Abstract
A hiperplasia prostática benigna (BPH) e carcinoma da próstata (PAC) estão ligadas ao envelhecimento e a presença de andrógenos, o que sugere que o andrógeno regulada genes desempenham um papel importante nestas doenças comuns. regulação andrógeno de crescimento e desenvolvimento da próstata depende da presença de interações epiteliais-estromal intactas. Além disso, o estroma prostático está implicado na hiperplasia prostática benigna. Isto sugere que linhagens de células epiteliais são insuficientes para identificar andrógenos genes regulados que poderiam contribuir para BPH e PAC e que poderia servir biomarcadores clínicos como potenciais. Neste estudo, foi utilizado um modelo de xenoenxerto de próstata humana para definir um perfil de genes regulados
in vivo
por andrógenos, com ênfase na identificação de biomarcadores candidatos. zona de transição benigna (TZ) tecido prostático humano a partir de prostatectomias radicais foi enxertado no sítio cápsula sub-renal de ratos imunodeficientes machos inteiros ou castrados, seguido da remoção ou adição de androgénios, respectivamente. análise de microarray de ARN a partir destes tecidos foi utilizado para identificar os genes que foram; 1) altamente expressa na próstata, 2) tinham alterações expressão significativa em resposta a androgénios, e, 3) codificam proteínas extracelulares. Um total de 95 genes que satisfazem estes critérios foram selecionados para análise e validação de expressão em tecidos da próstata de pacientes, utilizando quantitativa PCR em tempo real. Os níveis de expressão destes genes foram medidos em RNAs obtidos a partir de tecidos da próstata humanos com gravidade variável da HBP alterações patológicas e Cap de variar pontuação de Gleason. Um certo número de genes regulados andrógeno foram identificados. Além disso, um subconjunto destes genes foram sobre-expressos em ARN a partir de tecidos de BPH clínicos, e os níveis de muitos correlacionam com o estado de doença. Nossos resultados demonstram a viabilidade, e alguns dos problemas, de usar um mouse modelo de xenotransplante para caracterizar os andrógenos regulada perfis dos tecidos da próstata humanos intactos expressão
Citation:. Amor HD, Booton SE, Boone BE, Breyer JP , Koyama T, Revelo MP, et al. (2009) Genes andrógeno regulamentados na próstata humana xenoenxertos em ratinhos: Relação com BPH e cancro da próstata. PLoS ONE 4 (12): e8384. doi: 10.1371 /journal.pone.0008384
editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 18 Agosto, 2009; Aceito: 18 de novembro de 2009; Publicação: 21 de dezembro de 2009
Direitos de autor: © 2009 adorar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e renais (NIDDK) concessão MPSA Consortium UO1-DK63587, National Institutes of Health (NIH) DK067049 subvenção ea Microarray de recursos partilhada Vanderbilt, apoiado pela Vanderbilt Ingram Cancer Center, P30 concessão CA68485, ea Vanderbilt Digestive Disease Center, conceder P30 DK58404, ea Vanderbilt Centro de Visão, conceder P30 EY08126. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
hiperplasia prostática benigna (BPH) é extremamente comum nos homens idosos, a contribuir para o padrão de morbidade conhecido como sintomas do tracto urinário inferior (STUI) e resultando em custos de saúde anuais significativos [1]. Apesar da disponibilidade de tratamentos médicos e cirúrgicos para BPH ainda há insuficiente compreensão dos processos envolvidos no crescimento patológico benigna da próstata humana
in vivo
[2]. Essa informação pode servir para melhor prever quais pacientes podem se beneficiar da terapia médica atual ou são mais propensos a progredir para a necessidade de intervenção cirúrgica, bem como informar a escolha de novas abordagens médicas visando novas vias.
BPH ocorre como homens em geral, e androgénios são necessários para o desenvolvimento da condição de [3], [4]. HBP é caracterizada patologicamente pela hiperplasia glandular e estromal na zona de transição da próstata (TZ) [5]. O despertar do potencial indutor embrionário no estroma da próstata tem sido proposta como uma causa da HBP [3], [5], [6], [7]. Isto é baseado na ideia de que o crescimento da próstata resultados da interacção de factores de crescimento locais entre os elementos epiteliais e do estroma do órgão sob a influência dos androgénios testiculares, sugerindo que os genes regulados andrógenos desempenhar um papel importante na doença. Esta hipótese é suportada pela evidência experimental considerável, em particular a partir de modelos de recombinação tecido [8], [9], [10].
inflamação prostática também tem sido implicado na patogénese da hiperplasia prostática benigna [11], [12] [13], [14]. A inflamação está associada com a gravidade da HBP, e os MTOPS (Terapêutica Médica de Sintomas Prostáticas) estudo sugere que o risco de progressão da HBP e retenção urinária aguda é maior em homens com a inflamação da próstata [13], [15]. O aumento da inflamação da próstata pode também resultar no rompimento da estrutura epitelial e arquitectura, resultando num aumento dos níveis séricos de antigénio específico da próstata (PSA).
o crescimento da próstata, diferenciação e função de adulto são dependentes da presença de androgénios. Está bem estabelecido que o crescimento e diferenciação de controlo androgénios através de interacções mesenquimais-epiteliais. No próstata adulta, andrógenos são acreditados para actuar através do receptor de estroma de androgénio (AR) para manter uma glândula crescimento quiescente [16], [17] e através da AR epitelial para desencadear a função secretora diferenciadas do epitélio prostático [18] . Em contraste com o crescimento-quiescência normal, o crescimento hiperplásico do epitélio glandular e estroma dentro da zona de transição na HBP representa mudanças no equilíbrio entre a divisão celular e morte. BPH pode, assim, inadequada recapitular eventos-chave na biologia do desenvolvimento da próstata. Os genes epiteliais mesenquimais e regulados por andrógenos que são importantes no crescimento anormal da próstata em BPH continuam a ser completamente definido. Estudos utilizando microarrays de cDNA de alto rendimento com andrógeno estimulou linhas de células de carcinoma não são susceptíveis de ser relevantes para qualquer desenvolvimento da próstata ou hiperplasia prostática benigna. células epiteliais transformadas em cultura têm um fenótipo marcadamente diferente, e proteoma associada, a partir de seus
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homólogos. Além disso tais abordagens não permitem a detecção simultânea de genes-chave de células do estroma ou para genes que podem ser moduladas como consequência de interacções cruciais epiteliais-estromal.
Estudos mais biologicamente relevantes, utilizando análise de cDNA microarray de tecidos de BPH têm foram relatados. Luo, et ai. analisada a expressão de genes humanos em 6500 o cancro da próstata e BPH tecidos a partir de doentes submetidos a prostatectomia radical ou ressecção transuretral da próstata (TURP) [19], [20]. Um certo número de genes foi encontrado para ser consistentemente regulada positivamente em comparação com BPH próstata normal. Estes incluíram
IGF1
,
IGF2
,
TGFB3
,
BMP5
,
MMP2
,
COX2
, e
GSTM5
. No entanto, estes estudos foram utilizados tecidos enriquecidas em células epiteliais. Como resultado, as análises poderão ter perdido os genes potencialmente cruciais expressas predominantemente em células estromais. Estes estudos não abordaram se algum dos pacientes tinham sido submetidos a terapêutica hormonal-ablação prévia. Abordagens baseadas em RNA extraído de tecidos também não permitem a manipulação direta da estimulação hormonal, o que limita a capacidade de detectar mais diretamente genes regulados por andrógenos, o que pode servir como preditores de resposta a terapias que atingem a estimulação androgênica ou novos alvos para terapia medicamentosa alternativo neste conduzido androgénio processo da doença.
em outro estudo em causa, os perfis de expressão de genes em células estromais da próstata a partir de diferentes zonas da próstata foram analisados, comparando tecidos normais e doentes [21]. Um certo número de genes foi encontrado para ser diferencialmente expressos entre estroma BPH e estroma zona de transição normal (TZ). Enquanto muitos genes estromais potencialmente importantes foram identificados que podem desempenhar um papel na HBP, estes estudos utilizaram células do estroma isoladas cultivadas
in vitro
, o que provavelmente resultaria em padrões de expressão gênica alterados daqueles que seriam vistas
in vivo
.
no presente estudo foi utilizada microarrays de oligonucleotídeos para examinar a expressão de genes regulados andrógeno no tecido da próstata humana benigna crescendo como xenoenxertos em ratinhos imunodeficientes graves combinados (SCID) [22]. Esta abordagem mantém as interações biologicamente relevantes do epitélio e estroma como ocorre
in vivo
e permite a manipulação direta de andrógenos, quer por castração ou suplementação hormonal do hospedeiro. O conjunto de dados resultante foi então analisado para identificar genes relativamente altamente expressos, que foram regulados de androgénio. Em um esforço para identificar potenciais biomarcadores passíveis de futuros testes à base de sangue, foi dada ênfase genes cujos produtos eram conhecidos ou previsto para ser extracelular. Expressão destes genes foi então analisada utilizando qRT-PCR, com piscinas de cDNA derivadas de tecidos de pacientes com alterações mínimas, leve, moderada e grave BPH patologia, ou com tampa, para determinar se a expressão correlacionada com o estado da doença.
materiais e Métodos
Ética Declaração
amostras de tecido da próstata humana de-identificados foram obtidas a partir do tecido Vanderbilt Aquisição do núcleo através do Departamento de Patologia de acordo com protocolos Vanderbilt IRB. Todos os pacientes assinaram o consentimento informado, que aprova o uso de seus tecidos para fins de investigação não especificados. Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do Vanderbilt Institucional Animal. Animal Care /bem-estar e supervisão veterinária foi fornecido pela Vanderbilt Divison of Animal Care.
A análise histopatológica e Seleção da amostra
Para determinar a gravidade das alterações de patologia BPH para casos utilizados para extração de RNA, TZ áreas afetadas pela hiperplasia glandular e estroma foram delineadas nas seções inteiras de montagem de prostatectomia radical (RP) amostras obtidas através do Departamento de Patologia de acordo com protocolos Vanderbilt IRB. TZ volumes foram determinados por planimetria, com uma mesa gráfica digitalizada, de um modo idêntico ao nosso determinação rotina do volume total do tumor no RPS [23], [24], [25]. Foi dada preferência aos casos com zona periférica pequeno volume de tumores (PZ), de modo que qualquer alargamento global da próstata será devido ao alargamento TZ e para reduzir a probabilidade de que o metabolismo hormonal potencialmente relevantes para a BPH seria alterado pelo cancro da próstata grande volume [26] . BPH foi categorizadas a partir de 37 casos, como mínimo (min), leve, moderada, ou severa, com base nos seguintes critérios. Min /controle: o volume de TZ 4,5 cm
3, em peso da próstata 34 g, sem nódulos de BPH; BPH leve: o volume de TZ 4.5-8.99 cm
3 ou próstata em peso 34-44.99 g ou BPH nódulos; HBP moderada: o volume de TZ 9-16,99 cm
3 ou da próstata em peso 45-59.99 g e BPH nódulos; BPH grave: o volume de TZ ≥17 cm
3 ou peso da próstata ≥60 g e nódulos de BPH. tecidos de cancro da próstata foram classificados como moderadamente diferenciados (Gleason pontuação 5-6) ou pouco diferenciados (Gleason pontuação 8-9). Congeladas rapidamente núcleos de tecido fresco adquiridos conforme descrito abaixo foram processadas para RNA e histologia [27].
Sub-Renal xeno das amostras frescas TZ Humana e Ablação Estratégias Hormonal
tecido da próstata humana
De-identificado as amostras foram obtidas a partir do tecido Vanderbilt Aquisição do núcleo através do Departamento de Patologia, em conformidade com protocolos Vanderbilt IRB. núcleos de 6 mm de diâmetro obtidos no intra-operatório a partir de amostras de RP frescos foram adquiridos a partir da direita e da esquerda TZ e PZ a partir de meados de base e a partir de meados de ápice como descrito [27] e análise histológica feita em cortes congelados de secções transversais de espessura total. Núcleos determinada para conter o tecido TZ normal foram cortados em pedaços de cerca de 2-3 mm de espessura e 4-6 partes foram então xenoenxertado por baixo das cápsula renal de ratos adultos machos ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID) [CB-17 /IcrHsd ratinhos-SCID ( Harlan, Indianapolis, IN)]. TZ tecidos a partir de cada um dos seis pacientes foram xenoenxertados em conjuntos de 10 ratos SCID castrados com alguns grupos de ratinhos que receberam o tecido a partir de dois pacientes diferentes quando disponível, enxertado rins contralaterais. Cinco ratinhos de cada grupo receberam implantes sub-cutânea constituídos por um comprimento de 2,5 centímetros de tubo silástico (ID OD x 1,98 milímetros 3,18 milímetros, Dow Corning, Midland, MI) contendo 25 mg de testosterona (PCCA, Houston, TX). As extremidades do tubo de Silastic foram seladas com um adesivo do tipo silicone médico (Dow Corning). Uma pequena quantidade de óleo de milho foram adicionados antes de selar o tubo para facilitar a dissolução da testosterona. Depois de permitir que os xenoenxertos de estabelecer, durante um mês, os implantes foram removidos a partir dos ratinhos de testosterona completada, e pastilhas de 25 mg de testosterona (produzido com uma Parr Pellet Press, modelo 2816 com 4,5 mm de morrer, Parr Instrument Company, de Moline, IL) foram implantados por via subcutânea nos ratos que não receberam testosterona. Os ratinhos de controlo foram sacrificados no momento da adição ou remoção de androgénio, e os restantes ratinhos de cada grupo foram sacrificados aos 1, 3, 7, e 14 dias a seguir à adição ou remoção de androgénio. xenotransplantes colhidos foram rapidamente dissecados sob ampliação e congelados em nitrogênio líquido. Os tecidos congelados foram armazenados a -80 ° C.
Extração de RNA e cDNA microarrays
extracção de ARN de tecidos TZ e xenoenxertos colhidos congelados instantaneamente foi realizada utilizando uma modificação dos métodos anteriormente descritos [27] , [28]. Resumidamente, o ARN foi extraído utilizando TRIzol (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), seguido por um segundo isolamento de ARN utilizando RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA) com o tratamento com DNAse. As amostras de ARN foram armazenadas a -80 ° C. a qualidade do RNA foi analisado pelo recurso Vanderbilt Microarray Compartilhada (VMSR) utilizando espectrofotometria (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) e bioanálise (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). As amostras de RNA de xenoenxertos foram submetidos ao VMSR para amplificação (Sistemas NuGen, Inc., Traverse City, MI) e rotulagem, seguido de hibridação para microarrays impressos a partir do lançamento Human 2.0 OligoLibrary, (Compugen, San Jose, CA), que contém 28.830 genes únicos de um total de 29,134 oligos. O RNA de referência foi criado através da partilha de amostras de RNA a partir de ambos os tecidos de castração e de andrógenos tratados de controle camundongos dia zero.
análise estatística dos dados Microarray
Devido à variação considerável inerente a pacientes individuais, o 0 tempo para cada amostra de tecido foi utilizada como o controlo ou a amostra de referência, em vez de uma amostra de referência padrão ao longo de toda a experiência. Os dados foram normalizados por Lowess usando software GeneTraffic (Iobion Informática, La Hoya, CA) e importados para GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) para posterior análise. Inicialmente, foram consideradas pontos único dia 0 e no dia 14 de tempo, com os genes que tinham pelo menos uma regulação positiva de 1,5 vezes no dia 14 versus dia 0 amostra seleccionada, que produziu 5.679 genes /sondas. Pela análise de variância foi utilizada para identificar genes com diferenças significativas na expressão, com um
P
-VALOR de corte de 0,05, indicando 284 genes de falsos positivos esperados. Um t-teste de Welch foi então utilizado para identificar genes com diferenças significativas (
P
-valor menos de 0,05) na expressão entre os dias 0 e 14 através de todas as amostras de tecido. Esta lista foi então filtrado pelo valor da expressão do sinal, mantendo o top 95% do sinal de alcance dinâmico, produzindo 784 genes /sondas. Este método de análise foi realizada de forma independente para ambos os conjuntos de dados e de castração de testosterona suplementado. Todas as análises estatísticas de dados de microarranjos foram realizados pelo VMSR
identificação de alvos biomarcadores candidatos
genes potencialmente candidatos foram selecionados sistematicamente com sobreposição de critérios de bioinformática, empregando WebGestalt:. 1) regulado por andrógeno (1,5 fold ou
P
≤0.05 dentro de nossos dados de microarranjos), 2) expresso em níveis significativamente mais elevados na próstata em relação a outros tecidos (
P
≤0.05 pelo teste hypergeometric), e 3) espaço extracelular ou de superfície celular (categorias) Gene ontogenia. Estes critérios produziu um conjunto de genes que incluíram biomarcadores previamente validados, incluindo
KLK3
,
ACPP
, e
MSMB
. Vários genes adicionais conhecidos ou suspeitos de estar envolvidos em BPH com base em estudos anteriores foram “manualmente” incluído para um estudo mais aprofundado:
IGF1
,
IGF1R
,
TGFB1,
TGFB3
,
TGFBR1
, e
TGFBR2
. Um total de 84 genes alvos (e
18S
rRNA gene controle de arrumação) foram escolhidos para a confirmação da expressão em amostras de pacientes, vários avaliada com sondas redundantes.
Real-Time Confirmação qRT-PCR
a TaqMan de baixa densidade cartão de matriz microfluídico, formato 96a (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi concebido para analisar genes candidatos a partir dos genes de análise de microarray e de controlo, para um total de 96 alvos. 1 ug de RNA total foi transcrito de forma inversa em ADNc de cadeia simples usando High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems). Após a síntese de ADNc, o ARN foi degradada por hidrólise alcalina, ajustado a pH neutro, e o cDNA purificado por adsorção em gel de sílica (kit de purificação de PCR QIAquick, Qiagen Inc.) e eluiu-se em 64 ul de 10 mmol /L de Tris HCl (pH 8,5) . quantidades de ADNc foram medidos espectrofotometricamente (NanoDrop ND-1000, NanoDrop Technologies). O ADNc foi diluída até 0,25 ng /mL em 1X TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), carregado no cartão de microfluidos, selado e centrifugado. Cartões foram então repetido em um sistema de detecção de sequência ABI Prism 7900HT, e os dados analisados com o software SDS 2.1 (Applied Biosystems). Após a normalização para o controlo endógeno, do rRNA 18S, os níveis foram expressos relativamente ao calibrador piscina ARN de controlo (dobre mudança). ARNs preparados a partir de cada uma das categorias de tecidos BPH foram reunidas a partir de 5-10 pacientes. ARN de controlo foi reunido a partir de pacientes com nenhuma expansão TZ apreciável. A análise incluiu quatro repetições para as piscinas BPH leves e graves, bem como as piscinas moderadamente diferenciados e pouco diferenciados câncer de próstata, e oito repetições para o controle e piscinas HBP moderados.
imuno coloração
amostras de tecido de próstata humana do embebido em parafina blocos inteiros de montagem a partir de 43 pacientes inicialmente caracterizada por gravidade HBP patologia e utilizada para a correspondente ARN derivado TZ foram obtidas a partir do tecido Vanderbilt Aquisição do núcleo através do Departamento de patologia e microarrays de tecido foram gerados por um dos os autores (MPR). Os microarrays continha três amostras do núcleo de 0,6 mm, duas do TZ e um de PZ longe da área de câncer envolvidos. Coloração de secções de tecido foi realizada utilizando um protocolo previamente descrito [29]. Secções (5 uM) foram cortadas e montadas em lâminas de vidro carregadas. Após desparafinização e re-hidratação, as secções de tecido foram submetidas a recuperação de antigénios por meio de aquecimento num forno de microondas durante 10 minutos em Vector H-3300 desmascaramento solução de antigénio (1:100; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). As lâminas foram então incubadas em peróxido de hidrogénio a 0,3% em metanol durante 30 minutos à temperatura ambiente (RT), seguido por uma incubação de 1 hora em soro de cabra a 5% em PBS à temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C em soro de cabra a 5% em PBS. Os anticorpos usados foram um anticorpo monoclonal de ratinho contra TIMP2 (1:300, SC-21735, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), e de coelho policlonais contra FGF2 (1:500, SC-79, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) e SMOC1 (1:100, Atlas Antibodies, de Estocolmo, Suécia). As lâminas foram então lavadas e incubadas num anticorpo biotinilado secundário (anticorpo de coelho anti-ratinho ou anti-coelho de suíno, 1:300, DAKO, Carpinteria, CA) à temperatura ambiente durante 60 min, lavadas extensivamente em PBS, depois incubadas em ABC-HRP complexos (Vector Laboratories) durante 30 min. Os anticorpos ligados foram então visualizadas por incubação com tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina líquido (DAKO). As lâminas foram então lavadas extensivamente em água da torneira, contrastadas com hematoxilina e montadas. cortes de tecidos manchados foram fotografados e processados usando um microscópio Zeiss AX10 Imager.M1 e AxioVision versão 4.6 do software.
Os slides imunomarcadas foram revisadas por um patologista (MPR) cegos para a gravidade BPH patologia do caso e os resultados foram expressos de um modo semi-quantitativo. coloração percentual foi pontuada numa escala de 0 a 4, onde 0 = sem coloração, 1 = menos de 25%, 2 = 25% a 50%, 3 = 50% a 75%, e 4 = 75% a 100%. A intensidade de coloração foi pontuada numa escala de 1 a 3, em que 1 = ligeira, 2 = moderada; e 3 = marcada. Para uma amostra produzindo sem coloração, a pontuação de intensidade também foi 0. Quando ambos estromal e coloração epitelial estava presente, de pontuação foi feito separadamente. Para calcular um índice de expressão da proteína, a pontuação percentual foi somado com a pontuação de intensidade. As pontuações combinadas foram plotados para cada categoria BPH patologia (mínima, leve, moderada, grave mudanças BPH), e os testes de Kruskal-Wallis foram utilizados para comparar as pontuações combinadas em todo estado de gravidade da doença diferente.
Resultados
andrógeno-regulamentados Perfis de expressão gênica na próstata humana Zona de Transição
Nós perfilado padrões de expressão de genes a partir de xenoenxertos TZ próstata humanos, após a adição ou subtração de testosterona. A Figura 1 ilustra o esquema geral utilizado para a manipulação dos níveis de andrógeno em ratinhos SCID que albergam xenoenxertos cápsula prostática sub-renal. O ARN total foi preparado a partir de xenoenxertos colhidas com ou sem exposição a testosterona durante 0, 1, 3, 7, e 14 dias. Uma piscina feita a partir de quantidades iguais de ARN a partir de dia 0 de castração e xenoenxertos intactas de ratinho foi utilizado como um padrão de referência. Um total de 58 hibridações foram concluídas, que incluiu amostras de seis pacientes. As análises iniciais indicaram um nível elevado (até 10 vezes) do doente-a-doente variação nos níveis de expressão de genes regulados de androgénio conhecidos, tais como o
KLK3
(PSA). A fim de que esta variabilidade biológica esperada entre os tecidos de pacientes individuais, amostras de ARN de tecido proveniente de cada paciente foram re-centrada para o tempo que o paciente 0 controlos. Para a análise primária, foram considerados dois pontos de tempo, dias 0 e 14, obtendo-se 5.679 genes com um aumento de 1,5 vezes ou mais na expressão. Pela análise de variância foi realizada sobre esses 5.679 genes, com um
P
-valor de corte de 0,05, que prevê 284 falsos positivos. Os genes que tinham pelo menos um aumento de 1,5 vezes ou diminuição na expressão no dia 14 versus dia 0 amostra foram então filtradas por expressão valor do sinal, mantendo a parte superior 95% do sinal de gama dinâmica, obtendo-se 784 genes. Os dados de microarranjos foram depositados na expressão do gene do NCBI Omnibus [30] e são acessíveis através do número de acesso GEO Series GSE17862 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE17862) .
TZ tecidos de seis pacientes foram xenoenxerto sob as cápsulas renais de camundongos SCID machos castrados (10 ratos por paciente). Cinco ratinhos de cada grupo foram então dada implantes sub-cutânea contendo 25 mg de testosterona. Depois de permitir que as xenographs para estabelecer durante um mês, os implantes foram removidos a partir dos ratinhos suplementados testosterona, testosterona e 25 mg de pelotas foram implantados em ratinhos que não tinham recebido a testosterona. Os ratinhos de controlo foram sacrificados no momento da adição ou remoção de androgénio, e os restantes ratinhos de cada grupo foram sacrificados aos 1, 3, 7, e 14 dias.
genes regulados por andrógenos em Humana TZ xenoenxertos
a Tabela 1 lista os 45 melhores genes que foram sobre-regulada em resposta ao andrógeno, ordenadas pela mudança vezes (em ordem decrescente). As três principais genes,
KLK3
(PSA),
MSMB
(beta-microseminoprotein), e
TMEPAI
(próstata transmembranar proteína induzida por andrógeno) foram previamente bem conhecida para ser regulada por androgénios na próstata humana [31], [32], [33]. Vários outros genes identificados como sobre-regulada em xenoenxertos humanos TZ por testosterona têm também sido mostrado previamente para ser regulada por androgénios. Estes incluem
TRPM8
(receptor de potencial transitório membro melastatin 8), um marcador de prognóstico putativa e alvo terapêutico no cancro da próstata [34], [35],
ACPP
(fosfatase ácida prostática) [36 ],
SCGB1A1
(uteroglobina) [37],
NDRG1
(N-myc gene a jusante regulada 1) [38], e
CREB3L4
(proteína de ligação elemento de resposta a cAMP 3 4 semelhante) [39].
RNASEL
foi classificado como um gene do câncer de próstata hereditário candidato [40]. Outros genes identificados que foram relatados como ou envolvidos no câncer BPH ou da próstata incluídos regulada por androgénio
PTGDS
(sintase da prostaglandina D2),
FGFBP1
,
KLK11
(calicreína 11),
CXCL5
(quimiocinas (CXC motif) ligando 5),
FKBP11
(proteína de ligação FK506 11) e
TIMP1
( inibidor tecidual de metaloproteinase 1).
TMEPAI
(proteína induzida por andrógeno transmembrana da próstata) foi o gene regulado por andrógeno mais altamente expresso identificados. , genes regulados por andrógenos adicionais altamente expressos incluídos
KLK3
(PSA),
MSMB
(beta-microseminoprotein),
ACPP
(fosfatase ácida prostática) e
SCGB1A1
(uteroglobina).
Genes-regulada em resposta ao andrógeno retirada
a Tabela 2 lista os 45 melhores genes que foram sobre-regulada em resposta à retirada de andrógeno por 14 dias , classificado por mudança vezes (em ordem decrescente). Um dos genes identificados,
GLI1
é regulado para cima em próstata mouse seguindo a castração [41]. Outro gene identificado com o aumento da expressão era
ANNAT1
(anexina 1), que foi reportado para diminuir em androgénio estimulada cancro da próstata em comparação com o epitélio prostático benigno [42].
RT análise-PCR de ARN de próstata humano piscinas
Para investigar ainda mais os níveis de andrógeno genes regulados identificados por análise de microarray de expressão, a análise quantitativa de RT-PCR foi realizada em alvos seleccionados utilizando conjuntos de ARN derivado de tecidos da próstata humanos. Um grande necessidade clínica é identificar biomarcadores que fornecem informações de prognóstico quanto à progressão da HBP ou que a resposta pode prever a tratamentos, incluindo inibidores da 5-alfa redutase. As proteínas segregadas que podem ser prontamente medidos no sangue são alvos clínicos particularmente atraente. A partir dos perfis de expressão gênica do hormônio manipulado xenotransplantes TZ, potenciais biomarcadores foram sistematicamente selecionados com sobreposição de critérios de bioinformática, empregando WebGestalt. genes alvos foram seleccionados 1) androgénio-regulada dentro nossos dados de microarray, 2) expressos a níveis significativamente mais elevados na próstata relativamente a outros tecidos, e 3) conhecido ou previsto para expressar as proteínas secretadas ou de superfície celular. Estes critérios produziu um conjunto de genes candidatos (Tabela 3), que incluiu alguns biomarcadores anteriormente conhecidas, incluindo
KLK3
,
ACPP
, e
MSMB
, validando ainda mais a nossa abordagem experimental . Outros genes de interesse acrescentado “manualmente” para análise de RT-PCR foram
IGF1
,
IGF1R
,
TGFB1
,
TGFB3
,
TGFBR1
, e
TGFBR2
. Os níveis destes genes alvo de expressão foram medidos em piscinas de ARN preparadas a partir de tecidos TZ designados como tendo alterações BPH suaves, moderados e graves, bem como moderadamente e pouco diferenciados cancro da próstata. RNA para cada categoria de HBP ou próstata tecidos de câncer foi reunido a partir de 5-10 amostras de pacientes. ARN de controlo foi reunido a partir de amostras de pacientes com TZ nenhuma expansão TZ apreciável de hiperplasia glandular e estroma.
Os resultados das análises qRT-PCR estão apresentados na Tabela 4. Os níveis de expressão de ARN foram determinadas por 86 genes biomarcador candidato. Destes, 72 genes foram determinados como tendo uma maior do que 6 vezes maior do que o nível de controlo normal da piscina em pelo menos uma das BPH ou próstata piscinas cancerosas. Em relação ao conjunto de ARN de controlo da próstata, os níveis médios dos BPH ou próstata piscinas de ARN do cancro com os níveis de expressão 1 vezes foram designados como “baixo”, de 1 a 6 vezes foram designados como “moderada”, e 6 vezes foram designados como “alta”. Com base nestes critérios, cada gene foi designado a um dos seis categorias (Tabela 4). Quinze genes eram elevados em ambos câncer BPH e próstata, 41 genes foram elevados em BPH e moderada em câncer de próstata, dois genes eram elevados em BPH e pobre em câncer de próstata, e cinco genes foram moderadas em BPH e rica em câncer de próstata. Não há genes foram encontrados que foram classificados como “baixa” na HBP.
candidatos Genes BPH biomarcadores
Uma série de genes tinham níveis de expressão nas piscinas BPH que aumentaram com a gravidade da doença . Alguns dos genes tinham níveis de expressão que foram particularmente elevadas em BPH, mas relativamente menor nas piscinas de cancro da próstata. Estes genes seria de esperar ter o melhor potencial candidato como biomarcadores BPH, incluindo especificidade em comparação com carcinoma da próstata. Aqueles expressa extracelularmente e com um nível de expressão média, pelo menos três vezes maior em piscinas RNA BPH do que no RNA cancro da próstata piscinas incluídos:
CDH13
,
CHRNB1
,
COL4A5
,
EFEMP2
,
EMP3
,
F10
(16 vezes),
FGF2
,
FGFBP1
(10 vezes ),
IGF1
,
IGF2
(18 vezes),
LIPG
,
RARB
,
ASCG
,
SGCD
,
TGFB1
,
TGFB3
(14 vezes),
TGFBR2
e
TIMP2
da “alta na HBP, moderada em cancro “grupo da próstata;
SMOC1
(26 vezes) na “alta na HBP, baixa no câncer de próstata” grupo; e
SCGB3A1
(15 vezes) e
SCGB1A1
(14 vezes) no “moderado em BPH, baixa no câncer de próstata” grupo.
imuno-coloração para Select genes alvos na patologia caracterizada BPH tecidos
para determinar se as diferenças nos níveis de expressão de ARN observados em tecidos BPH também estavam presentes ao nível da proteína e para caracterizar ainda mais a células epiteliais e /ou do estroma localização do potencial de aumento da expressão , foi realizada imuno-histoquímica (IHC) em microarrays de tecido BPH (TMA). A matriz continha 129 secções de tecido a partir de 43 doentes originais, contendo tecidos com HPB patologias, desde o mínimo para grave, tal como definido em Materiais e Métodos.