Abstract

macrófagos fator estimulante de colônias (MCSF) regula o crescimento, proliferação e diferenciação de células hematopoiéticas linhagens. Muitos cancros são conhecidas por segregar elevado nível de MCSF, que recrutam macrófagos para o micro-ambiente do tumor, suportando o crescimento do tumor. Relata-se a clonagem de MCSF e geração subseqüente de U87MG expressar linha de células estável MCSF (U87-MCSF). A citotoxicidade de drogas anti-cancro 5-fluorouracilo (5-FU) foi avaliado em ambas as células U87MG e U87-MCSF. Curiosamente, a proliferação de células U87-mCSF foi inferior (P 0,001) do que a de células U87MG por si só, após o tratamento com 5-FU. diminuição significativa nos níveis de expressão de ciclina E e A2 quantificados por análise de PCR em tempo real corroborado a proliferação reduzida de 5-FU tratada células U87-MCSF. No entanto, JC-1 coloração não revelou qualquer apoptose após tratamento com 5-FU. Notch-1 upregulation induziu uma possível transição epitelial-mesenquimal em células U87-MCSF, o que representou um aumento na proporção de CD24

/CD44

menos células de alta-tronco cancerosas em células U87-MCSF após 5-FU tratamento . A elevada resistência das células U87-MCSF no sentido de 5-FU foi devido ao aumento nas expressões (10,2 e 6 vezes) de ABCB1 e MDM2, respectivamente. Além disso, o aumento da expressão de ABCG1, MDM2 e CD24 foi também observada em células de U87MG após incubação prolongada com 5-FU. Nossos estudos nos insights mecanicistas em resistência a drogas de células U87MG e também descreveu o papel central desempenhado pela MCSF em aumentar a resistência das células U87MG a 5-FU

Citation:. Chockalingam S, Ghosh SS (2013) Melhorar células-tronco cancerosas em macrófagos factor estimulador de colónias expressando U87MG-Human Glioblastoma sobre Therapy 5-fluorouracil. PLoS ONE 8 (12): e83877. doi: 10.1371 /journal.pone.0083877

editor: Rajesh Agarwal, da Universidade do Colorado em Denver, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de setembro, 2013; Aceito: 08 de novembro de 2013; Publicação: 31 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chockalingam, Ghosh. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Subvencionado pelo Departamento de Biotecnologia No. BT /49 /NE /TBP /2010 e BT /01 /NE /PS /08. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

macrófago factor estimulador de colónias (MCSF), também referido como factor estimulante de colónias-1 (CSF-1), é um factor de crescimento responsáveis ​​pela sobrevivência, proliferação e diferenciação de células de linhagens hematopoiéticas [1]. Fora do sistema hematopoiético, MCSF tem um papel importante no desenvolvimento e regulação de placenta, glândula mamária, cérebro e fisiologia do osso [2] – [4]. MCSF é codificada por um único gene, no entanto, através de splicing alternativo de ARNm e a modificação pós-traducional diferencial, três formas diferentes de MCSF, tais como, uma glicoproteína segregada, um proteoglicano segregada e uma membrana ligada isoforma curta são encontrados [1]. MCSF actua através de um receptor de tipo de tirosina-cinase III, um receptor do factor estimulante de colónias (CSF1R), que é o produto de c-fms proto-oncogene.

MCSF é conhecido por se infiltrar locais de lesão e inflamação com fagócitos mononucleares . mutação homozigótica nula de CSF-1 em ratos mostra uma população de macrófagos empobrecido no cancro da mama, resultando em malignidade reduzida e metástase [5]. A presença de monócitos e macrófagos promove a angiogénese e metástases de tumores em, aumentando o nível de secreção de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). MCSF actua como um regulador da transcrição para produção de VEGF [6]. No entanto, MCSF tem um potencial papel na indução de resposta anti-tumoral. Os monócitos e macrófagos foram relatados para matar as células cancerosas por paraptosis, com sobre-expressão de forma membranar de MCSF [7], [8]. A adição de MCSF purificado para as células cancerosas do ovário humano tem sido documentada para induzir a inibição do crescimento dependente da concentração in vitro [9]. Assim, os relatórios que demonstram actividades anti-tumorais de MCSF lado-a-lado com os relatórios alternativos que mostram as propriedades pró-tumorais de MCSF executado.

Neste estudo, nós elucidaram o papel desempenhado pela MCSF no aumento da propriedades resistivas droga de linha de células de glioblastoma humano, U87MG. Encontramos também o mecanismo de resistência 5-FU em células U87MG. Os resultados ilustraram que a expressão de Notch-1 foi aumentada em células U87-MCSF não tratados, o que levou a transição epitelial-mesenquimal. Um aumento na CD24

/CD44

células de alta baixos câncer estaminais e regulação positiva das principais genes transportadores ABC (ABCG1 e ABCB1) transmitiu resistência ao 5-FU em células U87-MCSF. Nossos dados fornece evidência para o fenótipo resistente a medicamentos emergente através da formação de células-tronco cancerosas em MCSF expressar glioblastoma.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

ACHN, carcinoma renal humano e U87MG, linhas de células de glioblastoma humanas obtidas a partir de National Center for Cell Science, Pune foram mantidas em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (50 U /ml) -Streptomycin (50 mg /ml) a 5% de CO

2 numa incubadora humidificada a 37 ° C.

isolamento de ARN e RT-PCR

ARN a partir de células de mamíferos em cultura foi isolado usando o kit de GenElute total de isolamento de ARN de mamífero ( Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total (1 ug) foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de síntese de cDNA (Fermentas). A amplificação da expressão do gene foi realizada com primers específicos respectivo gene (Tabela S1 em S1 arquivo).

Western blot

As células cultivadas a 70-80% de confluência foram lisadas por tampão RIPA contendo PMSF 1 mM . As proteínas totais nos lisados ​​celulares foi quantificado pelo método de estimativa de proteína usando BSA como padrão de Lowry. SDS-PAGE foi feito o carregamento igual quantidade de proteína em cada poço. As amostras foram transferidas para membrana de PVDF e detectadas utilizando anticorpos para β-actina (BD Transduction Laboratories) e MCSF (Sigma). As manchas foram desenvolvidos utilizando peroxidase quimioluminescente substrato-1 kit (Sigma) e fotografada usando o sistema de documentação de gel (ChemiDoc XRS + sistema de imagem imager Molecular, Bio-Rad).

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi Na medida utilizando kit de ensaio de toxicologia in vitro, base de XTT (Sigma). As células cultivadas em microplacas de 96 poços a uma densidade de 1,5 x 10

3 células por poço foram deixadas a crescer durante a noite e, em seguida, tratado com várias concentrações de 5-FU para intervalos de tempo diferentes. XTT (hidróxido de 2, 3-bis [2-Metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -2H-tetrazólio-5-carboxyanilide sal interno) ensaio foi realizado no final do período de tratamento utilizando o protocolo do fabricante. O produto de formazan laranja solúvel foi medida utilizando leitor multiplacas (Tecan, Infinito M200) a 450 nm e a medição de fundo a 690 nm. A viabilidade celular (%) foi calculada em relação às células não tratadas viáveis ​​100%.

MCSF Localização estudo

Resumidamente, as células foram lavadas com PBS e fixadas com solução de paraformaldeído a 3,7% (com ou sem 0,1% Triton X-100) a 37 ° C durante 30 min. Após lavagem com PBS três vezes, as células foram bloqueadas com BSA a solução de bloqueio a 1% durante 30 min. Em seguida, as células foram incubadas com anticorpo anti-MCSF (Sigma) primário e subsequentemente com FITC etiquetado o anticorpo secundário (BD Transduction Laboratories). Após a coloração com FITC etiquetado o anticorpo secundário, as células foram incubadas com meio contendo 300 nM de DAPI durante 3 min, finalmente, lavadas e visualizadas ao microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse t

i

-U, Japão) com um filtro de excitação de 480 /15 nm (para FITC) e 360/20 nm (para DAPI).

Trypan corante azul de exclusão ensaio

células em seis placa de foram tratados com 5-FU para 120 h. Após o tratamento, as células foram colhidas, misturado com igual volume de 0,4% de azul de tripano (Invitrogen) e carregado sobre uma câmara de contagem. As células saudáveis ​​e viáveis ​​com membrana intacta excluídos do corante, enquanto que as células comprometidas coradas com o corante e foram contados como mortos. A percentagem (%) de viabilidade celular foi calculada usando contador de células automatizado Condessa-(Invitrogen).

CFSE ensaio de proliferação de células

As células (1 x 10

6 células /ml) em PBS contendo BSA a 0,1% foram incubadas com 10 uL de 0,5 mM de CFDA-sE a 37 ° C durante 10 min e, em seguida, lavada com 5 volumes de meio arrefecido com gelo para extinguir qualquer corante livre. As células foram recolhidas por centrifugação e lavadas duas vezes com meio fresco. As células coradas foram analisadas imediatamente por citometria de fluxo (tempo zero) e o resto das células foram semeadas por períodos de tempo subsequentes. Os dados adquiridos foram analisados ​​em Cell Quest Software Pro. O tempo de duplicação foi calculada de acordo com a fórmula T

d = T /log

2 (F

0 /F

T), em que F

0 é a intensidade de fluorescência média geométrica a 0 h e M

T é a intensidade de fluorescência média geométrica em T h [10]. Nas nossas experiências T foi de 72 h.

análise do ciclo celular

As células foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 5 x 10

4 células por poço. Após fixação durante a noite, as células foram tratadas com diferentes concentrações de 5-FU. No final das células período de tratamento foram tripsinizadas, lavadas e fixadas com uma solução de álcool a 70% durante 15 min em gelo. As células fixadas foram coradas com uma solução de iodeto de propídio (PI) a coloração (50 ug /ml de PI, 0,1 mg /ml de RNase A e 0,05% de Triton X-100) a 37 ° C durante 30 min no escuro. Pelo menos, 10000 eventos por amostra foram adquiridos pelo citómetro de fluxo e a percentagem de células distribuída em diferentes fases do ciclo celular foi calculada com o software ModFit LT.

Análise de CD24 /CD44 por citometria de fluxo

Células após o tratamento foram dissociadas por tripsinizao, lavadas duas vezes com PBS e incubadas com 10% de soro humano durante 20 min em gelo para bloquear os receptores Fc. FITC de murganho anti-humano CD24 e CD44 PE de murganho anti-humano (ambos da BD Pharmingen) foram adicionados anticorpos e incubou-se durante 20 minutos em gelo no escuro. As células foram lavadas duas vezes com PBS, finalmente, ressuspensas em PBS e analisadas por um citómetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences, NJ).

Análise

A expressão de genes por PCR em tempo real

quantitativa PCR em tempo real foi realizada utilizando SYBR Green como corante repórter (Power SYBR Green PCR Master mix, Biosystem Aplicada) e 7500 em tempo real sistema de PCR (Applied Biosystem). Os dados em bruto foi analisado e a eficiência de cada reacção foi calculada pelo software LinRegPCR. β-actina foi utilizado como o controlo e a mudança endógena vezes na expressão de genes foi calculada pelo método ΔΔCt.

coloração com azul de metileno

As células tratadas com várias concentrações de 5-FU para tempo diferente intervalos, foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, fixadas com etanol a 50% arrefecido com gelo. 0,2% (W /V) de solução azul de metileno coloração foi adicionado à placa e coloração foi realizada durante 30 segundos. A solução foi aspirada e as células foram lavadas três vezes com água gelada. As amostras foram secas ao ar e visualizadas sob um microscópio de luz.

citoesqueleto de actina coloração

Células semeadas em placas de seis poços foram tratados com 5-FU. No final do período de tratamento, as células foram lavadas com PBS e fixadas com solução de paraformaldeído a 3,7% contendo 0,1% de Triton X-100 a 37 ° C durante 30 min. Após lavagem com PBS três vezes, as células foram bloqueadas com BSA a solução de bloqueio a 1% durante 30 min. Em seguida, as células foram incubadas com o anticorpo primário anti-actina β (BD Transduction Laboratories) e subsequentemente com FITC etiquetado o anticorpo secundário (BD Transduction Laboratories). Após a coloração com FITC etiquetado o anticorpo secundário, as células foram lavadas três vezes e incubadas com meio contendo 300 nM de DAPI durante 3 min. As células foram lavadas exaustivamente, finalmente, ressuspensas em PBS e visualizadas ao microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse t

i

-U, Japão) com um filtro de excitação de 480/15 nm (para FITC) e 360/20 nm (para DAPI).

A análise estatística

Os valores para todos os experimentos foram expressos como média ± SEM de três ou mais experiências individuais. Os dados foram analisados ​​pelo teste t de Student ou ANOVA conforme aplicável, usando GraphPad Prism 5.01. Estatisticamente significantes valores são indicados por * (p 0,05), ** (p 0,01) e *** (p 0,001).

Resultados

Geração de células U87-MCSF e sensibilidade em relação a 5-FU

Figura 1A representado a estratégia para a geração de linha de células estável U87-MCSF. A 0,771 kb de PCR amplificado do gene correspondente a isoforma membrana ligada de MCSF foi clonado sequencialmente em vectores pGEMT-easy e pEGFP-N1. Os clones foram verificados por análise de restrição na Figura 1B (pista 2 e 4). A linha estável de células (U87-MCSF), superexpressão MCSF foi estabelecido por transfecção de células U87MG com pEGFP-N1-MCSF. Uma população mista de clones de U87-MCSF foi seleccionado com G418 (400 ug /ml) para excluir o papel potencial de qualquer outro processo de compensação resultantes da transfecção de uma única população clonal. A expressão do transgene MCSF foi confirmada por semi-quantitativo de RT-PCR (Figura 1C). A sobre-expressão da proteína MCSF foi confirmada por transferência Western usando anticorpo anti-MCSF pelo que, um aumento de 1,8 vezes na expressão de MCSF foi observado em células U87-MCSF (Figura 1D). Uma diminuição na expressão do receptor de MCSF, CSF1R foi observado em células U87-MCSF (0,16 expressão vezes em células U87-MCSF, em comparação com células U87MG) (Figura 1C).

. Esquema para geração de linha de células U87-MCSF. B. A confirmação de clones por digestão de restrição As pistas 1 e 3: escada de DNA de 1 kb, pista 2: pGEMT-MCSF digerido com EcoR I, pista 4: pEGFP-N1-MCSF digerido com EcoR I e Apa IC análise de RT-PCR para a expressão de MCSF e CSF1R em células U87MG e U87-MCSF. análise de mancha de D. ocidental de proteína MCSF. Uma banda de 28 KD confirmaram a sobre-expressão de membrana MCSF ligado em células U87-MCSF.

sensibilidade das células U87-mCSF foi verificada por ensaio de XTT após o tratamento com várias concentrações de 5-FU, variando a partir de 5- 100 uM, durante 72 h. A proliferação de células U87-mCSF foi significativamente reduzida com o 5-FU ou acima de 10 uM, como é evidente a partir dos valores de absorvência reduzidas (Figura 2A). A redução de crescimento semelhante não foi observado na linha celular U87-GFP com o tratamento com 5-FU, em que a proliferação era quase idêntico ao das células de U87MG tratados. Além disso, nenhuma indicação de apoptose foi visto em U87MG tratados ou células U87-MCSF tratados após JC-1 coloração (Figura S1 no arquivo S1). Os resultados foram substanciadas com tripano quantitativa ensaio de exclusão de azul mostrou que populações de células saudáveis ​​com a membrana celular intacta após 120 horas de tratamento (Figura 2B). Foi investigada a expressão de alguns genes pró-apoptóticos e anti-apoptóticos tais como caspase-3, Bax e Bcl-xL. Como mostrado na Figura S2 no ficheiro S1, a expressão de gene pró-apoptótico, Bax foi aumentada em amostras tratadas de ambos U87MG (1,90 vezes) e células U87-MCSF (1,29 vezes). A expressão do gene anti-apoptótica Bcl-xL foi também aumentado em U87MG tratados e as células U87-MCSF tratados. No entanto, o aumento da expressão de Bcl-xL foi de 2,11 vezes em células U87-MCSF tratados, em comparação com o aumento de 1,25 vezes em células U87MG tratados. Caspase-3 expressão permaneceu inalterada em amostras tratadas de U87MG e as células U87-MCSF.

A. Efeito de 5-FU sobre o crescimento e viabilidade de U87MG, U87-MCSF e células U87-GFP calculado por ensaio XTT após 72 h de tratamento com 5-FU. ensaio de exclusão do corante azul tripano mostrou B. populações saudáveis ​​após 120 h de tratamento com 5-FU. A significância estatística é denotado por * (P 0,05), ** (P 0,01) e *** (p 0,001).

efeito do 5-FU sobre o ciclo celular e ciclinas

O ciclo celular após tratamento com 5-FU foi estudado por coloração com iodeto de propídio utilizando citometria de fluxo. Inicialmente, ambas as células U87MG e U87-MCSF foram sincronizadas na fase G0 /G1 por privação de soro durante 48 h e, em seguida, o padrão do ciclo celular foi observada em meio contendo soro completo, a intervalos de tempo regulares. A taxa de progressão de ciclo celular entre duas linhas celulares foi mesmo (Figura S3 no ficheiro S1). Isto também foi confirmado por CFSE ensaio de proliferação celular (Figura 3A), através da qual foi encontrado o tempo de duplicação de ambas as linhas de células a ser 12 h.

. Ensaio de proliferação de células CFSE mostraram que a taxa de proliferação de células U87MG e U87-MCSF não tratadas permaneceram inalterados. B. Análise do ciclo celular de células U87MG e U87-MCSF após o tratamento com 5-FU durante 24 h. Maioria das células foram acumulados na fase G0 /G1 na população tratada de células U87-MCSF. A significância estatística é denotado por * (P 0,05), ** (P 0,01) e *** (p 0,001).

Em seguida, as células pré-sincronizadas foram tratadas com 25? M 5 -FU em meio contendo soro durante 24 h. O padrão de distribuição do ciclo celular analisada por citometria de fluxo mostrou percentagem significativamente mais elevada (90%) de células U87-MCSF tratados na fase G0 /G1 do que o das células U87MG tratados (69%) (Figura 3B). Isto foi acompanhado por uma diminuição correspondente na proporção de células em S e G2 /M fases. Comparativamente, 75% das células U87-GFP foram acumulados na fase G0 /G1, após tratamento com 5-FU (dados não mostrados).

ciclinas envolvidos na transição de fase G1-S e G1 foram examinados por PCR em tempo real quantitativo a análise após o tratamento de células sincronizadas (na fase G0 /G1) com 5-FU durante 18 horas. Da mesma forma, as ciclinas envolvidos na fase S tardia e fase G2 /M foram quantificadas após 24 h de tratamento com 5-FU. A expressão da ciclina D1 permaneceu inalterada entre U87MG tratadas e as células U87-MCSF tratados. Depois de 18 h de tratamento com 5-FU, a expressão da ciclina E foi significativamente diminuída em células U87-MCSF tratados, mas não em células de U87MG tratados (Figura 4). No entanto, após 24 h de tratamento com 5-FU, a regulação na expressão de ciclina E foi observada em amostras tratadas de ambos células U87-MCSF (Figura S4 em S1 Arquivo) U87MG e. Este denotado que a resposta das células U87-MCSF de tratamento com 5-FU foi mais rápido do que as células U87MG. Uma ligeira diminuição na expressão de ciclina A2 também foi observada em 5-FU tratada células U87-MCSF em comparação com 5-FU tratadas células de U87MG após 24 h de tratamento com 5-FU. As expressões de ciclina B1 e de ciclina B2 eram menos em ambas as amostras tratadas, correlacionando-se com o menor número de células progrediu para a fase G2 /M. A expressão de p21, um inibidor de quinase dependente de ciclina, foi aumentada nas amostras tratadas de ambas as células U87MG e U87-MCSF. Assim, a expressão diferencial de ciclinas e o inibidor de CDK, p21 em várias fases do ciclo celular corroborados com o atraso do crescimento de células em 5-FU tratada células U87-MCSF.

Uma diminuição significativa na expressão de ciclina E e uma ligeira diminuição na expressão de ciclina A2, foi observada em células U87-MCSF tratados, que se correlacionou com a elevada acumulação G0 /G1 de células visto na análise do ciclo celular. A expressão de p21, o inibidor de quinase dependente de ciclina foi aumentada em amostras tratadas de ambas as células U87MG e U87-MCSF. A significância estatística é denotado por * (P 0,05), ** (P 0,01) e *** (p 0,001).

epitelial-mesenquimal transição (EMT) de células U87-MCSF

Para além do atraso do crescimento celular, alterações morfológicas eram visíveis nas células U87 de metileno azul-MCSF coradas tratadas com ainda baixa dose de 5-FU. Aparência da alongado, em forma de fuso com morfologia processos morosos foi visto em células U87-MCSF com 25 uM de tratamento com 5-FU durante 72 h, mas não em células de U87MG (Figura 5A). No entanto, a morfologia alongada foi observado em ambas as células com 50 ^ M de tratamento com 5-FU. Além disso, a coloração do citoesqueleto de amostras não tratadas e tratadas de U87MG e as células U87-mCSF foi realizada usando anticorpo anti-actina β (Figura 5B). Os resultados obtidos reforçado as alterações morfológicas observadas na coloração com azul de metileno. células alongadas e mesenquimais foram observados em 25 uM 5-FU tratada células U87-MCSF mas não em 25 uM 5-FU tratadas células de U87MG após 72 horas de tratamento. Mas, células alongadas foram observados em ambas as células U87MG e U87-MCSF quando tratadas com 50? M de 5-FU durante 72 h. Além disso, o exame microscópico de DAPI células coradas com 25 e 50? M de 5-FU tratamento após 120 h mostrou núcleos intactos, e o calceinAM células coradas sob condições idênticas, conferidos fusiformes morfologias alongadas (Figura S5 em S1 ficheiro), o que foi semelhante para a observação de coloração com azul de metileno. A expressão do marcador de diferenciação de astrócitos, proteína glial fibrilar ácida (GFAP) estava ausente e a expressão de hTERT foi significativamente reduzida em ambas as células U87MG e U87-MCSF após o tratamento com 5-FU, o que justifica a supressão da proliferação das células (Figura 6C).

A. coloração com azul de metileno para detecção da morfologia das células após o tratamento com 5-FU. B. Actina coloração do citoesqueleto das células tratadas utilizando anticorpo anti-actina β. As imagens morfológicas mostrou a presença de células alongadas e mesenquimais em células U87-MCSF tratadas com 25? M de 5-FU, mas não em células de U87MG tratados com 25? M de 5-FU. Após tratamento 50? M de 5-FU, células alongadas foram observados em ambos U87MG tratados e tratados células U87-MCSF. Barra de escala:. 50 mm

A. Morfologia das células U87MG e U87-MCSF não tratados. as células U87-MCSF mostrou em forma de fuso, tal como as células mesenquimais (indicado pelas setas). B. Os estudos microscópicos utilizando anticorpo anti-MCSF revelou a localização citoplasmática de MCSF. Triton X-100 foi utilizado como agente de membrana perfurante na solução de fixação. Núcleo coradas com DAPI também foram mostrados. C. semi quantitativa análise de RT-PCR de hTERT, GFAP, N-caderina, vimentina, fibronectina e Notch-1. A expressão de marcadores de células mesenquimais, N-caderina, vimentina e Notch-1 aumentou em células U87-MCSF. Barra de escala: 50 mm

A presença de fusiformes, com mais mesenquimais células que aparecem nas células U87-MCSF não tratados (Figura 6A) indicou a possível ocorrência de transição epitelial-mesenquimal.. A expressão de célula epitelial marcador de E-caderina e mesenquimais célula marcadores vimentina, N-caderina, fibronectina foi analisada por semi-quantitativa por RT-PCR. A expressão da E-caderina não foi visto em células não tratadas e tratadas de ambas as células U87MG e U87-MCSF (dados não mostrados). No entanto, houve um aumento substancial na expressão de marcadores de células mesenquimais vimentina (~ 2 vezes em ambas as amostras não tratadas e tratadas) e N-caderina (1,98 e 3,32 dobras em amostras não tratadas e tratadas, respectivamente) em células U87-MCSF (Figura 6C). O nível de expressão de fibronectina foi inalterado em ambos os tipos de células tratadas. Além disso, a expressão de Notch-1, o indutor de transição epitelial-mesenquimal (EMT), verificou-se ser significativamente regulada positivamente (2,14 vezes) em células U87-MCSF. O exame microscópico das células U87-MCSF, após a fixação com solução de paraformaldeído a 3,7%, contendo Triton X-100, revelada a localização citoplasmática de MCSF (Figura 6B). No entanto, na ausência de Triton X-100 na solução de fixação não foi observada nenhuma fluorescência (dados não apresentados), indicando a ausência de MCSF na membrana celular.

Aspecto do cancro da população de células-tronco e a regulação positiva de transportadores ABC

a proliferação reduzida, a mudança na morfologia celular e as indicações para a presença de EMT sugeriu a possibilidade de indução de cancro de células estaminais em células U87-MCSF após tratamento com 5-FU. Analisou-se a expressão de marcadores para cancro de células estaminais, CD24 e CD44 por citometria de fluxo e PCR em tempo real. A citometria de fluxo mostrou que a análise de expressão de CD24 foi aumentada em 6,93% e 33,37% nas células U87MG e U87 células-MCSF, respectivamente, quando tratado com 25? M de 5-FU (figura 7A). Nenhum aumento na expressão de CD44 foi observada em amostras tratadas de ambas as células U87MG e U87-MCSF. Análise da expressão quantitativa por PCR em tempo real também revelou o aumento da expressão de CD24 de cerca de 4 vezes em células U87-MCSF tratados, enquanto que apenas 2 vezes de aumento na expressão de CD24 foi observada em células U87MG tratados. a expressão de CD44 manteve-se inalterada em células tratadas de ambos U87MG e U87-MCSF (Figura 7B).

. A análise de citometria de fluxo para a expressão de CD24 e CD44 em células tratadas. B. em tempo real de análise de PCR da expressão de CD44, CD24, ABCB1, mdm2, ABCG1 e ABCG2. Os dados foram representados graficamente como a razão entre a expressão do gene na amostra tratada com a amostra não tratada para as respectivas células. A significância estatística é denotado por * (P 0,05), ** (P 0,01) e *** (p 0,001).

Os genes transportadores de ABC têm sido associados com o afastamento de drogas em muitos tipos de cânceres. Analisou-se a expressão de ABCG1, ABCG2 e ABCB1 por quantitativa PCR em tempo real. A Figura 6B demonstra que a expressão de ABCG1 e ABCB1 foi aumentado em ambos U87MG tratados e tratados células U87-MCSF. No entanto, a expressão de ABCB1 foi aumentada em 10,2 vezes em células U87-MCSF tratados, em comparação com o aumento de 2 vezes em células U87MG tratados. Do mesmo modo, a expressão do oncogene mdm2 também foi aumentada por seis vezes em células U87-MCSF tratados em comparação com o aumento de 3,3 vezes encontrados nas células U87MG tratados. Também examinamos o nível de RALBP1gene, um transportador não-ABC associada a MDR (resistência a múltiplas drogas) expressão. Nós achamos um aumento marginal na expressão de RALBP1 em células U87-MCSF não tratados (1,29 vezes) em comparação com as células U87MG não tratadas (Figura S6 no ficheiro S1). No entanto, após tratamento com 5-FU, sem regulação positiva em RALBP1 foi observada em amostras tratadas no que respeita ao seu correspondente amostras não tratadas.

Discussão

Glioblastoma continua a ser um dos tumores malignos mais prevalentes com má terapêutico resposta [11]. A expressão de várias proteínas resistentes a múltiplas drogas tem contribuído principalmente para a capacidade das células de glioma para desenvolver o fenótipo resistente à quimioterapia, [12], [13]. No presente estudo, MCSF células de glioblastoma U87MG expressam exibiram um crescimento reduzido e retardo significativo na proliferação celular sem sofrer apoptose após a administração de 5-FU. Um equilíbrio na expressão de genes pró-apoptóticos e anti determinar o destino das células entrando na via apoptótica [14]. Análise da expressão de genes pro e anti-apoptóticos revelou que a sobre-regulação da expressão de gene pró-apoptótico, Bax é contrabalançada pela regulação positiva da expressão de anti-apoptótica de Bcl-xL em ambos U87MG tratados e tratados células U87-MCSF . No entanto, as células U87-MCSF tratados tinham menor expressão do gene de pró-apoptótica Bax e expressão mais elevada de anti-apoptótica de Bcl-xL, em comparação com células U87MG tratados. Os nossos resultados mostraram que, embora as amostras tratadas de ambas as células U87MG e U87-MCSF não sofrem apoptose, 5-FU tratada células U87-MCSF tinha maior resistência à apoptose de 5-FU tratada células U87MG.

Observamos que MCSF está localizada no citoplasma e não na membrana celular. Além disso, a expressão do receptor para MCSF, CSF1R foi regulada negativamente em células U87-MCSF, que estava de acordo com o relatório anterior [15] sobre a regulação para baixo de mRNA de CSF1R por MCSF em macrófagos primários. CSF1R foi pensado para funcionar na membrana do plasma, mas a evidência recente mostrou a presença de receptor funcional para MCSF para o envelope nuclear de várias células e macrófagos [16] cancerosas. Isto levanta a possibilidade de que os efeitos observados de MCSF em células U87-MCSF mediante tratamento com 5-FU pode ser mediada através do receptor localizado para o envelope nuclear.

EMT é um processo celular transdiferenciação conservada conferir as características de mesênquima células sobre as células epiteliais basais, aumentando suas propriedades invasivas e metástase [17], [18]. MCSF expressão em células de U87MG resultou no aparecimento de células fusiformes, tipo mais mesenquimais indicando a ocorrência de EMT. A sobre-regulação correspondente na expressão de marcadores mesenquimais como N-caderina e vimentina (1,98 e 2,18 vezes, respectivamente) também foi observado em células U87-MCSF. A expressão da E-caderina foi considerado ausente em todas as amostras analisadas (dados não mostrados) que se correlacionava com o previamente relatado dados mostrando a falta de expressão de E-caderina no glioblastoma [19]. Além disso, um aumento na expressão de nível-1 foi observada em células U87-MCSF. A sobre-regulação de Notch-1 está implicada na indução da transição epitelial-mesenquimal (EMT), que foi previamente relatado para aumentar as propriedades invasivas das células de cancro pancreático [20].

com 5-FU tratamento, a expressão de o marcador mesenquimal, N-caderina foi ainda aumentada em células U87-MCSF tratados por 3,32 vezes enquanto que a expressão de vimentina permaneceu inalterada. Em células U87MG tratados, apenas um aumento marginal na expressão de N-caderina e vimentina (1,26 e 1,41 vezes, respectivamente) observou-se. 5-FU tratamento propriedades mesenquimais induzida em ambas as células U87MG e U87-MCSF como pode ser visto na Figura 5 e Figura 6. No entanto, a concentração de 5-FU necessária para induzir estas alterações variaram entre U87MG e as células U87-MCSF. Enquanto as células mesenquimais alongadas e em forma de fuso foram observados nos animais tratados U87-MCSF quando tratadas com 25? M de 5-FU durante 72 h, a morfologia mesenquimal pode ser visto nas células de U87MG tratados apenas quando tratados com 50? M de 5-FU durante 72 h. Mas quando o tratamento com 25? M de 5-FU foi prolongada durante 120 horas, as células do tipo mesenquimal alongados foram observadas em amostras tratadas de ambas as células U87MG e U87-MCSF (Figura S5 em S1 arquivo).

Relatórios recentes estabelecido que EMT poderia desencadear a aquisição de propriedades estaminais semelhante nas células tumorais [21]. Uma subpopulação de células dentro de vários tumores exibem propriedades de células estaminais do cancro (CSC) com uma taxa extremamente lenta da proliferação, um aumento da expressão de genes de resistência a múltiplos fármacos e são considerados a principal razão para a recidiva do tumor após o tratamento [22], [ ,,,0],23]. Retardo na proliferação, ocorrência de EMT e resistência ao tratamento com drogas sugeriu a presença de CSCs ou seus precursores em populações de células tratadas. Análise de marcadores de superfície stemness-associado, CD24 e CD44 em células tratadas por citometria de fluxo representado um aumento de CD24

alta /CD44

baixa população de células, tanto U87MG tratadas e células U87-MCSF tratados. No entanto, as células U87-MCSF tratados apresentaram maior percentual (33,37%) de CD24

alta /CD44

células de baixa, em comparação com 6,93% em células U87MG tratados. Além disso, a análise de expressão quantitativa por PCR em tempo real revelou que a expressão de CD44 foi uniforme em 5-FU tratadas amostras de ambas as células, mas a expressão de CD24 foi consideravelmente mais elevada em células U87-MCSF tratados. Relatórios anteriores demonstraram que CSCs isoladas de câncer de mama foram predominantemente CD44

altos CD24

células /baixas [21]. Em contraste com isso, as células de câncer de mama com CD44

baixo /CD24

alta fenótipo também foi relatado para ter mau prognóstico com o tratamento [24]. Tabela S1. Figura S1. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Figura S6. Tabela S1.