Abstract

adesão da superfície celular fraco de linhas de células a superfícies de cultura de tecidos é um problema comum e apresenta limitações técnicas a concepção de experiências. Para superar este problema, vários protocolos de revestimento de superfície têm sido desenvolvidos. No entanto, não foi realizada uma medição em tempo real comparativo e precisa do seu impacto no comportamento das células. A linha celular de cancro da próstata LNCaP, derivada a partir de uma metástase de nódulo linfático paciente, é um sistema de modelo frequentemente usado em pesquisa do cancro da próstata. No entanto, a ligação fraca caracteristicamente das células para a superfície dos recipientes de cultura de tecidos e peças de cobertura tem impedido a sua manipulação e análise e utilização em rastreio de elevado rendimento. Para melhorar a aderência de células LNCaP à superfície de cultura, foram comparados diferentes reagentes de revestimento (poli-L-lisina, poli-L-ornitina, colagénio tipo IV, fibronectina e laminina) e condições de cultura e analisado o seu impacto na proliferação celular, adesão, morfologia, mobilidade e expressão de genes utilizando tecnologias em tempo real. Os resultados mostraram que a fibronectina, poli-L-lisina e poli-L-ornitina células LNCaP melhorada a adesão e provocou alterações na morfologia celular, tais como aumento de área nuclear e celular. Estes reagentes de revestimento também induziu uma maior expressão de F-actina e reduziu a mobilidade celular. Em contraste, laminina e colágeno tipo IV não melhorar a aderência, mas promoveu a agregação celular e morfologia das células afetadas. Células cultivadas na presença de laminina exibida mobilidade mais elevada do que as células de controlo. Todas as condições de revestimento afectado significativamente a viabilidade celular; No entanto, eles não afectou a expressão de genes regulados pelo receptor de androgénio. Nossos resultados comparativos fornecer informações importantes para a selecção das condições ideais de reagentes de revestimento e de cultura para as linhas celulares de cancro em relação ao seu efeito sobre a taxa de proliferação, o apego, a morfologia, a migração, a resposta da transcrição e arranjo citoesqueleto celular.

citação: Liberio MS, Sadowski MC, Soekmadji C, Davis RA, Nelson CC (2014) Efeitos diferenciais de cultura de tecidos revestimento de substratos sobre o cancro da próstata celular adesão, morfologia e comportamento. PLoS ONE 9 (11): e112122. doi: 10.1371 /journal.pone.0112122

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de agosto de 2014; Aceito: 12 de outubro de 2014; Publicação: 06 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liberio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. O financiamento para o estudo foi fornecido pelo Eskitis Instituto Griffith University eo australiano Prostate Cancer Research Centre-Queensland através de financiamento do Departamento do Governo Australiano de Saúde . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

organismo multicelular tecidos o espaço extracelular células circundantes é preenchido com uma mistura de complexo de macromoléculas referidos como a matriz extracelular (ECM). A ECM é composto por polissacarídeos e proteínas, tais como laminina, fibronectina, elastina, colagénio, e a sua quantidade relativa é específica de tecido. Estas proteínas são incorporados num gel de polissacárido. [1] Apesar dos pensamentos iniciais de servir apenas como um andaime para as células, sabe-se agora que a ECM não é apenas estrutural, mas instrutiva, sendo responsável pela regulação do comportamento celular e afetar a sua proliferação, forma, função, migração, sobrevivência e desenvolvimento [2] – [5].

Muitas das proteínas ECM têm a função de adesão importante. [1] A maioria das células são ancoragem-dependente e precisa anexar ao ECM, a fim de sobreviver e proliferar. [6] As integrinas são proteínas transmembranares, sob a forma de heterodímeros ap integrais para a fixação de células de proteínas de ECM. Esta interacção gera uma cascata de sinais intracelulares que pode também controlar a expressão génica diferencial. [7], [8] A resposta de sinalização está relacionado com a composição molecular de ECM que muda de acordo com a resposta de células ao seu micro-ambiente. [9], [10] Desta forma, o ECM está em constante mudança para facilitar os requisitos de células de plasticidade de desenvolvimento. [11] No entanto, pouco se sabe sobre os detalhes moleculares envolvidos na transdução de sinal. A resposta celular aos componentes da matriz extracelular é variável e depende de qual subunidades de integrina são expressas pelas células. Muitos grupos de investigação têm vindo a utilizar proteínas ECM diferentes em cultura de tecidos para modificar o comportamento das células, principalmente a fixação das células. [12] – [15] No entanto, além de aumentar a fixação, as proteínas de revestimento pode afetar outros aspectos da biologia celular, influenciando os resultados finais do ensaio [16]

O adenocarcinoma da próstata humano sensível ao andrógeno. a linha celular, LNCaP, é um dos sistemas modelo mais comumente utilizados em pesquisa do cancro da próstata (CaP). Foi derivada a partir de uma lesão metastática no nódulo linfático de um homem caucasiano de 50 anos de idade, em 1977. [17] Fraca adesão da superfície da célula de linhas de células é um problema comum da investigação de cultura de tecidos e apresenta limitações técnicas para a concepção de experiências . Sua fixação caracteristicamente fraco para a superfície dos recipientes de cultura de tecidos e peças de cobertura têm impedido a sua manipulação, análise e utilização em rastreio de elevado rendimento uma vez que as células LNCaP pode ser facilmente retirados por meio de forças mecânicas modestas, como a tensão de corte de fluido. Para melhorar a aderência de células LNCaP à superfície de cultura, foram comparados reagentes de revestimento diferentes (poli-L-lisina, poli-L-ornitina, colagénio IV, fibronectina, laminina e) condições de cultura e, por exemplo, densidade celular, e analisado o seu impacto sobre a proliferação celular, a adesão, a mobilidade e morfologia com um analisador de células em tempo real (RTCA). Nossas descobertas são um instrumento útil para a selecção dos reagentes e condições de cultura de revestimento ideal para a linha celular LNCaP que diz respeito ao seu efeito sobre a taxa de proliferação, fixação, morfologia e arranjo citoesqueleto celular.

Materiais e Métodos

cultura celular

células LNCaP (cultura de tecidos na Colecção americana, Rockville, MD) foram rotineiramente cultivadas em meio de crescimento RPMI sem vermelho de fenol (Invitrogen) suplementado com 10% (v /v) de FBS (Invitrogen) . As células LNCaP foram propagadas por não mais de 40 passagens.

As condições de revestimento

Foram preparadas Todos os reagentes de revestimento, tal como recomendado pelos fabricantes. O volume e a concentração das substâncias utilizadas para revestir os poços foram de 1,3 ul laminina (LAM, 0,5 mg /ml em H

2O, Invitrogen), o colagénio 1 uL de humano tipo placenta IV (COL, 1 mg /ml em H

2O, Invitrogen), 0,4 mL de fibronectina (FN, 1 mg /ml em H

2O, Invitrogen), e 0,32 mL de poli-L-lisina (PLL, 1 mg /ml em H

2O, Invitrogen). Estes reagentes de revestimento foram misturados com H

2O para um volume total de 50 uL por poço de uma placa de 96 poços. 50 ul de poli-L-ornitina (PLO, 0,01% em H

2O, Sigma-Aldrich) foram adicionados directamente aos poços e as placas foram incubadas durante a noite a 37 ° C em 5% de CO

2. O tempo de incubação para a LAM e FN foi de 4 h, usando as mesmas condições descritas acima. Os poços revestidos foram lavados uma vez com DPBS, seguido imediatamente por sementeira de células. O volume de substâncias de revestimento foi ajustado de acordo com a área de crescimento, quando foram utilizados vasos de cultura diferentes.

analisador de células em tempo real (xCELLigence System)

O analisador de células em tempo real do sistema (RTCA) xCELLigence ( Roche Applied Science) compreende quatro partes principais: o analisador RTCA, a estação RTCA SP, que fica dentro de uma incubadora de cultura de tecidos, o computador com o software RTCA integrada, e um de 96 poços e-placa. A parte inferior do 96-E bem-placa descartável é de aproximadamente 80% coberta com micro-eléctrodos de ouro que monitoram a impedância electrónica, detecção de alterações fisiológicas das células. As células em contacto com o eléctrodo vai agir como isoladores, levando a um aumento na impedância. Assim, a impedância do eléctrodo mudanças proporcionalmente com alterações de número, tamanho e aderência de células que crescem em uma monocamada [18], [19].

As mudanças na impedância são traduzidas como o termo sem unidade

índice de células

(IC). CI = (Zi-Z0) /15, em que Zi é a impedância em um ponto de tempo individuais durante a experiência e Z0 é a impedância no início da experiência. Assim, o IC é uma medida quantitativa e compósito do estado geral das células num poço contendo eléctrodo-[18], [19].

Primeiro, 100 uL de meio completo foram adicionadas a cada poço durante medição do fundo. Em seguida, as células LNCaP foram semeadas em 96 cavidades de E-placa não revestida ou revestida com os reagentes indicados, como descrito acima, a uma densidade entre 9,4 × 10

3 e 6,25 × 10

4 células /cm

2 em triplicado. O E-placa foi deixada a incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos e colocadas no leitor na incubadora para a gravação contínua do índice de células. O E-placa foi incubada durante 96 h a 37 ° C em 5% de CO

2, e a ligação das células foi monitorizada através da IC durante 4 h a cada 2 min. Após este período, o IC foi medida a cada hora durante 92 h.

A proliferação celular e a viabilidade

As células foram semeadas em placas de 96 poços não revestidos ou revestidos com os reagentes indicados, a uma densidade de 1,25 × 10

4 células /cm

2. Crescimento como uma função do aumento da confluência foi medida utilizando o sistema directo de conteúdo de imagem de células IncuCyte HD (Essen Bioscience). As imagens foram tiradas com uma objetiva de 10x em intervalos de 2 horas a partir de 3 poços separados por condição de revestimento e média ± SD de percentuais de confluência foi computado. A actividade metabólica das células cultivadas sobre as diferentes revestimentos foi medida com AlamarBlue após 96 h de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, EUA). A análise cinética foi realizada com o GraphPad Prism (GraphPad Software). Os valores médios de triplicados foram calculados após uma correcção de fundo.

A adesão e a quantificação dos parâmetros morfológicos

células LNCaP foram semeadas numa placa de 96 poços, não revestidas ou revestidas com os reagentes indicados, a uma densidade de 3.12 × 10

4 células /cm

2. Após 24 h, 48 h, 72 h e 96 h, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 min em gelo, permeabilizadas com 0,2% (v /v) de Triton X-100 /PBS durante 10 min, e coradas com CellMask profundo mancha vermelha de plasma de membrana (2,5 ^ g /mL, Invitrogen) e 1 ug /mL de DAPI (Invitrogen). A avaliação da adesão celular foi realizada medindo o número de células deixadas ligado à placa após as etapas de lavagem que utilizam o sistema de imagens conteúdo Opereta alta (PerkinElmer). A área celular parâmetros morfológicos e área de núcleos foram quantificados.

Time-lapse imaging

Superfícies de um poço /placa 6 foram revestidas como descrito acima. As células LNCaP foram semeadas a uma densidade de 1,58 x 10

4 células /cm

2 e monitorizado durante 96 h. A cada 15 minutos uma imagem foi tirada com um microscópio de luz Zeiss Axio Observer (objetiva 20 ×) para acompanhar mudanças de forma e de migração durante o tempo. Os vídeos podem ser encontrados como vídeo S1-S6.

Distribuição de

F-actina

células LNCaP foram cultivadas em tampa de vidro desliza revestido e não revestido com os reagentes indicados para 24 horas e às 96 h. As células foram então fixadas e permeabilizadas tal como descrito acima, seguido por coloração com rodamina-faloidina (01:40, Invitrogen) e 1 ug /mL de DAPI (Invitrogen). Os complexos de imunofluorescência foram visualizados com um microscópio confocal Olympus (FV1000 espectral) usando uma lente de 60 ×. seccionamento óptica foi levada a cabo através da aquisição de uma pilha de imagens em diferentes posições focais ao longo do eixo z.

ferida arranhões ensaio

células LNCaP (3,12 × 10

4 células /cm

2) foram semeadas numa placa de 96 poços de Essen ImageLock (Essen BioScience) não revestidas ou revestidas como descrito previamente, e foram cultivadas até à confluência numa CO

2 incubadora humidificada. Após 24 h, o risco foi feito usando o WoundMaker 96 pinos (Essen BioScience). imagens feridas foram tomadas todas as 1 h para 36 h, e os dados foram analisados ​​pela métrica parte Relativa Wound Densidade integrada do ao vivo de conteúdo IncuCyte sistema de imagens de células HD (Essen BioScience). O experimento foi realizado em triplicado.

Sensibilidade a

sinvastatina

A influência da FN, OLP e revestimento de PLL na sensibilidade das células à sinvastatina foi investigada. As células LNCaP foram semeadas em triplicado e cultivadas em poços de 96 E-placas tal como descrito acima. Após 24 h de incubação, as células foram tratadas com diferentes concentrações de simvastatina (Sigma-Aldrich) e monitorizada a cada 1 h para 60 h, usando o sistema RTCA. O IC

50 para 24 h, 48 h e 72 h de tratamento foram calculados utilizando o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software).

qRT-PCR

Superfícies de 6 bem placa foram revestidas como descrito acima, e as células LNCaP foram semeadas a uma densidade de 1,05 x 10

4 células /cm

2. Após 72 h, o meio de crescimento foi substituído por soro (depleção de androgénio) meio RPMI despojado com carvão (CSS, Invitrogen, EUA) suplementado com 5% (v /v) CSS e as células foram cultivadas durante 48 h. Por fim, as células LNCaP foram tratadas com 20% (v /v) etanol como controlo ou os androgénios R1881 (1 nM) e DHT (10 nM) durante 30 h.

O ARN total foi obtido utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade e a qualidade do ARN foram medidos usando um espectrofotómetro de UV NanoDrop (ThermoFisher Scientific, EUA). As amostras com um rácio 260/280 superior a 2,0 foram usadas para procedimentos subsequentes. As amostras foram tratadas com DNase Amp grau I, e 2 ug de RNA total foi transcrito reverso usando o método de síntese de ADNc para o kit de qPCR (Invitrogen). QRT-PCR foi realizada com SYBR Verde master mix (Invitrogen) usando o rápido Real-Time PCR System 7900HT (Applied Biosystems). Os dados foram analisados ​​com o software SDS2.3 (Applied Biosystems). Os níveis de expressão de mRNA foram calculados pelo método ΔΔCt e normalizado em relação aos níveis do gene arrumação (GAPDH ou RPL32) do respectivo tratamento de expressão e calculada em relação ao controlo não revestido etanol. As sequências dos iniciadores utilizados estão listados na Tabela S1.

Resultados

FN, OLP e PLL melhorar a aderência-substrato celular

O analisador de células em tempo real (RTCA) xCELLigence é uma metodologia de livre-label que mede a taxa de proliferação, a adesão e morfologia com base nas alterações de impedância. Mudanças na impedância são traduzidos como o índice de células unitless termo

(CI). Foram realizadas análises RTCA de células LNCaP semeadas em poços pré-tratadas com os diferentes revestimentos a densidades celulares entre 9,4 × 10

3-6,25 × 10

4 células /cm

2 em uma placa de 96 poços, e investigada tanto a fase de fixação (24 h após a semeadura) (Fig. 1) e a fase de proliferação (24 h a 96 h após a semeadura) da cultura celular (Fig. 2). Supõe-se que a fixação das células para fora da suspensão sobre o substrato e as alterações da morfologia celular associada a este processo foram os principais contribuintes para a indústria durante os primeiros 24 h da experiência (Fig. 1). Assim, a contribuição de proliferação para o IC para este período foi considerado marginal, o qual foi ainda apoiada pelo facto de que as células LNCaP crescidas sob condições semelhantes apresentou um tempo de duplicação de 36 h. [20] De fato, a comparação entre as diferentes densidades de semeadura do controlo e os reagentes de revestimento de 3.12 × 10

4 células /cm

2 em uma placa de 96 após 24 h revelou que PLL aumentou a CI a um semelhante medida como a duplicação do número de células semeadas, ou seja, de 3,12 × 10

4-6,25 × 10

4 células /cm

2 (Fig. S1). Em todas as densidades celulares, revestimento com fibronectina (FN) resultou na maior CI após 24 h, seguido por poli-L-lisina (PLL) e poli-L-ornitina (PLO). PLL e PLO aumentou o IC a taxas muito semelhantes até 3,12 x 10

4 células /cm

2, enquanto que o declive diminuiu PLO em todas as densidades de células (Fig. 2). O revestimento (LAM) laminina não afectou o IC quando comparado com o controlo, enquanto que o colagénio tipo IV (COL) fez com que o CI a subir mais lento. Curiosamente, esta ordem não foi afectada pelo aumento do número de células semeadas. Estes resultados sugeriram que a FN, PLL e PLO aumentou claramente a ligação de células LNCaP, com a proteína da MEC sendo superior aos ácidos poli-amino.

As células foram monitorizados durante 24 h para analisar a adesão célula-substrato a partir de as células de tempo foram adicionadas aos poços (t = 0) usando um analisador de células em tempo real (xCELLigence, Roche). Cada ponto de dados é representado pelos seus meios (n = 3) ± desvio padrão.

As células foram monitorizados durante 72 h, para analisar os efeitos dos revestimentos sobre as células LNCaP 24-96 h, usando um verdadeiro analisador de células -tempo (xCELLigence, Roche). Os dados foram normalizados às 24 h para a comparação das encostas. Cada ponto de dados é representado pelos seus meios (n = 3) ± desvio padrão.

A fase de proliferação foi monitorizada a partir de 24 horas após a sementeira das células a 96 h (Fig. 2). Os principais contribuintes desta fase para mudanças do CI estão proliferação celular, a adesão e morfologia. Em todas as densidades celulares testadas, as células LNCaP crescidas em LAM exibida uma taxa de aumento da IC que era indistinguível do controlo. Em contraste, as células LNCaP cultivadas em substrato COL mostrou uma fase lag onde a CI não aumentou até 48 h após a semeadura, e uma taxa reduzida global da CI origem (Fig. 2B-E). Estes efeitos foram independentes do número de células semeadas. Em todas as densidades de células ao substrato PLL causou uma diminuição detectável no aumento IC. O mesmo efeito foi visível no substrato PLO na maior densidade de sementeira (6,25 × 10

4 células /cm

2, a Fig. 2E), enquanto o IC aumentou mais rapidamente no substrato PLO-revestido em densidades de sementeira mais baixas (Fig . 2A e B). Além de a densidade de células mais baixa (9,4 × 10

3 células /cm

2), o aumento da taxa de IC de células cultivadas em substrato FN foram consistentemente mais elevados do que o controlo (Figuras 2B-E.); um efeito que parecia não ser afectadas por aumentos no número de células semeadas. Tomados em conjunto, altas densidades celulares ( 4,69 × 10

4 /cm

2) afetou negativamente a CI quando as células LNCaP foram cultivadas em substratos revestidos com ácidos poli-amino (PLL e PLO), mas não foram afetados com ECM proteínas (COL, Lam e FN). Esta observação é de particular importância para as experiências de cultura de células onde uma confluência celular elevada é desejável. Além disso, uma densidade de sementeira de 9,4 x 10

3 células /cm

2 foi em geral prejudicial para a cultura celular de células LNCaP, resultando em falta de proliferação de células, que foi provavelmente devido a uma escassez dos contactos célula-célula.

Todas as condições de revestimento reduziu a proliferação celular, mas não afectou fortemente a viabilidade celular LNCaP

o índice de células é uma medida combinada da taxa de proliferação, a adesão e morfologia das células. Assim, os efeitos dos reagentes de revestimento sobre cada um destes parâmetros foram investigados separadamente. A densidade de células das cavidades revestidas aumento mais lento do que os poços não revestidos. As células cultivadas em FN, PLL, PLO e LAM apresentado taxas de crescimento similares (Fig. 3a). colágeno tipo IV foi a substância de revestimento que impactou negativamente a proliferação celular a mais. O exame da actividade de viabilidade /metabólica de células LNCaP crescidas durante 96 horas em diferentes substratos de revestimento por ensaio AlamarBlue revelou que todos os reagentes de revestimento reduziu a viabilidade celular, com COL, ligeiramente pior do que os outros revestimentos (Fig. 3B). Este efeito foi semelhante aos resultados obtidos para confluência bem sobre diferentes revestimentos (Fig. 3A). Tomados em conjunto, estes resultados mostraram que os reagentes de revestimento afectada a proliferação celular e a actividade do metabolismo de células LNCaP.

células LNCaP foram semeadas a 1,25 × 10

4 células /cm

2 sobre um poliestireno de 96 poços -plate não revestidas ou revestidas com poli-L-ornitina, poli-L-lisina, o colagénio tipo IV, laminina ou fibronectina. (A) Wells confluência foi monitorado a cada 2 h para 96 ​​h usando o sistema IncuCyte. (B) actividade de viabilidade /metabólica celular foi medida pelo ensaio AlamarBlue após 96 h. Cada ponto de dados é representado pelos seus meios (n = 3) ± desvio padrão. Resultados significativos (p 0,05). são marcados com um asterisco

COL e células LNCaP LAM induzida para agregar

IncuCyte imagens revelaram que as células LNCaP foram ligado à superfície em todos revestimento condições após 24 h (Fig. 4A). As células cultivadas em poços pré-revestidos com FN, PLL, plo, LAM, assim como o controle exibido uma forma do tipo fibroblastos típico para células LNCaP. [21] Em contraste, as células LNCaP cultivados em COL, tinha uma forma redonda. As células cultivadas em COL e LAM também tendiam a agregar-se. Além disso, os poços revestidos com FN LAM e continham mais células redondas quando comparado com os outros substratos de revestimento (fig. 4A). O mesmo foi observado após 96 h (Fig. 4B). Após 96 h, a maior parte das células adquiriram uma forma de fuso em todas as condições de revestimento. Células no COL cresceu em agregados às 96 h (Fig. 4B).

células LNCaP fotografada após 24 h (A) e 96 h (B) com sistema de IncuCyte, 10 ×. Barra de escala = 300 pm. tiros (C) de pressão do 96 h lapso de tempo de microscopia de vídeo de células LNCaP. As setas indicam lamelip�ios de células polarizadas. Barra de escala = 50 mm (20 ×, Zeiss Axio Observer).

A fim de investigar o efeito dos reagentes de revestimento sobre a mobilidade e morfologia celular mais detalhada, em tempo real, as células LNCaP foram estudados por microscopia de lapso de tempo de alta ampliação. Semelhante à experiência IncuCyte, microscopia de lapso de tempo mostraram que COL e LAM (Fig. 4C) causada células LNCaP para formar agregados. Além disso, células cultivadas em poços revestidos com LAM apresentada a presença de numerosas células polarizadas, caracterizado pela presença de células assimétricos. As amostras PLL- e PLO-tratadas apresentaram uma morfologia semelhante quando comparado com o controlo. No entanto, LNCaP semeadas sobre estes substratos parecia unir mais rapidamente do que as células de controlo e migram menos. Vídeos da microscopia de lapso de tempo durante um período de 96 horas pode ser encontrado em vídeo S1-S6.

células LNCaP prender melhor a superfícies revestidas com FN, OLP e PLL, que também afetam a morfologia das células

Anexo celular e morfologia, que compõem parte do CI, foram investigados pela alta de triagem de conteúdo (HCS). HCS de células LNCaP medido uma densidade de células muito mais elevada (melhor fixação) após pré-tratamento de poços com PLO ou PLL quando comparado com o controlo, FN, COL ou LAM em todos os pontos de tempo (Fig. 5a). Células cultivadas na presença de FN ligado melhor do que as células de controlo às 72 horas e às 96 horas. No que diz respeito a alterações na morfologia celular, a área do núcleo e a área total de células foram afectadas por todos os revestimentos (Figs. 5B e 5C). Células cultivadas em PLO, PLL e FN para 96 ​​h mostraram aumento áreas nucleares e celulares de pelo menos 8% e 18%, respectivamente, quando comparado ao controle. Relativamente ao controlo, col e LAM diminuiu as zonas nucleares e celulares por 7% e 10%, e 15% e 14%, respectivamente.

As células foram analisadas quanto densidade celular (A), a área nuclear (B ) e área de celular (C) em quatro momentos diferentes, utilizando um instrumento de rastreamento alto teor (Opereta).

os diferentes reagentes de revestimento afectada organização F-actina

Para investigar as mudanças na morfologia celular e a mobilidade de células de LNCaP em mais detalhe, foi realizada microscopia de fluorescência confocal e investigou a organização de F-actina de células LNCaP, tais como a presença de lamelip�ios às 24 h (Fig. 6A) e 96 horas (Fig. 6B) pós-semeadura. Estas estruturas consistem em filamentos de actina paralelas-empacotado que sondam o substrato para decidir onde e como as adesões focais devem ser estabelecidos para a fixação. Além disso, estes filamentos de contribuir para a formação de fibras de stress de actina. [22], [23] A adesão e disseminação de células envolve a remodelação do citoesqueleto. estruturas dinâmicas chamados contactos focais formar em torno integrinas nos locais de adesão. As integrinas estão ligados a componentes da matriz extracelular, de um lado, e para filamentos de actina chamadas fibras de stress sobre o outro lado. A aplicação de força em uma reacção causa por outro lado, e isso, juntamente com as vias de sinalização da integrina, determina a forma da célula. [3] De acordo com os resultados observados no ensaio de microscopia de lapso de tempo, observou-se muitas células polarizadas após 24 h de FN e lamelas de vidro tratadas com LAM (Fig. 6A). Além disso, depois de 96 horas observou-se que as fibras se tornaram mais desorganizado com alguma acumulação de actina cortical em torno do corpo da célula e um número reduzido de fibras de stress na presença de NF (Fig. 6B). Além disso, FN causou um aumento substancial na coloração de actina, e as células perderam a sua polaridade (Fig. 6B).

As células foram cultivadas na tampa de vidro desliza sem revestimento (controlo), ou revestidos com fibronectina (FN), laminina (LAM), poli-L-lisina (PLL), poli-L-ornitina (PLO), ou colagénio do tipo IV (COL IV). Depois de 24 h (A) ou 96 h (B), as células foram coradas para a F-actina com faloidina com rodamina, contrastadas com DAPI, e analisadas por microscopia de fluorescência confocal (60 ×, Olympus). As setas indicam lamellipodia de células polarizadas e flecha cabeças marcar filopódios. Barra de escala = 50 uM.

Células cultivadas na presença de PLL e PLO (Fig. 6) exibiu um padrão de actina mais difusa com alguma coloração actina concentrada na periferia das células em 24 h e 96 h . Foram observados a presença de muitos feixes de actina e filamentos de actina radialmente estendidas em torno das células, que são chamados filopódios,. Os núcleos das células cultivadas em PLL exibida uma forte intensidade de DAPI a 24 h (Fig. 6a), o qual foi reduzido em 96 h (Fig. 6B). Além disso, os núcleos aumentados em tamanho após 96 h.

Às 24 h, as células nos poços revestidos com COL (Fig. 6A) mostrou um padrão semelhante ao da actina do controlo. No entanto, após 96 h de crescimento, os filamentos de actina tornou-se mais organizada do que no controle (Fig. 6B).

PLL, PLO, ou FN-revestidos poços aumentar a fixação de células LNCaP e ligeiramente diminuição da mobilidade celular , enquanto a LAM aumenta migração

As alterações morfológicas são normalmente associados com alterações de outras características celulares, incluindo a motilidade, diferenciação e atividade metabólica. [24] Para resolver esta possibilidade, a motilidade de células LNCaP crescidas em poliestireno tratadas com os diferentes reagentes de revestimento foi avaliada em um ensaio de cicatrização da ferida (Fig. 7). As células LNCaP foram semeadas durante 24 h em poços revestidos com FN, LAM, PLL, PLO ou COL, e a monocamada de células foi riscada usando um 96 pinos WoundMaker. A qualidade das feridas gerados no PLL, plo, ou poços FN-revestidos foram superiores aos do controlo (sem revestimento) e LAM, como julgado pela suavidade relativa das bordas do arranhão, bem como uma área de ferida muito semelhante (Fig . S2). Outra observação foi que as células LNCaP cultivadas em PLO ou poços tratados com PLL colonizado o bem em um padrão semi-organizados, em que os corpos celulares foram alongados alinhados em paralelo (Fig. S2). Pré-tratamento com LAM não melhorou a adesão das células LNCaP, quando comparado com o controlo, e o WoundMaker feridas com bordas irregulares e de área diferente gerado. células LNCaP desalojado como folhas grandes de células de poços tratados com COL quando processado com o WoundMaker (dados não mostrados), indicando que COL foi inferior a poços não revestidos e não é adequado para esta aplicação. A análise da densidade ferida relativa mostrou que as células cultivadas na presença de LAM migraram mais rapidamente em 62% da área da ferida do que as células de controlo após 36 h (Fig. 7). Em comparação, o PLL, e PLO FN causada células LNCaP migrar mais lento do que o controlo, indicando uma redução de densidade de feridas por 15%, 33% e 20% cultivadas sob estas condições, respectivamente. Notavelmente, células LNCaP apresentou um tempo de duplicação cerca de 36 h, tal como observado nas experiências RTCA, [20] o que sugere que os efeitos observados para a densidade da ferida foram predominantemente causada pela migração celular e a proliferação não.

Densidade Relativa ferida em diferentes pontos de tempo de células LNCaP durante um período de 36 h. As medições são feitas a partir de feridas numa monocamada de células de LNCaP em cultura na presença de diferentes tratamentos de revestimento e de controlo.

PLL sensibiliza células LNCaP para o inibidor HMGCR simvastatina

Estudos anteriores têm mostraram que o pré-revestimento com componentes da matriz extracelular pode afectar a sensibilidade das células a várias drogas. Por exemplo, a LAM ea FN foram relatados para aumentar a resistência à radiação ionizante e ao fármaco citotóxico Ukrain em tumores humanos e células normais

em

vitro

. [25] Para além disso, foi relatado que a adesão a uma síntese de colesterol induzida substrato FN através da activação de HMGCR e também o aumento da síntese de ácidos gordos em fibroblastos humanos e células de hepatoma de rato, enquanto que um substrato de PLL ou FN na solução não teve nenhum efeito sobre estas vias [ ,,,0],26].

Assim, o efeito dos reagentes de revestimento de PLL, e PLO FN sobre a sensibilidade das células LNCaP para a sinvastatina HMGCR inibidor foi investigado por RTCA, e o IC foi calculada para períodos de tratamento

50 de 24 h, 48 h e 72 h (Fig. S3). efeitos da LAM e COL não foram analisados ​​por estes reagentes de revestimento teve efeitos adversos sobre LNCaP adesão da superfície celular e causou a agregação celular. Enquanto o IC

50 para a simvastatina era relativamente semelhantes entre os quatro condições de revestimento a 24 h, de PLL aumentou a sensibilidade das células LNCaP ao inibidor HMGCR por duas vezes após 48 h de tratamento, quando comparado com o controlo (Fig. S3) . Às 72 h, as células LNCaP crescidas sobre um substrato de PLL apresentada uma de três vezes mais baixa do IC

50. Da mesma forma, PLO e FN aumentou a sensibilidade das células LNCaP a simvastatina pela relativa de duas vezes para o controlo às 72 horas. No entanto, tem-se observado que PLO, PLL e FN reduziu a viabilidade celular de um terço em 96 h (Fig. 3B). Assim, a sensibilização das células LNCaP pela PLO e FN para simvastatina pode ser, na verdade, o efeito destes revestimentos sobre a viabilidade celular. Neste caso, apenas PLL pode sensibilizar células LNCaP significativamente para a sinvastatina inibidor HMGCR de um modo dependente do tempo.

andrógeno capacidade de resposta e de sinalização AR eram, em geral, não é afectado pelas condições de revestimento

do epitélio da próstata humano adulto saudável, a expressão de AR e a adesão de células ao substrato ocorrem em camadas de células distintas, a saber, em luminal e células basais. Assim, as vias de sinalização AR e adesão celular é provável que interajam diretamente. [29] Durante o desenvolvimento do cancro da próstata, células epiteliais luminais malignas mudar de adesão célula-célula para a adesão de células-substrato, e sinais de adesão celular e AR são co-expressos. [27] A linhagem de células LNCaP é um importante sistema modelo para o estudo do receptor de androgénio (AR) mediada por sinalização no cancro da próstata. Recentemente, foi demonstrado que muda de contactos célula-célula e a matriz extracelular alterou a resposta de células LNCaP de androgénios.