Abstract

glioblastomas pediátricos (pGBM), embora raros, são uma das principais causas de Câncer mortes relacionadas em crianças, com tumores essencialmente refratários aos tratamentos existentes. Aqui, descrevemos o uso do convencional e avançada

in vivo

ressonância magnética (MRI) técnicas para avaliar um xenoenxerto ortotópico rato pGBM novel (IC-3752GBM cultura derivados de paciente) modelo e para monitorar os efeitos da o agente anti-cancro OKN-007 como um inibidor de crescimento de tumor pGBM. A imuno-histoquímica de suporte de dados é também apresentada para a proliferação celular e o crescimento do tumor de sinalização. OKN-007 foi encontrada para reduzir significativamente os volumes dos tumores (

P

0,05) e aumentar a sobrevivência dos animais (

P

0,05) em todos os ratinhos tratados com OKN-007 em comparação com animais não tratados . Num coorte responsiva de animais tratados, OKN-007 foi capaz de reduzir significativamente os volumes dos tumores (p 0,0001), aumentar a sobrevivência (p 0,001), e aumentar a difusão (

P

0,01) e as taxas de perfusão (

p Art 0,05). OKN-007 de tumor metabolismo lipídico também significativamente reduzida nos animais responsivos [(Lip1.3 e Lip0.9) rácio -para-creatina (

P

0,05)], bem como diminuem significativamente a proliferação de células tumorais (

p Art 0,05) e densidade de microvasos (

p Art 0,05). Além disso, em relação à via PDGFRα, OKN-007 foi capaz de diminuir significativamente SULF2 (

P

0,05) e PDGFR-

α

(receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas

-α

) (

p Art 0,05) imunoexpressão, e aumentar significativamente a expressão decorim (

p Art 0,05) em ratinhos responsivos. Este estudo indica que OKN-007 pode ser um agente anti-cancro eficaz para alguns pacientes com pGBMs por inibição da proliferação celular e na angiogénese, possivelmente através do PDGFR

α

via, e pode ser considerada como uma terapia adicional para pediátrica pacientes com tumores cerebrais

Citation:. Coutinho de Souza P, Mallory S, Smith N, Saunders D, Li XN, McNall-Knapp RY, et al. (2015) Inibição da Pediatric Glioblastoma Tumor Crescimento pelo Anti-Cancer Agente OKN-007 em camundongo ortotópico xenoenxertos. PLoS ONE 10 (8): e0134276. doi: 10.1371 /journal.pone.0134276

editor: Marta M. Alonso, Hospital Universitário de Navarra, Espanha

Recebido: 06 de março de 2015; Aceito: 08 de julho de 2015; Publicação: 06 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Coutinho de Souza et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (GM103639 P20, KMF) https://nih.gov/, Universidade do Estado de Oklahoma (AE-1-50060; PCS) http : //go.okstate.edu/, Musella Foundation (No. número; RAT) https://www.virtualtrials.com/musella.cfm e Infância Brain Tumor Foundation (No. número; RAT) http: //www .childhoodbraintumor.org /Tablet

competir interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

gliomas de alto grau (HGG) representam um dos mais comum. sistema nervoso central (SNC) de tumores entre os adultos. Isto contrasta significativamente para a população pediátrica, onde HGGs compõem apenas cerca de 8-12% de todos os tumores primários do sistema nervoso central [1]. Estes tumores são classificados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como qualquer grau III ou IV, o que significa que eles são tumores altamente malignas com elementos característicos, tais como hipercelularidade, atipia nuclear, e elevada actividade mitótica com ou sem proliferação microvascular e necrose [2]. Os HGGs pediátricos mais comuns incluem astrocitoma anaplásico (OMS grau III) e glioblastoma (GBM; WHO grau IV). glioblastoma Pediátrica (pGBM) é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em crianças [3] com uma sobrevivência média em pacientes de 11 meses [4]. Apesar das melhorias em neurocirurgia, radioterapia e quimioterapia, o resultado para crianças com HGG pediátrica continua pobre [5]. Sem regimes de quimioterapia eficazes têm sido identificadas por qualquer HGG pediátrica ainda [5]. pouca eficácia Além disso, novos agentes molecularmente direcionados têm demonstrado em ensaios clínicos de fase precoce [6-8], destacando a necessidade de novas abordagens de tratamento.

Da mesma forma, a melhoria da

in vitro

e

também é necessário in vivo

modelos para HGGs pediátricos. linhas celulares de tumores e em modelos animais derivadas de tumores do SNC são ferramentas essenciais para estudar a biologia da doença, para compreender os mecanismos da resistência à terapia, e para levar a cabo testes de pré-clínico terapêutico. Há abundante informação sobre modelos animais de adulto HGG [9-11], incluindo ratos geneticamente modificados quimicamente induzidas, e modelos de xenoenxerto [9]. No entanto, até à data apenas alguns modelos GBM pediátricos foram estabelecidos e /ou caracterizada [12-14]

Temos demonstrado que o agente anti-câncer OKN-007 (Oklahoma nitrona-007;. Dissódico 4- [(terc-butil-imino) metil] benzeno-1,3-dissulfonato de N-óxido ou disufenton) é muito eficaz contra gliomas em modelos pré-clínicos adultos [11,15,16], e é actualmente em fase de ensaio clínico de avaliação como um nova droga experimental para glioblastomas adultos recorrentes. OKN-007 é uma molécula pequena que pode atravessar a barreira sangue-cérebro e tem propriedades anti-inflamatória, anti-oxidante, e as propriedades pró-apoptóticos [17,18]. Em um modelo de glioma de rato F98 ortotópico e um modelo de xenoenxerto de U87 humano em ratos atímicos, OKN-007 aumentou significativamente a sobrevida de ratos não tratados tratado versus [16]. Os volumes dos tumores em ambos estes modelos foram significativamente menores no tratado, em comparação com animais não tratados com base em imagiologia por ressonância magnética (MRI) de avaliação [16]. A imuno-histoquímica (IHC) avaliação de marcadores de tumor frequentemente estudados para a proliferação ou diferenciação celular, hipoxia, angiogénese, e apoptose indicou que OKN-007 foi capaz de reduzir significativamente a proliferação celular (transportador de glicose 1 (Glut-1) e o marcador de proliferação celular, MIB -1), mas não diferenciação celular (carbonato de anidrase IX), diminuir a angiogénese (a densidade microvascular (MVD; medidos como os níveis do marcador endotelial, CD-31), mas não é o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF)), diminui a hipoxia (hipoxia factor de indutível 1 α (HIF-1α)), e aumentar a apoptose (caspase 3) em comparação com controlos não tratados [16]. diminuições OKN-007-induzida em Glut-1 e os níveis de HIF-1α parecia ser semelhante em ambos os modelos F98 e U87 de glioma, enquanto aumento da apoptose parecia ser mais elevada nos gliomas F98 em comparação com os tumores U87 [16]. Concluiu-se que OKN-007 tem a capacidade de causar regressão do glioma em modelos de tumores de roedores agressivos (F98 e U87), bem como em gliomas moderadas (C6) [11,15,16]. Suporte para o efeito anti-cancro de OKN-007 através da via de TGF-p1, foi recentemente relatado por Zheng

et ai. (2013), onde se descobriu que OKN-007 medeia o seu efeito anti-tumoral em células de carcinoma hepatocelular (Huh7), através da supressão de TGF-p1 /Smad2 e Hedgehog sinalização /GLI1 por inibição da actividade enzimática de sulfatase 2 (SULF2) [19].

PDGFR

α

é o alvo mais frequente de amplificação focal em HGGs pediátricos [20-23]. mutações somáticas de PDGFR

α

foram também relatados recentemente na HGGs pediátricos [22-24]. Sabe-se também que a expressão do gene SULF2 está correlacionada com PDGFR

α

expressão [25]. Da mesma forma para SULF2, decorina também está associada à via PDGFRα [26]. Desde que foi demonstrado que OKN-007 pode afetar a atividade SULF2, pensamos que talvez este agente pode ser eficaz contra HGGs pediátricos.

A RM tem sido utilizado em pré-clínico [12] e clínica [27-32] estudos para diagnosticar e prever os resultados de terapia para GBMs pediátricos. As técnicas mais comumente usadas incluem

in vivo

1H espectroscopia de ressonância magnética (

1H-MRS) [33-35], imagem ponderada em difusão (DWI) [36], e arterial rotulagem de spin perfusão (ASL) [37].

1H-MRS foi usado em ambientes de pesquisa e clínicos para medir os níveis de metabolitos no cérebro, e está bem adaptado para realizar o diagnóstico, caracterização e avaliação da resposta do tumor ao tratamento [38]. DWI pode qualitativa e quantitativamente avaliar o movimento molecular com base na organização das microestruturas dos tecidos ao caracterizar a mobilidade de água [39], e pode fornecer uma avaliação mais completa de informação celular e metabólica sobre o câncer de cérebro humano [40]. ASL permite a avaliação de medir o fluxo sanguíneo do tumor [41], que auxilia na caracterização do grau do tumor [37] e resposta à terapia do câncer [42].

Aqui nós descrevemos a caracterização de ressonância magnética de um romance de xenotransplante ortotópico modelo do rato HGG pediátrica (cultura primária IC-3752GBM derivado paciente) e os efeitos da OKN-007 para inibir

in vivo

pediátrica glioblastoma crescimento IC-3752GBM tumor usando (imagiologia morfológica) convencional e técnicas avançadas de RM (

1H-MRS, DWI, e ASL). coloração imuno-histoquímica foi também utilizado para avaliar os níveis de proteínas relacionadas com o tumor e para avaliar a proliferação de células tumorais. Para o melhor de nosso conhecimento, o presente estudo é o primeiro relatório da RM caracterização de um modelo murino de xenotransplante ortotópico de pGBM, e a avaliação do agente anti-câncer, OKN-007, num modelo pGBM.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os experimentos deste estudo foram realizadas seguindo um protocolo humano aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) no Baylor College of Medicine, bem como um protocolo de animais aprovado pelo Comitê Institucional de animal Care and Use (IACUC) da Baylor College of Medicine e do IACUC da Oklahoma Medical Research Foundation. Para amostras de tecido humano, o consentimento informado assinado foi obtido de todos os pacientes ou seus responsáveis ​​legais antes de provar aquisição.

amostras de tumor cerebral

Uma amostra frescos de tumor (3752GBM), a partir de um de 5 anos feminino -old que foram submetidos a craniotomia no Hospital de Crianças do Texas, foi obtido em um laboratório criostato com o consentimento assinado na sequência de um protocolo Institutional Review Board-aprovado (H-4844). diagnóstico patológico final foi consistente com glioblastoma pediátrica (pGBM) [43]. A amostra de tumor foi diretamente implantado no córtex cerebral direito de ratos imunodeficientes (Baylor College of Medicine IACUC # AN-4548). células tumorais xenoenxerto colhidas de camundongos doadores foram passados ​​em ratinhos nus através de seis implantações subsequentes como descrito anteriormente [43,44].

modelo de tumor cerebral do rato intracraniana

A cultura glioblastoma pediátrica passadas IC- 3752GBM foi implantado por via intracerebral em ratinhos nus atímicos (n = 24) (OMRF protocolos IACUC # # 13-51 e 13-53). As cabeças de ratos anestesiados foram imobilizados (unidade estereotáxico; Kopf Instruments, Tujunga, CA), e com técnicas assépticas, um orifício de trepanação 1 mm foi perfurado no mm anterior crânio 1 e 2 mm lateral ao bregma no lado esquerdo ou direito . Uma seringa Hamilton de 20 ul à prova de gás foi utilizada para injectar 5-10 × 10

6 células IC-3752GBM /mL suspenso em 4 mL de meio de cultura de células com 1,0% de agarose para a direita ou para a esquerda do lobo frontal, a uma profundidade de 1,5 mm em relação à superfície da dura-máter em uma unidade estereotáxico. Analgesia (Buprenex, injeção i.p.) foi utilizado após o procedimento de implante de células para alívio da dor durante a recuperação. As linhas de células foram mantidas e expandido imediatamente antes da inoculação. Após a injecção, a pele foi fechada com suturas cirúrgicas. Os animais foram divididos em dois grupos: OKN-007-tratado (n = 12) e não tratados (n = 12) grupos. Ambos os grupos foram estratificadas para assegurar que os tamanhos do tumor foram semelhantes antes do início do tratamento no grupo tratado. A cultura primária de IC-3752GBM não foi passado mais do que seis vezes em ratos.

OKN-007 tratamento

OKN-007 (Ryss Laboratories, Union City, CA) foi administrado aos ratos em sua água de beber numa concentração de 150 mg /kg /dia (0.20% w /v para um ratinho de 20 g). O tratamento foi iniciado quando os volumes dos tumores estavam entre 10 e 15 mm

3, e foi administrado continuamente até ao final do estudo. Os ratinhos que receberam água de beber normal foram usadas como controlos não tratados. A quantidade de OKN-007 consumida por cada rato, que foram alojados em gaiolas separadas, foi determinado por pesagem de garrafas de água a cada dia. Sem desvio significativo foi observado no volume de absorção de líquido do composto nestes ratinhos. O consumo médio de OKN-007 era de aproximadamente 130-150 mg /kg /dia para todos os ratinhos. Durante todo o estudo, a resposta terapêutica para OKN-007 foi avaliado como seja responsivo (OKN-007-R) ou não-responsivos (OKN-007-NR). A mortalidade foi registrada diariamente durante o período de estudo para calcular a porcentagem de sobrevivência de todos os animais. Todos os animais foram humanamente eutanasiados (CO

2 asfixia) quando eles se encontraram critérios carga tumoral (tumores ≥ 150 milímetros

3) e /ou mostrou sinais de doença, perda de peso, condição corporal pobre, porfiria, hipoatividade, agitação, agressividade, ataxia, respiração superficial e rápida e /ou trabalharam, caquexia, incapacidade de responder a estímulos, a falta de curiosidade, vocalização, convulsões, postura curvada e pêlo arrepiou). Os animais foram monitorados duas vezes por dia.

técnicas de ressonância magnética

imagiologia morfológica.

foram anestesiados e posicionados em um berço estereotáxica camundongos nus. A 30 cm horizontal magneto Bruker Biospin operando a 7 Tesla (T; Bruker BioSpin GmbH, Karlsruhe, Alemanha), foi utilizado com um gradiente S116 definido para executar todas as experiências MRI. Um EPI (imagiologia planar eco) transceptor

bobina 1H 50W com um diâmetro interno 38,0 mm foi utilizada para transmissão de sinal e detecção. Multiple-slice, múltiplos echo (MPME) imagem (FOV = 2.50 x 2.50 cm

2, TR = 2000 ms, TE = 17,5 ou 58,2 ms, a matriz = 192, média = 2, fatias = 16, espessura do corte = 1 mm) foi utilizada para calcular os volumes dos tumores e para inspeccionar a morfologia do tumor. rotação multi slice eco t

1 ponderadas imagens (TR = 1000.0 ms, TE = 14 ms, FOV = 2,50 × 2,50 cm

2, médias = 2, fatias = 16, tamanho de matriz = 256 × 256) foram também se apresentou e adquiridas antes e 15 minutos após a injeção intravenosa de contraste (Gd-DTPA, Magnevist, Bayer Inc., Wayne, Nova Iorque, EUA; 0,4 mmol /kg).

1H-MR espectroscopia.

1H-MRS foi adquirido usando uma prensa (Ponto resolvidos espectroscopia) sequência com um TE de 24,0 ms, a TR de 2500,0 ms, 512 médias, e uma largura espectral de 4006 Hz. Um espectro MR não-suprimida foi adquirida previamente, aplicando correção de correntes de Foucault para maximizar a intensidade do sinal e diminuir os linewidths de pico. A água foi suprimida com um vapor (pulsos de frequência de rádio de potência variável e atrasos de relaxamento Optimized) esquema de supressão. Em todos os casos, a largura do pico (largura total a metade do valor máximo) do pico da água era inferior a 30 Hz seguinte calços localizada, que foi conduzido usando primeira e segunda ordem com ajustes Fastmap. Um voxel cúbico de 2,0 x 2,0 x 2,0 milímetros

3 foi posicionado tanto no tumor ou do tecido cerebral normal contralateral, enquanto maximiza a quantidade de tecido de tumor presente no voxel em todos os momentos.

Para analisar os dados da MRS, um programa Mathematica in-house foi usada (versão 6.0, Wolfram Research, Champaign, IL, EUA). Os espectros foram escalados em ppm calibrando contra o pico de água (4,78 ppm). Os picos principais metabólicos cérebro foram identificados como: N-acetilaspartato (NAA) a 2,02 ppm, colina (Cho) a 3,22 ppm, creatina (Cr) a 3,02 ppm, e os lípidos celulares em 1,3 ppm (Lip1.3) para o grupo metileno (-CH

2-) e 0,9 ppm (Lip0.9) para o grupo metilo (-CH

3) no tecido do tumor. As medidas dos metabólitos da área de pico foram utilizados para calcular os seguintes índices: NAA tumor para tumor Cho (NAA

t /Cho

t), tumor Cho para contralateral (tecido normal) Cre (Cho

t /Cre

n), tumor Cho para tumor NAA (Cho

t /NAA

t), Lip0.9 tumor para Cre contralateral (Lip0.9

t /Cre

n), e Lip1.3 tumor para Cre contralateral (Lip1.3

t /Cre

n).

imagem ponderada em difusão.

Uma sequência DWI multi-slice axial coronal cobrindo o tumor inteiro foi realizada usando uma sequência de eco planar à base de imagiologia de pulso com os seguintes parâmetros: TR = 4000 ms, TE = 51,1 ms, o tamanho da matriz = 128 × 128, espessura de corte = 1 milímetro, duração gradiente de difusão = 4 ms, separação por gradiente de difusão = 14 ms. Cinco imagens foram obtidas com diferentes escalamentos gradiente, resultando em valores de B-100, 200, 500, 700, e 850 s /mm

-2. ADC mapas foram gerados por todas as fatias em que foi observada no tumor. O coeficiente de difusão aparente valores (ADC) foram obtidos por desenhar uma única ROI mão livre ao longo da fronteira do tumor normalizados para o cerebral normal contralateral.

Arterial-rotulagem de spin perfusão. Mapas

perfusão foram obtidos num único corte axial do cérebro localizada no ponto do eixo rostro-caudal, onde o tumor tinha a maior secção transversal. A geometria de imageamento foi um 25,6 × 25,6 milímetros

2 campo de visão (FOV) de 2 mm de espessura, com um único tiro de codificação de eco-planar sobre uma matriz de 64 × 64. Foram utilizados um tempo de eco (TE) de 13,5 ms, um tempo de repetição (TR) de 18 s, e um tempo de inversão (TIR) ​​de 26,0 ms, e as imagens não foram submetidos a média do tempo. Para obter o contraste de perfusão, foi utilizado o esquema de recuperação de inversão do fluxo alternado. Resumidamente, as imagens de recuperação de inversão foram adquiridos utilizando uma inversão fatia selectivo da mesma geometria que a fatia de imagem ou uma fatia concêntrico inversão não selectivo com a fatia de imagem com uma margem de pacote de fatia de 5,0 mm. Para cada tipo de inversão, 22 imagens foram adquiridas com tempos de inversão uniformemente espaçados de 26,0 ms para 8,426.0 ms (com um incremento de 400 ms entre cada TIR). valores CBV (fluxo sanguíneo cerebral) foram obtidos pelo desenho de um único ROI mão livre ao longo da fronteira do tumor normalizado ao normal do cérebro contralateral obter valores normalizados relativos CBF (FSCr). valores CBF ASL negativo foram assumidos como zero [45].

macroscópicas e microscópicas histologia

necropsias foram realizadas em todos os ratos. A extensão do tumor na necropsia foi avaliada por exame macroscópico e microscópico do cérebro para cada animal dos grupos não tratados e OKN-007-tratados. Os tecidos cerebrais foram fixados em formalina a 10% tamponada com fosfato, embebidos em parafina, seccionados a 4 mm, e foram coradas com hematoxilina-eosina (H E). para exame histológico

A imuno-histoquímica

imuno coloração foi realizada utilizando um imunohistoquímica automatizado (Leica, bond-III, Leica, Buffalo Grove, IL) com os seguintes anticorpos policlonais primários: alfa do receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas (

α

PDGFR) (diluição 1: 1000 , policlonal de coelho, ab61219 clone, Abcam), decorim (diluição 1: 500, policlonal de coelho, LS-B clone 8177/45156), LSBIO vida útil Biosciences), heparan sulfato sulfatase SULF2 (diluição 1: 100, policlonal de coelho, AV49338 clone, Sigma Aldrich), e CD31 (diluição 1:25, policlonal de coelho, ab28364 clone, Abcam, Ki-67 (diluição 1: 100, policlonal de coelho, o clone PA5-19462, Thermo Fisher Scientific, IL). Todos os anticorpos foram inicialmente optimizados em tecidos de controle e controles positivos e negativos foram processados ​​em paralelo com as secções de tecido.

IHC Scoring

Todos os IHCS foram analisados ​​utilizando o Sistema de Análise Aperio ScanScope imagem (Aperio, Vista, CA). PDGFR

α

, SULF2 e IHCS decorim foram analisados ​​usando um algoritmo de contagem de pixels positiva com o espectador Aperio ImageScope. Apenas as áreas contendo tecido tumoral foram analisadas para a expressão IHC. Áreas sem tecido tumoral e áreas com necrose ou significativas artefatos (por exemplo dobráveis ​​tecido) foram desmarcados e excluídos da análise. O número de pixels positivos a partir de regiões-de-interesse (ROI) com expressão elevada foram divididos pelo número total de pixels (positivos e negativos) na zona analisada, e multiplicado por 100, para derivar a percentagem de pixels positivos.

densidade microvascular (MVD, o número de vasos por mm

2) e área média Vessel (MVA, Vascular área /2 + lúmen área), usando CD31 como um marcador, foram determinadas usando um algoritmo de análise de microvasos Aperio. Três representante não-sobreposição regiões de interesse (ROI) para amostras tumorais foram selecionados aleatoriamente, eo MVD e MVA foram quantificadas para cada animal de ambos os grupos não tratados e OKN-007-tratados.

Uma Análise de Imagem Aperio ScanScope sistema também foi usado para determinar o Ki-67 o índice de marcação (LI Ki-67). Três ROIs com o maior número de núcleos marcados foram identificados em cada caso. Ki-67 LI foi determinada por contagem de 1000 células e expressando-a como o número de células marcadas por 1000 células [46] para cada animal a partir de ambos os grupos não tratados e OKN-007-tratados. células marcadas adjacentes ou dentro de áreas de necrose também foram excluídos, enquanto contando o Ki-67 LI. As médias e desvios padrão de Ki-67 LI foram determinados para cada grupo.

Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando Graph Pad Prism 6 (GraphPad Prism 6 Software, San Diego, CA, EUA). Todas

p valores Restaurant 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os volumes dos tumores, índices de comprimento metabólito pico [(NAA

t /Cho

t), (Cho

t /Cre

n), (Cho

t /NAA

t), (Lip0.9

t /Cre

n), e (Lip1.3

t /Cre

n)], ADC normalizada, FSCr, Ki-67 LI, e imunoexpressão de PDGFR

α

, SULF2 e decorina foram relatados como média ± desvio padrão. Para a análise estatística, testes t Student (-amostras independentes, bicaudal t-teste) foram utilizados para avaliar as diferenças entre as médias dos ratos glioma normais, não tratados, e OKN-007 tratados pediátricos IC-3752GBM. Kaplan-Meier curvas de sobrevida e uma Log-rank (Mantel-Cox) de teste foram usados ​​para comparar os tempos de sobrevivência entre os grupos tratados não tratados e OKN-007.

Resultados

macroscópica, histológica, características imuno-histoquímica e RM do romance ortotópico xenotransplante glioblastoma pediátrica (pGBM) modelo IC-3752GBM e os efeitos da OKN-007 para inibir o crescimento do tumor cultura IC-3752GBM foram descritas neste relatório.

características

brutas e microscópicas de o modelo IC-pGBM 3752GBM são apresentados na Figura 1A-1E. Macroscopicamente os tumores foram caracterizados como um cinza amarelado, mal massa demarcada, com áreas multifocais de necrose e hemorragia. O exame histológico revelou mal demarcada, neoplasia infiltrativa não encapsulado com atipia acentuada celular, alto índice mitótico, e áreas multifocais de necrose e hemorragia.

tecido IC3752 pGBM

(AB) fixados em formalina, caracterizado como um cinzento amarelado e mal demarcada em massa , com áreas multifocais de necrose e hemorragia. (CE) exame histológico revelou mal demarcada, não encapsulados e neoplasias invasivas (E) caracterizadas por atipia acentuada celular, um alto índice mitótico (setas pretas) (C), e áreas multifocais de necrose (asteriscos) e hemorragia (sinal) ( D). T = Tumor, B = cérebro normal. Barra de escala = 200 um (C-D). Barra de escala = 400 mm (E).

sobrevivência dos animais foi avaliada comparando animais-007 tratados com OKN com animais não tratados (Fig 2). Em geral, OKN-007 foi encontrado para aumentar significativamente a sobrevivência dos animais (p 0,0223) (sobrevivência média de 25,5 dias) comparativamente com os murganhos portadores de tumores não tratados (sobrevivência média de 19,5 dias). O total de dados de sobrevivência tratados OKN-007 parecia retratam duas coortes resposta ao tratamento. Por exemplo, verificou-se que seis animais responderam ao tratamento OKN-007 e demonstraram tempos de sobrevivência significativamente mais longos (

p

= 0,0002) (sobrevivência média de 33 dias) quando comparados com os animais não tratados (n = 12) . Por outro lado, seis outros ratos pGBM não parecem responder à terapia OKN-007, e não mostrou diferença estatística (

p

= 0,3392) quando comparado com o grupo não tratado. Os ratinhos tratados com OKN-007 não responsiva parecia ter uma média de sobrevivência (19 dias) que foi semelhante para a média de sobrevivência para os ratinhos portadores de tumores não tratados.

Houve um aumento significativo na percentagem de sobrevivência para todos os ratos tratados com OKN-007 (n = 12) (

P

0,05) em comparação com ratinhos não tratados portadores de tumor (n = 12). Com base nas diferentes coortes de resposta, o grupo OKN-007-tratamento foi dividido em OKN-007-R (sensível) e OKN-007-NR (não-responsivos) coortes. ratinhos OKN-007-R (n = 6) demonstrou tempos de sobrevivência significativamente mais longos (

P

0,001) quando comparados com animais UT (n = 12). Por outro lado, camundongos OKN-007-NR (n = 6), não houve diferença estatística (

p Art 0,05) quando comparado ao grupo UT

Para calcular todo o tumor. volume de alguns animais, imagens MPME T

1-ponderados foram realizados e adquiridos antes (Fig 3A) e 15 min depois (Fig 3B) a injeção do meio de contraste intravenoso (Gd-DTPA, Magnevist, Bayer Inc., Wayne, Nova Iorque, EUA). Fig 3E mostra a média volumes tumorais IC-3752GBM quantitativos calculados a partir de imagens de RM. O grupo total OKN-007-tratamento foi encontrada para diminuir significativamente os volumes dos tumores (p = 0,0289) em comparação com ratos não tratados (Fig 3E). Com base nos dados de sobrevivência indicaram que respondem e que não respondem coortes de tratamento OKN-007, o volume do tumor também foi separada em termos de resposta ao tratamento. Seis animais foram encontrados para responder ao tratamento OKN-007 [OKN-007- (R)] e demonstrou tumores significativamente menores (

P

0,001) (Figura 3D), quando comparado com animais não tratados (n = 12 ) (Fig 3C). Também verificou-se que seis ratos pGBM encontrada para não responder [OKN-007- (NR)] para a terapia OKN-007 (com base de dados de sobrevivência animal), apresentaram diferença estatística (

p

= 0,7857), quando em comparação com o grupo não tratado.

imagens morfológicas ponderadas em T1 representativos antes (a) e depois de agente de contraste (Gd-DTPA) de injecção (B) em ratinhos pGBM de rolamento são mostrados. (A) Antes da administração de contraste do tumor apareceu como uma massa levemente hiperintenso e era difícil para demarcar-lo. (B) Quinze minutos após a injeção de contraste do IC3752 pGBM demonstra realce, delinear o tumor (amarelo linha tracejada). As imagens de RM ponderadas em T2 representativos da UT (C) e OKN-007 (D) tratados IC 3752 cérebro do rato pGBM-bearing. (E) O histograma quantitativa de todos os ratos mostra que todos os ratinhos tratados com OKN-007 (N = 12) tinham uma redução significativa do volume do tumor (p 0,05) em comparação com ratinhos UT (n = 12). Seis animais responderam ao tratamento OKN-007 [OKN-007 (R)] e demonstrou tumores significativamente menores (

p Art 0,0001) quando comparado com os animais UT (n = 12). No entanto, seis outros ratos pGBM não parecem responder [OKN-007 (NR)] para a terapia OKN-007, e não houve diferença estatística entre o grupo OKN-007 (NR) UT e. Os valores são representados como média ± SD. comparações entre os grupos: (1) UT vs. OKN-007 (total); (2) vs UT OKN-007 (R); e (3) OKN-007 (R) vs OKN-007 (NR).

Para todas as outras investigações, grupos OKN-007- (R) e tratamento OKN-007- (NR) foram em comparação com ratos portadores de tumores não tratados, como nem todos os ratos foram submetidos a avaliações

1H-MRS, DWI, imagens de perfusão ou IHC.

valores 1H-MRS foram obtidos em ratinhos nus atímicos normais (n = 7), e não tratados (n = 6) e OKN-007-tratado (n = 8) ratinhos portadores de gliomas IC-3752GBM. Figura 4 mostra as regiões onde o único voxel 8 milímetros

3 para

1H-MR espectroscopia foi colocada nos cérebros de ratinhos normais (Figura 4A) e ratinhos portadores de gliomas IC-3752GBM (Fig 4B). Fig 4C mostra que os ratos IC-3752GBM pGBM não tratada demonstrou significativamente menor NAA

t /Cho

t (

p

= 0,0001) e maior Cho

t /Cre

n (

p

= 0,0325), Cho

t /NAA

t (

p

= 0,0075), Lip0.9

t /Cre

n (

p

= 0,0363) e

t /Cre

rácios Lip1.3 n (

p

= 0,0009) quando comparado com o cérebro de camundongos atímicos normal. O Lip1.3

t /Cre

n (

p

= 0,0395), Lip0.9

t /Cre

n (

p

= 0,0257) , Cho

t /NAA

t (

p

= 0,0167) e Cho

t /Cre

n (

p

= 0,0254) rácios foram significativamente menor no grupo OKN-007- (R) do que pGBM não tratada na fase final da progressão do tumor. O grupo OKN-007- (R) mostrou uma NAA significativamente maior

t /Cho

t (

p

= 0,0492) rácio do que o pGBM não tratada. Não houve diferença significativa entre o Cho

t /Cre

n (

p

= 0,498), NAA

t /Cho

t (p = 0,6912), Cho

t /NAA

t (

p

= 0,4231) e Lip0.9

t /Cre

n (

p

= 0.6205) rácios do ratinho normal cerebral em comparação com o grupo OKN-007- (R). O grupo OKN-007- (R) mostrou uma Lip1.3 significativamente maior

t /Cre

n (

p

= 0,0047) rácio do que o normal do cérebro do rato. Não houve diferença significativa entre o NAA

t /Cho

t (

p

= 0,2071), Cho

t /Cre

n (p = 0,7101), Cho

t /NAA

t (

p

= 0,5362), Lip0.9

t /Cre

n (

p

= 0,7277) e Lip1.3

t /Cre

n (

p

= 0.5163) rácios do grupo não tratado em comparação com o 007- OKN-grupo (NR).

locais representativos do 2 x 2 x 2 voxels mm3 usado para executar 1H-MRS em cérebro de ratinho normal (a) e ratos portadores de tumor IC3752 pGBM (B). (C) Os ratos IC3752 pGBM não tratados demonstraram um significativamente menor proporção NASC /Chot e superiores (p

= 0,0325), Chot /NASC, Lip0.9t /CREN e Lip1.3t /CREN rácios Chot /CREN quando em comparação com cérebros de ratos atímicos normais. O Lip1.3t /cren, Lip0.9 t /cren, os rácios chot /NASC, e Chot /CREN foram significativamente menores no grupo OKN-007- (R) quando comparado com pGBM não tratada na fase final de progressão tumoral. O grupo OKN-007- (R) mostrou uma proporção significativamente mais elevada naat /Chot do que o pGBM não tratada. Não houve diferença significativa entre a Chot /cren, naat /Chot, Chot /naat, e rácios Lip0.9t /cren para os cérebros normais de ratinho em comparação com o grupo OKN-007- (R). O grupo OKN-007- (R) mostrou uma proporção significativamente maior Lip1.3t /cren do que o normal do cérebro do rato. Não houve diferença significativa entre o NASC /Chot, Chot /cren, Chot /NASC, Lip0.9t /cren e rácios Lip1.3t /CREN para o não tratado em comparação com os grupos OKN-007- (NR). Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas (*

P

0,05; *** p 0,01; *** p 0,001; **** p 0,0001). comparações entre os grupos: (1) Normal vs. UT; (2) vs UT OKN-007 (R); (3) OKN-007 (R) vs OKN-007 (NR); (4) Normal vs. OKN-007 (R); (5) vs UT OKN-007 (NR); e (6) Normal vs. OKN-007 (NR).

Em nosso estudo, com o uso de DWI, o grupo não tratado mostrou significativamente maior (

p

= 0,0060) (± 1,161 0,04538, n = 11) ADC valores normalizados nas regiões de tumor quando comparados com os ratos cérebros normais (1.003 ± 0.009358, n = 6) (Figura 5A-5G). O grupo tratado OKN-007-R tinham valores ADC significativamente maior normalizadas (1,296 ± 0,04141, n = 7) em comparação com o grupo não tratado (p = 0,0432) ou os cérebros normais (ratos

P

= 0,0003).