de controlo e câncer de próstata também foram comparadas entre o PZ e áreas TZ utilizando o teste-rank chamuscado Wilcoxon. A associação entre esses parâmetros e grau de inflamação aguda ou crônica foi analisada por meio do coeficiente de correlação de Spearman. O grau de inflamação aguda ou crónica também foi comparado entre as amostras de controlo e de cancro da próstata, utilizando um teste de Mann-Whitney. A frequência de expressão NF-kB nuclear em glândulas com
P. acnes Comprar e glândulas sem
P. acnes
foi calculada para cada paciente, resumidos como mediana [th 25
e 75
th percentis], e comparadas pelo teste-rank chamuscado Wilcoxon na PZ e áreas TZ de amostras de câncer de controlo e de próstata. coeficiente de correlação de Spearman para avaliar a correlação entre a frequência de
P.acnes
-positivas glândulas eo número de
P. acnes
macrófagos estromais -positivas. As análises foram realizadas para as áreas PZ e TZ, respectivamente.
p
-Valores foram ajustadas para comparações múltiplas pelo método de Holm, quando apropriado. Um
p -valor
de menos de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. software StatView (versão 5.0; SAS Institute, Cary, NC). foi utilizado para todos os cálculos estatísticos
Resultados
Especificidade do anticorpo monoclonal
O anticorpo PAL reagiu com todas as amostras do sorotipo I
P. acnes Comprar e não reagiram com nenhum amostras do sorotipo II
P. acnes
, outra Propionibacteria cutânea, ou outras bactérias de controle. O anticorpo reconheceu um
P. acnes
epitopo espec�ico do ácido lipoteic�co comumente compartilhado por todas as amostras do sorotipo I
P. acnes
.
Localização de
P. acnes em
próstata
Nos glândulas prostáticas não-cancerosas, o anticorpo PAL reagiu com corpos redondos pequenos nas células epiteliais (Figura 1). Os pequenos corpos redondos foram observadas em hiperplásico, normal, e as células epiteliais atróficas, mas mais frequentemente em células epiteliais hiperplásicas (Figura 2A-B) do que nas células normais ou atrófica (Figura 2C-D). No estroma prostático, pequenos corpos redondos PAL-positivos também foram detectados em macrófagos-like, que foram distribuídos esparsamente em clusters no estroma. Estas células pareciam na densidade relativamente elevada perto das glândulas atróficas, acompanhada por células inflamatórias mononucleares (Figura 2E-F). Em alguns focos de inflamação periglandular grave, células PAL-positivo tipo macrófagos infiltrados nas glândulas e foram detectadas algumas vezes nos espaços luminais.
O anticorpo reagiu com corpos redondos pequenos (setas) em alguns epitelial glandular não cancerosos células.
os sinais positivos pelo anticorpo foram mais frequentes em glândulas com hiperplasia epitelial (a, B) do que nas glândulas normais ou atróficas (C, D). No estroma prostático, os sinais positivos foram encontrados em células de tipo macrófagos acompanhados por células inflamatórias mononucleares (E, F). Alguns sinais positivos foram raramente encontrados em algumas células cancerosas (G, H). Maior ampliação da área indicada pela seta está representada na inserção de cada figura.
imunofluorescência dupla coloração confirmou que todos os sinais de glandulares detectados pelo anticorpo foram PAL no citoplasma das células epiteliais coradas com anticorpo anti-citoqueratina (AE1 /AE3) e todos os sinais do estroma detectados pelo anticorpo PAL foram em macrófagos corados com anticorpo anti-CD68, mas não com anticorpo anti-fascina (Figura 3A-C). pigmentos de lipofuscina foram observadas em algumas glândulas prostáticas com intracelular
P. acnes
. Esses pigmentos de lipofuscina foram coradas marrom escuro com Fontana-Masson e produziu forte auto-fluorescência, e o anticorpo PAL fez não reagem de forma cruzada com esses pigmentos de lipofuscina (Figura 3D-J).
imunofluorescência dupla coloração do
P. acnes
células -positivos em tecidos da próstata (A-C). sinal verde (FITC): anticorpo PAL; sinais vermelhos (TRITC): anticorpo anti-citoqueratina (A), anticorpo anti-CD68 (B), e anticorpo anti-fascina (C). Resultados de dupla-coloração são mescladas em todas as imagens. Nas glândulas da próstata, todo
P. acnes
sinais -positivas sobrepostas (amarelo) com células epiteliais glandulares citoqueratina-positivo (A). No estroma da próstata, todo
P. acnes
sinais -positivas sobrepostas (amarelo) com os macrófagos CD68-positivas (B) e não se sobrepõem a todos (verde) com células dendríticas fascina-positivo (C). A imunocoloração com o anticorpo PAL seguido de Fontana-Masson (D). A maioria dos sinais positivos vermelhas por anticorpo PAL (setas) nas glândulas da próstata não se sobrepõem com os pigmentos de lipofuscina (setas), que são marrom escuro com coloração Fontana-Masson. coloração imunoenzimático de tecido da próstata com ou sem anticorpo PAL utilizando secções de tecido da próstata de série (E, F). Muitos sinais intracelulares castanho-escuros (setas) foram observados na secção com o anticorpo PAL (E) mas não há tais sinais foram observados na secção sem o anticorpo (M). Idêntico parte da glândula prostática, com ou sem sinais imunorreactivos pelo método de enzima observada por luz e microscopia de fluorescência (G-J). Na parte de uma glândula prostática com muitos sinais positivos de anticorpos (setas) (G), pouco lipofuscina auto-fluorescência (ponta de seta) foi observada na região idêntica (H). Em contraste, na parte de uma glândula prostática sem sinais positivos de anticorpo (I), um maior nível de lipofuscina auto-fluorescência (pontas de seta) foi observada na região idêntica (J).
também confirmou que os resultados de detecção de citoplasmática
P. acnes
e expressão nuclear de NF-kB em células epiteliais glandulares da próstata eram quase o mesmo entre a imunoenzimático dupla coloração e a imunocoloração cocktail que foram utilizados para a análise das lâminas virtuais (Figura 4). avaliação simultânea de
P. acnes
e estado NF-kB em seções idênticas de cocktail imunocoloração revelou uma distribuição panorâmica das glândulas categorizados em quatro grupos nos slides virtuais (Figura 5).
Na mancha dupla (coluna da esquerda), os sinais positivos detectados pelo anticorpo Pal (setas) e os sinais nucleares positivos por NF-kB anti-anticorpo (pontas de seta) foram visualizadas por cores azul e castanho, respectivamente. Na coloração cocktail (coluna da direita), ambos os sinais positivos foram visualizados pela cor marrom. glândulas representativos que foram categorizados em cada um dos quatro grupos de acordo com o estado da intraepitelial
P. acnes
infecção e expressão nuclear de NF-kB são mostrados em cada linha. Os resultados destes parâmetros foram o quase mesmo entre imunoenzimático double-coloração e cocktail imunocoloração. . NNF-kB: nuclear NF-kB
Esquerda, amostra de câncer de próstata (A); direita, amostra de controlo (B). círculos vermelhos, glândulas com ambos
P. acnes
e expressão NF-kB nuclear; círculos amarelos, glândulas com
P. acnes
mas nenhuma expressão de NF-kB nuclear; círculos azuis, glândulas com nuclear expressão NF-kB mas nenhum
P. acnes
; e círculos brancos, glândulas com nenhum
P. acnes
nem expressão NF-kB nuclear. linhas pretas indicam a fronteira entre a zona periférica (PZ) e zona de transição (TZ). Número total de glândulas examinadas pelo analisador slide virtual 1894 na amostra (A) a partir de um paciente com câncer de próstata e 1.465 na amostra (B) de um paciente com câncer de bexiga, mas não câncer de próstata. Note-se que mais círculos vermelhos e amarelos foram observadas na área de PZ da amostra de cancro da próstata em comparação com ambos os PZ e TZ áreas da amostra de controlo, bem como a área do TZ da amostra de cancro da próstata.
células cancerosas da próstata, na maioria dos casos foram negativos para o anticorpo PAL, com três casos excepcionais (Figura 2G-H). A área de ocupação de glândulas cancerígenas com
P. acnes
infecção em toda a área da lesão do cancro na secção foi de 5% no caso de uma e menos do que 1% nos outros dois casos. macrófagos estromais PAL-positivas foram detectadas em 13 (46%) de 28 tecidos de câncer.
frequência de detecção de
P. acnes em
próstata
Intraepithelial
P. acnes
das glândulas prostáticas cancerosas não foi detectada em todas as amostras, e macrófagos do estroma com a bactéria foram observadas em 27 dos 28 amostras de cancro e 14 de 18 amostras de controlo.
A mediana [25
th e 75 frequência
th percentis] (%) das glândulas da próstata com intraepitelial
P. acnes
foi de 14,4 [8,8, 28,0] na área de PZ e 4,9 [2,4, 9.1] na área de TZ de amostras de câncer (Figura 6A). Em amostras de controlo, a frequência foi de 4,3 [1.3, 8.1] na área de PZ e 1,6 [1.1, 3.2] na área de TZ. A frequência foi significativamente maior em amostras de cancro do que em amostras de controlo em ambas as áreas TZ PZ e. Em ambas as amostras de câncer e de controlo, a frequência foi significativamente maior na área do PZ que na área do TZ.
Frequência (%) de
P. acnes
glândulas -positivas (A) ou glândulas NF-kB-positivos nucleares (B), e o número total de
P. acnes
macrófagos estromais -positivas (C) nas zonas periféricas e transitórias de câncer de próstata (PCA) e amostras de controlo.
P
-Valores foram ajustadas para comparações múltiplas (4 comparações em cada painel) pelo método de Holm. NS:. Não significativa
O número médio de macrófagos estromais com
P. acnes
foi de 30 [10, 82] na área de PZ e 12 [3,35] na área do TZ de amostras de cancro, enquanto que o número médio foi de 2 [0, 32] e 5 [0, 7] no controle amostras, respectivamente (Figura 6c). O número de macrófagos do estroma foi significativamente superior nas amostras cancerosas do que nas amostras de controlo, tanto no PZ e áreas TZ. Em amostras de cancro, o qual foi significativamente superior na área da PZ que na área do TZ. Os números de
P. acnes
macrófagos estromais -positivas correlacionadas com as frequências de
P. acnes
glândulas -positivas na área do PZ de amostras de cancro (coeficiente de correlação de Spearman = 0,47,
p
= 0,015).
frequência de detecção do nuclear NF-kB expressão
expressão nuclear de NF-kB de células epiteliais glandulares foi detectada em todas as amostras. Nas amostras de cancro, a frequência média (%) das glândulas NF-kB-positivos foi de 17,1 [10,3, 31,4] na área de PZ e 7,1 [2,8, 14,8] na área do TZ (Figura 6B). Em amostras de controlo, a frequência foi de 7,3 [4,4, 11,1] na área de PZ e 4,4 [2.1, 11.3] na área de TZ. Na área de PZ, a frequência era significativamente mais elevada em amostras de cancro do que em amostras de controlo. Em amostras de câncer, a freqüência foi significativamente maior na área do PZ que na área do TZ.
Correlação entre
P. acnes
infecção e nuclear NF-kB expressão
Em amostras de câncer, a frequência mediana (%) de expressão NF-kB nuclear das glândulas com
P. acnes
foi de 27,6 [18,3, 47,5] na área de PZ e 14,0 [5.8, 25.6] na área de TZ, enquanto frequência mediana das glândulas com a expressão de NF-kB nuclear, mas sem
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foi de 15,9 [9,0, 27,2] na área de PZ e 6,7 [2,7, 13,7] na área do TZ (Figura 7A). Em amostras de controlo, a frequência no
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glândulas -positivas foi de 17,8 [8,9, 24,8] na área de PZ e 13,0 [1.3, 36.1] na área de TZ, enquanto que a frequência no
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glândulas -negativas foi de 7,2 [4,1, 10,9] PZ em área e 4,1 [2,0, 10,7] na área do TZ (Figura 7B). As frequências de expressão NF-kB nuclear foram significativamente maiores no
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glândulas -positivas do que em
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glândulas -negative no PZ e áreas TZ de ambas as amostras e controlo do cancro.
Frequência (%) de expressão NF-kB nuclear nas glândulas com ou sem citoplasmática
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nas zonas periféricas ou de transição de câncer de próstata (A) e controlar amostras da próstata (B).
P
-Valores foram ajustadas para comparações múltiplas (2 comparações em cada painel) pelo método de Holm.
Correlação entre a inflamação e
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estado de infecção ou a activação de NF-kB
grau de inflamação aguda ou crónica na PZ ou áreas TZ das amostras de cancro e de controlo é mostrado na Figura 8. Em ambas PZ e áreas TZ, o grau da inflamação não diferiram significativamente entre as amostras e controlo do cancro. O grau de inflamação aguda ou crónica não se correlacionou com tanto a frequência de glândulas com citoplasmática
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ou frequência de glândulas com expressão de NF-kB nuclear.