Abstract

O câncer de esôfago é um dos cânceres mais comuns, ea taxa de sobrevida em 5 anos é inferior a 10%, devido à falta de agentes terapêuticos eficazes. Este estudo foi avaliar a atividade antitumoral do Ec-LDP-Hr-AE, uma proteína energizado-enediina biespec�ica recentemente desenvolvido fusão segmentação tanto do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e do receptor do factor de crescimento epidérmico 2 (HER2), no câncer de esôfago. A proteína de fusão Ec-LDP-Hr-AE consiste de dois ligandos de oligopéptido e uma lidamycin antibióticos de enediina (LDM) para ligação ao receptor e de morte celular, respectivamente. O presente estudo demonstrou que Ec-LDP-Hr teve alta afinidade para se ligar ao carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) células, e proteína de fusão energizado-enediina Ec-LDP-Hr-AE mostrou potente citotoxicidade para as células CICAc com expressão diferencial de EGFR e HER2. Ec-LDP-Hr-AE poderia causar paragem significativo G2-M em EC9706 e KYSE150 células, e que também induziu apoptose em células CICAc de um modo dependente da dosagem. Western blot mostrou que Ec-LDP-Hr-AE promovido caspase-3 e caspase-7 actividades, bem como a clivagem PARP. Além disso, Ec-LDP-Hr-AE inibiu a proliferação celular por meio de diminuir a fosforilação do EGFR e HER2, e ainda mais exercida a inibição da activação das suas moléculas de sinalização a jusante.

In vivo

, na dose tolerada, Ec-LDP-Hr-AE inibiu o crescimento tumoral em 88% quando foi administrado a ratinhos nus portadores de célula humana CICAc KYSE150 xenoenxertos. Estes resultados indicaram que Ec-LDP-Hr-AE exibiu potente eficácia anti-Caner em ESCC, sugerindo que poderia ser um candidato promissor para terapia-alvo de câncer de esôfago

Citation:. Guo XF, Zhu XF, Yang WC , Zhang SH, Zhen YS (2014) Um EGFR /HER2-biespec�icos e Proteína enediina-energizado Fusão apresenta alta eficácia contra câncer de esôfago. PLoS ONE 9 (3): e92986. doi: 10.1371 /journal.pone.0092986

editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de novembro de 2013; Aceito: 27 de fevereiro de 2014; Publicação: 24 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado em parte pelo Projeto de Pesquisa de Ciências Naturais do Departamento da província de Henan, China (No. 12B350004 para XFG), National Natural Science Foundation da China (No. 81.202.447 para XFG, https://www.nsfc.gov Educação. cn /Portal0 /default152.htm), e uma bolsa da USCACA (No. USCACA-TIGM-001 a CJT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de esôfago é um dos cânceres mais comuns, bem como a sexta causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. As regiões do norte da província de Henan da China tem a maior incidência de câncer de esôfago, particularmente o carcinoma epidermóide de esôfago (ESCC) [1], [2]. Embora muitas opções de tratamento estão agora disponíveis, incluindo cirurgia, estratégias modalidade combinadas, como a quimioterapia pré ou pós-operação com ou sem radiação, e chemoradiation definitiva, o prognóstico de câncer de esôfago é pobre com uma taxa de sobrevida de 5 anos menos de 10% [3] – [5]. Devido às desvantagens dos agentes de quimioterapia, como a efeitos colaterais graves tóxicos, a incidência elevada de droga-resistência, e poucos efeitos sobre a sobrevivência, existe uma necessidade urgente para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos eficazes, segmentação anormalidades moleculares específicos em esofágica . carcinomas, especialmente os do receptor do factor de crescimento epidérmico humano (HER) da família [6]

a sua família de receptores tirosina quinase contém quatro membros: HER1 /EGFR, HER2 /neu, HER3 e HER4. A ligação do ligando aos receptores resulta na dimerização do receptor, em seguida, inicia uma série de acontecimentos intracelulares que, eventualmente, promover o crescimento celular, a proliferação, diferenciação e migração [7]. A sobre-expressão do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e o receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) tem sido observado em muitos cancros humanos, tais como o pulmão, cabeça e pescoço, mama, ovário, e eles têm sido mostrados para desempenhar papéis importantes em ambos formação e progressão de muitos cancros que ocorrem vulgarmente [8]. No câncer de esôfago, EGFR superexpressão ocorre em 30% -90% [9], [10], e gamas de superexpressão de HER2 de 19% -43% [11]. Além disso, observou-se a sobre-expressão de ambos o EGFR e HER2 em 18% -25% dos pacientes com cancro do esófago [12], [13]. Portanto, um agente de direccionamento ambos o EGFR e HER2 exibiriam efeitos terapêuticos mais eficazes em doentes com cancro esofágico.

Ec-LDP-Hr-AE, uma proteína de fusão biespecífica que consiste em dois oligopéptidos (CE, de 22 aminoácidos de EGF e Hr, a região VH CDR3 do anticorpo anti-HER2 C6.5) específico para EGFR e HER2, e um lidamycin antibiótico enediina (LDM), foi construído e consta em nosso estudo anterior [14]. Ele mostrou citotoxicidade potente para uma variedade de células de carcinoma in

in vitro

, e foi altamente eficaz na inibição do crescimento de Caner ovário humano SK-OV-3 xenoenxertos

in vivo

. No entanto, a eficácia antitumoral de Ec-LDP-Hr-AE sobre cancro esofágico não está bem estudada. Neste estudo, nós não só mediram a afinidade de ligação da proteína de fusão Ec-LDP-Hr às células Caner esôfago, mas também avaliou a potência de fusão energizado proteínas

in vitro

e

in vivo

. Os efeitos de Ec-LDP-Hr-AE sobre a distribuição do ciclo celular e apoptose foram também ensaiadas. Para elucidar os mecanismos envolvidos na citotoxicidade e apoptose-indução de Ec-LDP-Hr-AE, a expressão de moléculas relacionadas a apoptose e moléculas-chave nas vias de sinalização SEUS foram analisados ​​também.

Materiais e Métodos

Ética declaração

fêmea camundongos BALB /c nu (6-8 semanas) utilizado nos experimentos foram adquiridos no Instituto de Ciências Animais de laboratório, da Academia chinesa de Ciências Médicas, e hospedados sob patógeno específico condições -free. O protocolo experimental foi aprovado pelos Experimentação Animal da Comissão de Ética do Instituto de Medicinal Biotecnologia, da Academia Chinesa de Ciências Médicas.

As linhas celulares e cultura

esôfago humano linhas celulares de carcinoma EC1, ECa109, EC9706 e KYSE150 e rato linha de células de fibroblastos NIH 3T3 foram obtidos a partir do Centro celular de Pequim União Medical College, China, e cultivadas sob uma atmosfera húmida de 5% de CO

2 a 37 ° C em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino ( FBS, Gibco, Carlsbad, CA, EUA), 2 mmol /L de glutamina, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina.

Reagentes e anticorpos

(3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2, brometo de 5-difenil-ltetrazolium (MTT), isotiocianato de fluoresceína (FITC) e isopropílico-β-D-thiogalactopranoside (IPTG) foram adquiridos da Sigma Chemical Aldrench Inc. (St. Louis, MO, EUA). Todos os anticorpos, incluindo fosforilado-HER2, -EGFR, -Akt, proteína quinase regulada -extracellular (ERK), -p38 activada por mitogénio proteína quinase (MAPK), -C-Jun quinase N-terminal ( JNK) e anticorpos monoclonais anti-EGFR, -HER2, -Akt, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -caspase 3, -caspase 7, anticorpos de PARP -cleaved foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Os anticorpos anti-β-actina foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Peroxidase de rábano (HRP) -conjugated de cabra anti-coelho /anticorpos de ratinho também foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology.

Preparação de proteínas de fusão energizados

A preparação da proteína de fusão biespecífica Ec-LDP- suas proteínas de fusão correspondente monoespecíficos Ec-LDP-AE e LDP-hr-AE Hr-AE e foram descritos em nosso estudo anterior [14]. Resumidamente, fragmentos de DNA que codificam para Ec-LDP-Hr, Ec-LDP e LDP-Hr foram obtidos por técnicas de clonagem de PCR e DNA, e então eles foram inseridos em pET30a vector para gerar a plasmídeos de expressão PET

Ec-LDP- Hr

, PET-

Ec-LDP Comprar e PET

LDP-Hr

. Estes plasmídeos foram então transformados em

Escherichia coli BL21

(

DE3), e as proteínas de fusão foram expressas por adição de IPTG. As proteínas de fusão foram extraídos do espaço periplasmático de

E.coli

pelo método de choque osmótico (manual do sistema de pet, 9

th edição, Novagen) e purificado por cromatografia de afinidade (coluna HisTrap HP, GE Healthcare) . As proteínas de fusão energizado Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE e LDP-Hr-AE foram construídos através da integração do cromóforo enediina ativa (AE) de lidamycin no Ec-LDP-Hr, Ec-LDP e LDP- proteínas h, respectivamente.

a afinidade de ligação ensaio

Um teste de imunofluorescência baseados em citometria de fluxo foi utilizada para medir a afinidade de ligação da proteína de fusão Ec-LDP-Hr para as células de câncer de esôfago [15] . A proteína Ec-LDP-HR foi marcado com FITC durante 16 horas numa solução tampão de carbonato (100 mmol /L de NaHCO

3, 10 mmol /L de Na

2CO

3, pH 9,0) a 4 ° C . proteína marcada foi separada do FITC não ligado, utilizando Sephadex G-25 de coluna (GE Healthcare). Em seguida, a proteína Ec-LDP-Hr marcado com FITC foi incubada com 10

6 EC9706 células, KYSE150 células ou células NIH 3T3 em um volume de 100 ul de tampão (PBS + FBS a 2%) durante 2 h à temperatura ambiente. Após três lavagens com 500 ul de tampão, as células foram analisadas com citometria de fluxo (BD Company). Os dados foram analisados ​​com o software Prism 5 (GraphPad Software).

Ensaio MTT

As células foram descoladas por tripsinização e plaqueadas em placas de 96 poços de fundo plano, cultivadas durante 24 h antes da exposição ao várias concentrações de LDM, Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE ou LDP-Hr-AE durante 48 h. solução de MTT (5 mg /ml, 20 ul) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante mais 4 h a 37 ° C. O sobrenadante foi removido e 150 ul de DMSO foi adicionado a cada poço. A absorvância a 570 nm foi medida utilizando um instrumento Espectro Multiskan (Thermo Labsystems, Rochford, IL, EUA). Os valores de absorvância foram expressos como uma percentagem do que para as células não tratadas, e as concentrações dos agentes testados, resultando em inibição do crescimento de 50% (IC

50) foram calculados.

A análise da distribuição do ciclo celular

Os efeitos da proteína de fusão biespecífica Ec-LDP-Hr-AE no ciclo celular foram avaliadas utilizando coloração com iodeto de propídio (PI). Após o tratamento com 0,1 nmol /L, 0,5 nmol /L e 1 nmol /L EC-LDP-Hr-AE durante 48 h, e EC9706 KYSE150 células foram digeridos por tripsina-EDTA e lavadas com PBS. As células foram então ressuspensas em 500 ul de PBS com 50 ug /ml de PI e 100 ug /ml de RNase A. Após incubação a 37 ° C durante 30 min, as células foram analisadas por fluorescência com um citómetro de fluxo (BD Company).

celular apoptose ensaio

Os efeitos da proteína de fusão biespecífica Ec-LDP-Hr-AE sobre indução de apoptose em células CICAc foram medidos usando coloração Hoechst e anexina V-FITC coloração /PI. Para a coloração Hoechst, KYSE150 células foram cultivadas em coverslides e incubou-se durante 24 h, em seguida, foram adicionados 0,1 nmol /L, 0,5 nmol /L e 1 nmol /L EC-LDP-Hr-AE e incubou-se durante mais 48 h. As células em coverslides foram fixadas com metanol, lavada com PBS, e coradas por 1 mg /ml de Hoechst 33342 durante 15 min. As imagens foram observados sob um microscópio de fluorescência (Nikon TE 2000 U). Para Anexina V-FITC coloração /PI, as células apoptóticas foram medidas por um kit de FITC-anexina V /PI coloração (tecnologia Biosea). Depois de 0,1 nmol /L, 0,5 nmol /L e 1 nmol /L de tratamento Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h, as células foram colhidas, lavadas duas vezes com PBS, e centrifugou-se a 1000 rpm durante 5 min. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 500 ul de tampão contendo 10 jil de anexina V-FITC e PI 5 ul de ligação, incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos, e, em seguida, analisadas por fluorescência com um citómetro de fluxo (BD Company).

análise de Western blot

células foram lisadas durante 30 min no ensaio de radio-imunoprecipitação (RIPA) tampão continha vários inibidores da protease (por exemplo, 1 ug /mL de aprotinina, 10 ug /mL de leupeptina, 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 2 mmol /L NAVO

4, e 50 mmol /L, NaF). Proteína extraída a partir de células foi quantificada utilizando o kit de ácido bicinconínico (Pierce Biochemicals), e 30 ^ g de cada proteína total foram aplicadas em 10% SDS-PAGE e então electrotransferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore). As membranas foram incubadas com 1% de BSA durante 2 h à temperatura ambiente antes da incubação durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários diluídos (1:1000 com tampão TBST, Cell Signaling Technology). Em seguida, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP (1:5000 diluição; Cell Signaling Technology) durante 1 h após a lavagem três vezes com tampão de TBST. As bandas específicas foram visualizados com o kit Immobilon Ocidental Quimioluminescentes HRP Substrato (Millipore) e capturado por ChemiImager 5500 sistema de imagem (Alpha Innotech Corp.).

In vivo

ensaio de eficácia

In vivo

eficácia de proteínas de fusão energizados foi avaliada em um modelo de rato nu KYSE150 xenotransplantes. 1 × 10

7 KYSE150 células suspensas em 200 ul de PBS foram inoculadas s.c. na axila direita de ratos nus. Após 3 semanas, os tumores foram retirados de ratinhos nus e dissecados assepticamente na solução salina estéril. Os pedaços de tecido de tumor (mm 2

3 em tamanho) foram então transplantadas para a axila direita de ratinhos nus por um trocarte, e a ferida foi selada por colódio. ratinhos portadores de tumor foram divididos aleatoriamente em 3 grupos (n = 7), quando o tamanho do tumor foi superior a 100 mm

3 (cerca de 10 dias mais tarde). i.v. Lidamycin (0,05 mg /kg) e proteína de fusão biespecífica Ec-LDP-Hr-EA (0,3 mg /kg) foram injectados na veia da cauda e administrados num volume de 200 ul de PBS no dia 11 e dia 21, respectivamente. O grupo de controlo de ratinhos recebeu 200 ul de PBS tratamento ao mesmo tempo como proteínas de fusão. O tamanho do tumor foi medido a cada três dias e volume do tumor foi determinada pelo comprimento x largura

2/2. As taxas de inibição foram calculados por 1 -. Volume do tumor (tratado) /volume do tumor (controle) × 100%

A análise estatística

Os resultados dos dados quantitativos deste estudo foram apresentados como ± médios SD. Diferenças entre os grupos foram analisados ​​estatisticamente não pareado bicaudal t-teste, e P-valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Preparação de proteínas de fusão energizados

de acordo com a nossa abordagem anterior, os genes que codificam para proteínas de fusão Ec-LDP-RH, Ec-LDP, e LDP-HR foram construídos e as proteínas codificadas foram expressas no espaço periplásmico de

E.coli

. As proteínas de fusão foram purificadas por Ni

2+ cromatografia de afinidade e a pureza das proteínas de fusão foi tudo acima de 90% conforme determinado por SDS-PAGE e alto desempenho de líquido-cromatograf ia (HPLC). O cromóforo enediina ativa (AE) da LDM e três proteínas de fusão foram reconstituídos

in vitro

para gerar as proteínas de fusão energizados Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE e LDP-Hr-AE. Os resultados de HPLC de fase reversa mostrou que as três proteínas de fusão energizadas foram montadas com sucesso.

afinidade de proteína Ec-LDP-Hr às células cancerosas esofágicas

EC9706 células, e KYSE150 células NIH 3T3 Binding as células foram incubadas com várias concentrações de FITC-Ec LDP-RH, e as intensidades de fluorescência foram medidos por citometria de fluxo. As intensidades de fluorescência média (IFM) de células EC9706 e KYSE150 Tanto as células aumentou significativamente (P 0,05), o que indicava Ec-LDP-HR tinha uma actividade de ligação forte para as células cancerosas esofágicas (Fig 1A, 1C). No entanto, as IMFs de células NIH 3T3 não mostrou aumento significativo, o que significava Ec-LDP-Hr foi incapaz de se ligar ao EGFR e as células NIH 3T3 negativas HER2 (Fig 1E). De acordo com a IFM e as concentrações Ec-LDP-RH, a afinidade de ligação (

d K) valores foram calculados com o software Prism 5. O K

d valores de Ec-LDP-Hr ligados a EC9706 e KYSE150 células foram 5,283 mmol /L e 3,562 mmol /L, respectivamente (Fig. 1B, 1D).

EC9706 células (A) , KYSE150 células (C) ou células NIH 3T3 (e) foram incubadas com proteína de Ec-LDP-Hr marcado com FITC em concentrações indicadas, e as intensidades de fluorescência média (IFM) foram analisadas por citometria de fluxo. O aumento das concentrações de proteínas de LDP-Ec-HR marcados com FITC foram incubadas com células EC9706 (B) ou células KYSE150 (D). Seguindo FACS, as IMFs foram plotados contra as concentrações de proteína.

Citotoxicidade de proteínas de fusão energizados

in vitro

A citotoxicidade do biespec�ica energizado proteína de fusão Ec-LDP- HR-AE foi efectuada em quatro linhas de células humanas de carcinoma de célula escamosa esofágica (CICAc) que expressam diferentes níveis de EGFR e HER2 e o EGFR /HER2 células NIH 3T3 negativas, utilizando ensaios de MTT (Fig. 2a). LDM e proteínas de fusão monoespecif icos energizado Ec-LDP-AE e LDP-Hr-AE foram também testados para comparação. Como mostrado na Fig. 2B, o biespec�ica energizado proteína de fusão Ec-LDP-Hr-AE matou ambas as células CICAc e células NIH 3T3 com potência muito alta. O IC

50 valores de Ec-LDP-Hr-AE para 4 células CICAc estavam abaixo do 10

-10 mol /L de nível (Fig. 2C). No entanto, a proteína Ec-LDP-Hr-AE biespecífico não foi sempre mais potente do que os homólogos monoespecíficos e LDM. Os resultados da análise estatística revelou que as diferenças de IC

50 valores de LDM, Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE e LDP-Hr-AE para o EC-1, ECa109 e EC9706 células não foram estatisticamente significativas . Mas as diferenças em IC

50 valores para KYSE150 células foram significativas (P 0,05). Além disso, IC

50 valor de Ec-LDP-Hr-AE para células NIH 3T3 não apresentaram diferenças significativas quando comparado com as quatro células CICAc.

(A) A expressão de EGFR e HER2 no esôfago diferente células cancerosas e células NIH 3T3 analisados ​​por Western blot. (B) A célula matando efeitos da Ec-LDP-Hr-AE em linhas de células de câncer de esôfago KYSE150, EC9706, ECa109 e EC-1 e linha de células de fibroblastos de rato NIH 3T3 foram testados por ensaios de MTT. As células foram expostas a várias concentrações de Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h e os resultados foram obtidos a partir de três experiências independentes. (C) A IC

50 valores de lidamycin (LDM), EC-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE, e LDP-Hr-AE contra 4 tipos de células cancerosas esofágicas e células NIH-3T3 foram medidos pela ensaio MTT. Colunas, com média de experiências em triplicado, bares, SD.

Efeitos da proteína de fusão biespecífica Ec-LDP-Hr-AE sobre a distribuição do ciclo celular

EC9706 e KYSE150 células foram expostas a 0,1 , 0,5 e 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h, e a distribuição do ciclo celular foi avaliado por coloração com PI e análise de citometria de fluxo. As células de controlo (EC9706 e KYSE150) distribuídas em fase G2-M foram 10,51% ± 0,98% e 6,26% ± 1,96%, respectivamente, enquanto que as células tratadas com 0,1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE distribuídas em fase G2-M foram 86,00% ± 0,98% e 89,36% ± 0,71%, respectivamente. Estes dados indicaram que uma prisão significativa G2-M foi causada pelo tratamento Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 3). Embora tenha havido uma grande mudança (cerca de 12,84% ~31.53% de aumento) na fase G2-M após a exposição a 0,5 nmol /L e 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE, as células distribuídas em fase G2-M foram menor do que a tratada com 0,1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE, o que indicou que as células em fase G2-M atingiu o pico com 0,1 nmol /L de tratamento Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 3).

EC9706 células ou KYSE150 células foram expostas a Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h nas concentrações indicadas e a distribuição do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo, após coloração com PI. Colunas, com média de experiências em triplicado, bares, SD.

Efeitos da proteína de fusão biespecífica Ec-LDP-Hr-AE sobre a apoptose

Os resultados da Hoechst 33342 mancha e anexina V- Os ensaios de coloração /PI FITC revelou que as células apoptóticas (EC9706 e KYSE150) aumentaram significativamente em uma maneira dependente da dose, após tratamento com Ec-LDP-Hr-AE. A coloração de Hoechst 33342 foi usada para detectar as alterações na morfologia nuclear. Os núcleos das células não tratadas eram de aparência normal e exibiram coloração difusa da cromatina. Após a exposição a diferentes concentrações de Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h, KYSE150 células apresentaram alterações morfológicas típicas da apoptose, tais como a condensação da cromatina ou um núcleo encolhido (Fig. 4A). Como mostrado na Fig. 4B, as proporções de células EC9706 apoptóticas, após tratamento com 0,1, 0,5 e 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE foram de 15,06% ± 0,29%, 38,10% ± 0,64% e 50,00% ± 0,39%, respectivamente, que mostrou significativa aumenta em comparação com células de controlo (P 0,01). As células em apoptose também aumentou muito para as células KYSE150 após a exposição a 0,1, 0,5 e 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE, com os rácios de apoptose de 16,29% ± 0,35%, 21,54% ± 0,51% e 32,99% ± 0,38%, respectivamente (P 0,01 versus controlo, Fig 4C.). Além disso, Ec-LDP-Hr-AE induziu apoptose em EGFR HER2 células /negativas NIH 3T3, e as proporções de células apoptóticas, após tratamento com 0,1, 0,5 e 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE foram de 16,47% ± 0,44%, 15,28% ± 0,45% e 19,90% ± 0,12%, respectivamente. As células NIH 3T3 apoptóticas foram significativamente menos do que a de EC9706 células e KYSE150 células nas dosagens de exposição de 0,5 nmol /L e 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE (P . 0,05, Fig 4D).

(a) KYSE150 células foram tratadas por EC-LDP-Hr-AE nas concentrações indicadas, durante 48 h, e, em seguida, coradas pela Hoechst 33342. As imagens foram observados sob um microscópio de fluorescência a 200 ×. células EC9706 (B), KYSE150 células (C) ou células NIH-3T3 (D) foram expostas às concentrações indicadas de Ec-LDP-Hr-AE durante 48 h. As células foram recolhidas e coradas com uma combinação de FITC-anexina V e PI. Os quadrantes inferior esquerdo (FITC

– /PI

-) indicou as células viáveis, e os quadrantes inferior direito (FITC

+ /PI

-) indicou as células em apoptose precoce. Os quadrantes superior direito (FITC

+ /PI

+) indicou as células em apoptose em atraso, e os quadrantes superior esquerdo (

FITC – /PI

+) indicaram as células mortas

Efeitos da proteína de fusão biespecífica Ec-LDP-Hr-AE sobre EGFR /HER2 vias de sinalização de ativação

Para caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade e apoptose-indução de Ec-LDP-HR AE, foram examinados os seus efeitos sobre a expressão de moléculas relacionadas com a apoptose e diversas moléculas-chave nas vias de EGFR /HER2 sinalização. Como mostrado na Fig. 5, Ec-LDP-Hr-AE promovido caspase-3 e caspase-7, bem como as actividades de clivagem de PARP, indicando que a apoptose induzida por Ec-LDP-Hr-AE pode ser associada com vias mitocondriais. Além disso, o tratamento com Ec-LDP-Hr-AE liderado a significativa diminuição da fosforilação de EGFR e HER2, ao passo que a expressão de EGFR e HER2 inativado não foram alteradas. A fosforilação de moléculas de sinalização a jusante de EGFR /HER2, tais como via de Akt, ERK, JNK e p38MAPK foi ainda inibida pelo tratamento de Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 5). Os dados demonstraram que a densitometria de HER2 fosforilado e p38MAPK diminuiu significativamente com todas as concentrações indicadas de tratamento Ec-LDP-Hr-AE (dados não mostrados, P 0,05). EGFR fosforilado, AKT e JNK diminuiu significativamente com 0,5 nmol /L e 1 nmol /L de tratamento Ec-LDP-Hr-AE (P 0,05) e ERK fosforilada diminuiu significativamente com 1 nmol /L de Ec-LDP-Hr-AE tratamento (dados não mostrados, P 0,05). Os níveis de AKT total, a ERK, p38MAPK e JNK não foram afetados pelo tratamento de Ec-LDP-Hr-AE, e os dados de densitometria apoiou esta conclusão (dados não mostrados).

A expressão da apoptose relacionada moléculas (por exemplo, caspase 3, caspase 7 e PARP) e vias principais moléculas de EGFR /HER2 de sinalização (por exemplo fosforilado-EGFR, -HER2, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -Akt) foram determinados por análise de Western blot. β-actina foi servido como um controle de carga.

In vivo

eficácia de proteínas de fusão energizados

In vivo

antitumorais efeitos da energizado proteínas de fusão foram avaliadas num modelo de ratinho nu KYSE150 xenoenxertos. Como mostrado na Figura 6A, LDM suprimiu o crescimento de KYSE150 xenoenxertos de 61,4% na dose máxima tolerada (0,05 mg /kg), e a proteína de fusão biespecífica Ec-LDP-Hr-AE na dose de 0,3 mg /kg inibiu o crescimento de KYSE150 xenotransplantes por 88%, que mostraram diferenças estatisticamente significativas (p 0,05) em comparação com o grupo tratado com LDM em 0,05 mg /kg. Nenhuma morte dos animais foram encontradas nos grupos tratados, e as curvas de peso corporal indicaram que os animais toleraram bem a dose administrada de Ec-LDP-Hr-AE (Fig. 6B).

Ratinhos nus

(N = 7) portadores de xenoenxertos de carcinoma esofágico KYSE150 humanos foram tratados com LDM ou EC-LDP-Hr-AE no dia 11 e dia 21 após a inoculação do tumor através de injecção na veia da cauda. Os volumes médios de tumor (A) e os pesos corporais médios de ratos (B) em cada grupo são mostrados. Ec-LDP-Hr-AE na dose de 0,3 mg /kg inibiu o crescimento de KYSE150 xenoenxertos de 88%, o que demonstrou diferenças estatisticamente significativo em comparação com o grupo de LDM tratados com a dose máxima tolerada (0,05 mg /kg) (P 0,05 ).

Discussão

a cirurgia, radioterapia e quimioterapia continuam a ser a base do tratamento para o câncer de esôfago, mas, recentemente, uma série de terapias direcionadas estão sendo estudadas com o objetivo de melhorar a resposta e sobrevida em pacientes com câncer de esôfago [6], [16], [17]. Como é sabido, a sobre-expressão do EGFR e HER2 tem sido observada em mais de 30% dos carcinomas esofágicos, e a sua sobre-expressão correlaciona-se com a sobrevivência reduzida, aumento do risco de recidiva, metástase distante, e resistência à radioterapia [18]. Portanto, os efeitos de alguns anticorpos monoespecíficos e inibidores da tirosina-quinase que bloqueiem EGFR ou função de HER2, tal como cetuximab, trastuzumab, gefitinib e erlotinib em carcinoma esofágico foram examinadas, mas a eficácia é limitada até agora [19] – [22] . Diferente de anticorpos monoclonais e inibidores da tirosina quinase, as imunotoxinas são considerados como sendo altamente eficaz em terapia de cancro com a vantagem da especificidade de anticorpos ou ligandos e a citotoxicidade de toxinas [23]. No entanto, dados de ensaios clínicos sobre as imunotoxinas têm mostrado resultados inconsistentes. Vários imunotoxinas foram muito eficazes contra doenças malignas hematológicas. Por exemplo, no ensaio de fase III em pacientes com linfoma cutâneo de células T (LCCT), 30% dos 71 pacientes tratados com diftitox denileucina (DAB

389IL2, Ontak) tinha uma resposta objectiva, incluindo 10% remissões completas. E em um ensaio de fase I em 31 pacientes com leucemia de células pilosas, BL22 induzida 19 respostas completas (61%) e 5 respostas parciais (19%) [24], [25]. Mas, para os tumores sólidos, imunotoxinas mostrou eficácia antitumoral limitada. As razões para o fracasso do tratamento de tumores sólidos incluídos fraca penetração em tumores e as respostas imunológicas graves [26] – [28]. Vallera e colaboradores desenvolveram novas moléculas biespecíficas através da fusão de dois ligandos alvo distintas para uma única toxina com o objectivo de melhorar a especificidade, e os resultados demonstraram que as moléculas biespecíficas mostraram qualquer actividade anti-tumor melhorada ou mais amplo espectro de reactividade do que as moléculas monoespecif icos [15 ], [29], [30] – [34]. A proteína de fusão Ec-LDP-Hr-AE construímos anteriormente é uma molécula biespecífica que a segmentação tanto EGFR e HER2. Ec-LDP-Hr-AE emprega dois oligopéptidos de ligação ao receptor e subsequente entrega intracelular de um lidamycin antibiótico enediina de morte celular. Neste estudo, a atividade antitumoral do Ec-LDP-Hr-AE sobre cancro esofágico foi investigada, porque a co-overexpresssion de EGFR e HER2 foi observada na maioria dos carcinomas escamosos esofágicas.

A ligação com receptores correspondente é o pré-requisito para a Ec-LDP-Hr-AE para exercer seus efeitos citotóxicos de células-seletiva tumorais. Por conseguinte, a capacidade de ligação da proteína de Ec-LDP-RH para células CICAc foi avaliada usando um ensaio de imunof luorescência com base em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a proteína de Ec-LDP-FC foi capaz de se ligar a células CICAc com elevada afinidade. No entanto, Ec-LDP-Hr não conseguiram demonstrar actividade de ligação a EGFR e as células NIH 3T3 negativas HER2. No ensaio de viabilidade celular, a biespec�ica e proteína de fusão enediina-energizado Ec-LDP-Hr-AE mostraram efeitos de matança extremamente potentes em células de câncer de esôfago com IC

50 valores em nível muito baixo ( 10

-10 mol /EU). Para as células KYSE150, que expressam tanto o EGFR e HER2, Ec-LDP-Hr-AE foi o mais citotóxica para as células cancerosas esofágicas quando comparando com LDM e duas proteínas de fusão monoespecif icos (CE-LDP-AE e LDP-Hr-AE). actividade aumentada da proteína de fusão biespecífica pode ser explicado pelo que Ec-LDP-Hr-AE ligado a ambos o EGFR e HER2, e torna menos provável que se dissociam a partir da superfície da célula, aumentando assim as possibilidades para a internalização da sua porção citotóxica e células exercendo matando efeitos. No entanto, a proteína Ec-LDP-Hr-AE biespecífico não foi sempre mais potente do que os homólogos monoespecíficos e LDM como os resultados da análise estatística revelou que as diferenças de IC

50 valores de LDM, Ec-LDP-Hr-AE , Ec-LDP-AE e LDP-Hr-AE para o EC-1, ECa109 e EC9706 células não foram estatisticamente significativos. Além disso, verificou-se que a citotoxicidade das proteínas de fusão energizados para CICAc células não estava bem correlacionado com o EGFR e os níveis de expressão de HER2. Por exemplo, o IC

50 valor de Ec-LDP-Hr-AE para EC9706 células com baixa expressão HER2 foi 5,12 × 10

-12 mol /L, enquanto IC

50 valor para KYSE150 células com alta EGFR e HER2 nível era 6,10 × 10

-11 mol /L. Também foram observados os resultados semelhantes entre a potência de proteínas de fusão monoespecif icos e os níveis de EGFR /HER2. Este fenómeno tem sido observado em outros estudos sobre drogas específicas, como lapatinib [35], [36]. Como resultado, são claramente necessários mais estudos com foco em revelar os mecanismos moleculares da sensibilidade à Ec-LDP-Hr-AE, e isso pode fornecer dados úteis para pacientes selecionando que serão beneficiados com agentes de EGFR /HER2-biespec�ica.

para elucidar os mecanismos de biespec�ica Ec-LDP-Hr-AE exibiu citotoxicidade em células de câncer de esôfago, de coloração PI, coloração Hoechst, e anexina V-FITC /estudos de coloração PI foram realizados para examinar a parada do ciclo celular e apoptose. Os resultados da análise do ciclo celular demonstrou que Ec-LDP-Hr-AE causada paragem em G2-M significativa, em que as células em fase G2-M atingiu o pico com 0,1 nmol /L de tratamento Ec-LDP-Hr-AE. Este resultado foi devido à potencialmente as células apoptóticas e seca aumentou após o tratamento com 0,5 nmol /L e 1 nmol /L EC-LDP-Hr-AE. Portanto, a prisão G2-M foi menos significativa do que a de 0,1 nmol tratamento /L Ec-LDP-Hr-AE. Ec-LDP-Hr-AE também induziu apoptose em EC9706 e KYSE150 células de uma forma dependente da dose, e a apoptose induzida por EC-LDP-Hr-AE pode ser associada com vias mitocondriais, porque as actividades de caspase-3 e caspase-7 , bem como a clivagem de PARP aumentada significativamente como mostrado por análise de Western blot.