Abstract

opções de tratamento para o cancro do colo do útero são baseadas principalmente no estágio FIGO clínica e avaliação pós-operatória dos parâmetros prognósticos incluindo tumor diâmetro, parametrial e comprometimento de linfonodos, vaso-invasão, profundidade de infiltração e tipo histológico. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações genômicas em tumores cervicais volumosas e sua relação com parâmetros clínicos, utilizando polimorfismo de nucleotídeo único -Análise (SNP).

Células tumorais

Flow-classificado e as células normais pareados por paciente foram extraídos de 81 tumores cervicais volumosas. Foram realizadas DNA-índice (DI) de medição e toda genoma SNP-análise. Os dados foram analisados ​​para detectar alterações no número de cópias (CNA) e estado de equilíbrio alélico: LOH equilibrado, desequilibrado ou puro e sua relação com parâmetros clínicos

O DI variou de 0.92-2.56.. LOH pura foi encontrada em ≥40% das amostras no cromossomo armas 3p, 4p, 6p, 6q e 11q, os ganhos NC em 20% em 1q, 3q, 5p, 8q e 20q, e perdas em 2T, 3p , 4p, 11q e 13q. Mais de 40% apresentaram ganho no 3T. As únicas diferenças significativas foram encontradas entre os tipos histológicos (escamosas, adeno e adenoescamosos) na relação de menor intensidade alelo (LAIR) (p = 0,035) e na análise CNA (p = 0,011). Mais perdas foram encontrados no 2T cromossomo-braço (FDR = 0,004) em tumores escamosos e mais ganhos no 7P, 7q, e 9p em tumores adenoescamosos (FDR = 0,006, FDR = 0,004, e FDR = 0,029).

análise do genoma inteiro do câncer de colo uterino volumoso mostra mudanças generalizadas no equilíbrio alélicas e CN. As mudanças genéticas globais e CNA no cromossomo armas específicas diferem entre os tipos histológicos. Nenhuma relação foi encontrada com os parâmetros clínicos que atualmente ditam a escolha do tratamento

Citation:. Van den Tillaart SAHM, Corver WE, Ruano Neto D, ter Haar NT, Goeman JJ, Trimbos JBMZ, et al. (2013) perda de heterozigosidade e número do exemplar alterações no fluxo-Ordenado volumoso do cancro do colo. PLoS ONE 8 (7): e67414. doi: 10.1371 /journal.pone.0067414

editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão

Recebido: 21 de novembro de 2012; Aceito: 20 de maio de 2013; Publicação: 09 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 van den Tillaart et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. D. Ruano Neto recebeu financiamento da concessão 93518025 da Genomic Iniciativa Países Baixos (NGI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

fatores prognósticos para o cancro do colo do útero

o câncer cervical é um dos cancros ginecológicos mais frequentes em todo o mundo. Seguindo o tratamento cirúrgico dos tumores cervicais, fatores prognósticos para sobrevivência incluem os parâmetros clínicos fase FIGO, diâmetro do tumor, tumor na paramétrios, linfonodos pélvicos positivos tumorais, vaso-invasão, e profundidade de infiltração. Tipo histológico está também relacionado com o prognóstico, e é avaliado no pré e no pós-operatório [1] – [4]. Embora os parâmetros podem ser parcialmente determinada pré-operatório através de exames clínicos, de imagem, ou a avaliação patológica das amostras de biópsia, a maioria dos parâmetros só são definitivamente estabelecido após a análise patológica pós-operatório de espécimes cirúrgicos. A presença ou ausência destes factores é de relevância prognóstico e, por conseguinte, é utilizado para seleccionar tanto a tratamento primário, e de decidir se adjuvante de quimioterapia e /ou radioterapia são necessárias.

O tratamento cirúrgico é considerado o tratamento óptimo primário para os tumores de pequeno diâmetro do colo do útero ( 4 cm, fase FIGO 1b2). tumores localmente estendidos (FIGO 2b ou superior) são tratados principalmente por quimio-radioterapia. Não é, no entanto, não acordo mundial no tratamento primário óptima para o cancro do colo do útero volumoso (diâmetro 4 cm, FIGO ≥1b2-2b), embora a cirurgia ou radioterapia são opções [5] – [13]. Recentemente, nosso grupo relatou um possível fator prognóstico adicional para tumores cervicais volumosas. Pacientes com forma de barril (extensão lateral ≥1.5 × extensão crânio-caudal) tumores volumosos mostrou uma pior sobrevida global e livre de doença após o tratamento cirúrgico, quando comparado com exofítica (todos os outros) tumores. tratamento cirúrgico primário, em vez de radioterapia ou quimio-radioterapia, tem sido proposta como o melhor tratamento para pacientes com tumores volumosos exofíticas [14].

A capacidade de selecionar subgrupos mais homogêneos de pacientes com tumores do colo do útero pode ajudar na a selecção da estratégia de tratamento mais adequado para doentes individuais. Identificação de pacientes com padrões genéticos específicos pode ser uma maneira de alcançar este objetivo. As alterações genéticas poderiam ser objectivamente avaliada, pré-operatório, em biópsias de tumores, potencialmente proporcionar uma previsão mais exacta da fase e comportamento clínico do que o exame físico do paciente. Além disso, a caracterização genética poderia fornecer informações sobre os genes ou vias responsáveis ​​pelo crescimento de tumores e metástases.

perfis genéticos

A progressão das células normais ao câncer é acompanhada por mudanças no DNA e perfis genéticos foram determinadas para vários tipos de cancro. Esses perfis foram em grande parte determinado usando arrayCGH, e foram, portanto, limitado a copiar alterações numéricas. Neste estudo, foram utilizados matrizes polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) para determinar o perfil genético de populações tumorais classificadas de fluxo. Esta abordagem tem a vantagem de também determinar as alterações específicas de alelo, em adição para copiar alterações Número (CNA), em células tumorais puras. A fim de incluir a perda de heterozigosidade (LOH) na análise, desenvolvemos a abordagem menor rácio de intensidade alelo (LAIR), que permite a avaliação do número de cópias específicas discreta de alelos (CN) para todas as localizações genômicas [15]. Este método permite a classificação do total de CN discreta tanto como a soma dos dois alelos e como o estado de equilíbrio, o que pode, então, ser dividido em 3 classes:. Equilibrada, desequilíbrio, e LOH

A análise estatística das diferenças em perfis genéticos entre grupos de tumores tem provado ser difícil. A natureza das alterações genéticas nos tumores provoca fortes correlações entre as medições das sondas vizinhas, correlações que não são devidamente tratados em testes estatísticos comumente utilizados. Neste estudo, apresentamos um método estatístico com base no teste global de [16], que executa múltiplos ensaios correcção correctamente na presença de valores fortemente correlacionados. Outra vantagem do teste global é que ele pode testar a hipótese de que grupos de amostras são os mesmos em um nível do genoma inteiro, e pode aumentar o zoom em braços de cromossomos quando seja detectada uma diferença entre os grupos.

Objectivo do estudo

O objetivo deste estudo foi identificar as alterações genéticas associadas a um ou mais factores de prognóstico em pacientes com câncer cervical. A nossa abordagem foi utilizar a análise de matriz SNP no tecido tumoral FFPE classificadas de fluxo de cancros cervicais volumosas.

Para nosso conhecimento, este é o primeiro grande escala, estudo conjunto do genoma SNP toda esta fase de tumores cervicais, e nenhuma publicação tem ainda descrito um perfil genómico de tumores cervicais com base na análise de matriz de tecido de tumor de SNP puro. Além disso, esta é a primeira totalidade do seu genoma SNP estudo conjunto de um grande grupo de tumores cervicais volumosos em relação às mudanças genéticas em estado de equilíbrio e CN, e sua relação com fatores prognósticos desfavoráveis.

Materiais e Métodos

Amostras

tecido de 107 carcinomas do colo do útero, bem como emparelhado normal (não afectado) endometrial e /ou tecido de linfonodo, foi obtido a partir do banco de tecidos FFPE do Departamento de Patologia da Leiden University Medical center (LUMC). As amostras foram tratadas em conformidade com as diretrizes éticas médicos descritos no Código a utilização secundária adequada do tecido humano estabelecido pela Federação Holandesa de Ciências Médicas (www.federa.org). O nosso grupo de estudo consistiu de pacientes que vivem na Holanda e no Suriname. Todos os pacientes que apresentaram ≥1b2-2b cervical volumosos estágio FIGO câncer e receberam tratamento cirúrgico primário no LUMC entre janeiro de 1984 e novembro de 2000, foram incluídos no grupo de estudo. Um grande número de parâmetros clínicos foram caracterizados nestes pacientes, mas para este estudo nós escolhemos para investigar sete parâmetros clínicos conhecidos por serem de valor prognóstico: diâmetro do tumor, tipo histológico, o envolvimento parametrial, pélvica linfático status do nó, vaso-invasão, infiltração profundidade e padrão de crescimento. O padrão de crescimento foi definido como se a extensão lateral do tumor foi ≥1.5 em forma de barril × a extensão crânio-caudal do tumor; caso contrário, o tumor foi classificado como exofítica. tipo histológico (escamosas, adenocarcinomas, adenoescamoso, ou tumores mistos) foi baseada na coloração histoquímica com H E, ácido periódico de Schiff (PAS) de reagente, e azul Alcian para detecção de mucina. A utilização desta coloração adicional está bem estabelecida entre os patologistas [17]. estágio FIGO não foi incluído nas análises desde as várias características do pós-operatório são sobrepostas com, e mais preciso do que as características que são usados ​​para o estadiamento da FIGO pré-operatório.

preparação

amostra de tecido

Parafina secções retiradas de todas as amostras foram H e manchado e revistos por um patologista (GJF). O nódulo de tumor foi marcado na H E a secção, o qual foi utilizado como um guia para cortar o tecido normal do bloco de parafina antes da citometria de fluxo processamento. O status negativo tumor de blocos contendo tecido normal (ou tumorais linfonodos negativos ou tecido endometrial) foi avaliada pelo histologia e confirmada. Foram preparadas suspensões de células por citometria de fluxo, tal como descrito em detalhe noutro local [18], [19]. Em resumo, seis a dez secções de 60 um foram retiradas de cada bloco de parafina. Os cortes foram desparafinados e ainda processado até se obter uma suspensão de células. As células foram então recolhidas, lavadas, contadas e armazenados em gelo antes de posterior processamento.

A imunocitoquímica de suspensões de células

Imunocitoquímica tenha sido descrita em detalhe noutro local [18], [19]. Resumidamente, cinco milhões de células foram incubadas em uma mistura de anticorpos monoclonais dirigidos contra a queratina ou vimentina. Foram utilizados os seguintes Mabs: anti-queratina MNF116 (DAKO, Glostrup, Dinamarca), anti-queratina AE1 /AE3 (Millipore-Chemicon, Billerica, MA), e V9-2b anti-vimentina (diluído 1:05) (anticorpos para investigação sobre aplicações BV, Gouda, Países Baixos). As células foram incubadas com pré-misturada com FITC ou reagentes secundários marcados com RPE (cabra F (Ab2) ‘anti-IgG1 de ratinho-FITC e de cabra F (Ab2)’ anti-IgG2b de ratinho-RPE [Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL]), e DNA foi marcado com DAPI (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Baixos) [20].

a citometria de fluxo e triagem

Usando um LSRII (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica) citômetro de fluxo, um portão foi criado para coletar eventos de células únicas 20.000 queratina-positivos durante a aquisição. conjuntos de filtros convencionais foram usadas para a detecção do FITC, R-PE e DAPI fluorescência. Um arquivo de dados continha todos os eventos. Os WinList 6.0 e 3.2.1 ModFit pacotes de software (Verity Software House, Inc., Topsham, ME) foram utilizados para análise de dados e índice de DNA cálculo (DI) (mediana de G

0G

1 população de células tumorais fração /mediana de G

0G

1 população de fração de células do estroma). A fim de separar células de tumor a partir de células geneticamente normais (tecido conjuntivo, os vasos sanguíneos e lymphocyes) [21], [22]. células normais vimentina positivas queratina-positivos e foram recolhidos separadamente, usando um FACSAria mano-classificador a 40 psi (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica). Nos casos em que a citometria de fluxo detectou mais de uma população de células tumorais de queratina-positivo, ambas as populações foram classificados de forma independente. A população de ADN mais prevalente foi seleccionado para ser submetido a análise de matriz de SNP.

o isolamento de ADN foi efectuada tal como previamente descrito [23]. Nos casos em que endometrial ou tecido dos linfonodos não estavam disponíveis, o DNA a partir de fracções de células do estroma tumor ordenadas foi utilizado como referência [23].

array SNP

O Golden Gate painel Linkage V, consistindo 4 de matrizes com um total de 6000 SNPs (Illumina, San Diego, EUA), foi usado para analisar o ADN derivado de tumores, em conjunto com ADN de tecido normal /correspondentes não-afectado. Os ensaios foram realizados como previamente descrito [24]. A resolução deste ensaio é relativamente baixo, mas em contraste com outros ensaios de SNP que pode ser usado com FFPE ADN derivado [24], [25]. Estas análises SNP em tecidos FFPE foram extensivamente validado anteriormente por análise FISH [15], [24] – [26]. As amostras foram processadas em 6 lotes de 48 amostras, e as amostras do mesmo paciente foram sempre processadas no mesmo lote. A 7

th lote foi usado para repetir os ensaios com baixa qualidade. As amostras foram genotipados em Illumina Beadstudio 2.3. Os grupos de genótipos de referência foram obtidos a partir de amostras normais no conjunto de dados, e os genótipos e intensidades de alelos foram extraídos. O pacote beadarraySNP foi utilizado para o processamento de dados. Os passos da análise são apresentados na Figura 1. Os SNPs que se desviaram significativamente do equilíbrio de Hardy-Weinberg (a um nível de significância de 0,05, dividido pelo número de SNPs analisados ​​= 0,00001), e SNPs com uma taxa de chamada inferior a 95% nos controlos, foram removidos para evitar a possibilidade de erros de determinação do genótipo. Todos os ensaios com uma intensidade média de menos de 2000 para um dos alelos foram rejeitados e repetida em lote 7. A normalização foi subdividido em 4 passos: I) para normalizar as intensidades efeito corante – normalização quantil foi aplicado para fazer a distribuição das intensidades de ambos corantes idênticos, II) por amostra entre normalização ensaio quantil para equalizar diferenças de intensidade, III) dentro de normalização de exemplo para dimensionar a intensidade mediana de cada alelo a 1, IV) por SNP entre a normalização de exemplo usando as amostras de referência (que ajusta a intensidade total de SNPs e corrige o viés específico alelo usando um modelo linear entre o índice B-alelo e intensidade total). amostras normais pareados foram usados ​​para selecionar os SNPs heterozigotos informativos. O LAIR foi calculado para todos os SNPs informativos nas amostras tumorais. O valor LAIR é, basicamente, a proporção de B-alelo, a razão entre a intensidade da B-alelo e a intensidade total, espelhada sobre o seu eixo de simetria a 0,5, e dimensionado para um valor entre 0 e 1. Isto torna mais fácil de calcular médias e permite a segmentação. A fim de identificar regiões genômicas com CN idênticos e equilibrar estado, os dados foram segmentados usando segmentação binário circular nas configurações padrão do pacote DNAcopy R [27]. Para cada tumor, primeiro a intensidade do sinal de cada cromossoma foi segmentada, seguido por um sub-segmentação dos segmentos previamente obtidos no LAIR [15]. Ao combinar o CN contínua (intensidade de sinal) e o LAIR valor de um segmento de ADN com o índice da amostra medido por citometria de fluxo, foi desenvolvido um novo método de chamada que atribui um estado alélica de cada segmento [15]. No estado atual estudo alélicas foi distinguido ao longo de 2 dimensões. Para cada segmento, discreta CN e um estado de equilíbrio foi atribuído. A NC discreta é uma medida absoluta atribuídos aos segmentos de tal forma que os valores médios discretas NC em todos os segmentos devem reflectir o índice da amostra de ADN. O equilíbrio entre alelos foi dividida em 3 resultados possíveis: segmentos equilibradas – com o mesmo CN para ambos os alelos e um valor LAIR próximo de 1; LOH – segmentos com apenas um alelo presente e um valor LAIR perto 0; segmentos desequilibradas – com diferentes CN para os dois alelos e um valor LAIR entre 0 e 1.

Os dados são pré-processados ​​para se obter qualidade verificada e valores normalizados para a intensidade e LAIR. Juntamente com o DNA-index estes são interpretados numa escala discreta e categórica. A trama incorporado mostra a intensidade normalizada como pontos na face superior, e LAIR no painel inferior como hífens. O procedimento de segmentação tem dividido a região em dois segmentos. O segmento esquerdo tem cópia número 1 com LOH. O estado alélica é A. O segmento direito tem cópia número 2 com o equilíbrio. O estado alélica é AB.

A análise estatística

Os pontos de interrupção entre segmentos são diferentes em cada amostra. Os pontos de interrupção de cada amostra foram aplicados a todas as amostras. Isso faz com que as amostras comparáveis ​​após a segmentação O global do teste foi usada para detectar diferenças em modificações genéticas entre os grupos de doentes em todo o nível do genoma e nos braços cromossómicos [16]. Testamos diferenças tanto em contínuo e discreto CN. O CN contínua é uma medida relativa; a média da amostra é de 1 independentemente do DI. Discreta CN é uma medida absoluta que representa o número de cópias de um segmento genómico em cada célula de um tumor. O CN contínua é a forma convencional de olhar CN; que iria investigar aqui se é útil olhar para absoluta CN. LAIR como uma medida contínua de equilíbrio alélicas e estado de equilíbrio como uma medida discreta também foram testados. Os ganhos e perdas contínuas NC foram definidos como se desviar mais de 15% da média da amostra. O teste global permite a utilização de confusão. grupo étnico foi usado como um fator de confusão para todos os testes, porque a constituição genética pode influenciar a ocorrência de alterações cromossômicas. Dl foi utilizado como um confundidor extra na análise de NC contínuo, porque DI tem uma relação com os ganhos e perdas. A determinação do CN discreta já leva o DI em conta, e, portanto, usando DI como um fator de confusão tornaria esta análise de volta para uma medida relativa, em vez de um absoluto (ver figura S2 em S1 Arquivo). Etnia foi definida pelo agrupamento dos genótipos, juntamente com amostras de HapMap de origem étnica conhecido. Os testes foram ainda localizados efectuando o teste global sobre todas as armas cromossômicas individualmente. As diferenças entre os grupos foram aceites como significativa quando a taxa de descoberta de falsas (FDR) foi menor do que 0,05 [28]

Todos os nossos SNP-dados podem ser encontrados no Gene Expression Omnibus:.. Série GSE29143

Resultados

os dados clínicos

a partir dos 107 pacientes com carcinoma do colo incluídos no estudo, material DNA suficiente foi obtida para 82 tumorais combinado /pares normais após separação de fluxo. Uma amostra foi retirada após a hibridização devido à baixa qualidade dos dados. A Tabela 1 mostra resumidas informações clínicas sobre os 81 pacientes analisados, enquanto que a Tabela S1 no arquivo S1 mostra os dados para pacientes individuais. Como 96,3% dos tumores foram encontrados para ter um diâmetro tumor maior do que 40 mm, este parâmetro não foi explorada.

Análise de Componentes Principais (PCA) foi realizada utilizando as 4 populações HapMap originais como referência painéis, juntamente com genótipos obtidos a partir de tecidos normais do paciente. Três grandes grupos genéticos poderiam ser distinguidos nas quatro populações HapMap, com as populações HapMap japoneses e chineses agrupamento juntos. Guiada por este agrupamento, classificamos os pacientes em 3 grupos étnicos: europeus (EUR, n = 45) para os pacientes que se aglomeram em conjunto com a população CEU HapMap, Africano (AFR, n = 25) esse cluster juntamente com YRI e asiática ( ASI, n = 11) que em conjunto com o cluster de CHB e populações JPT. Para informações mais detalhadas, consulte a Figura S1 S1 Arquivo.

Amostras

A maioria das amostras tumorais 81 combinados (89%) poderia ser emparelhado com o tecido normal /não-afetados. Como o tecido normal não estava disponível em 9 casos, o ADN do tumor em vez disso foi emparelhado com o DNA a partir de células do estroma normais obtidos a partir do procedimento de fluxo de [23] de triagem. separação de células detectada a presença de população de células de mais de um tumor em 8 casos. Para esses casos, a população de ADN mais prevalente foi seleccionado para ser submetido a análise de matriz de SNP. A ADN-índice (DI) de amostras classificadas de fluxo variaram 0,92-2,56. A Figura 2 mostra o gráfico da densidade DI do grupo de doentes.

Há uma distribuição bimodal do índice de DNA com picos de cerca de 1, e perto de 2.

padrão genético geral

Estado de equilíbrio.

ao olhar para os padrões estaduais equilíbrio gerados pela análise dos dados de matriz SNP, pode-se observar que LOH está presente em quase todas as regiões cromossômicas (Figura 3). Em 28 dos 40 braços de cromossomas, mais de 10% dos pacientes mostraram LOH. LOH foi particularmente frequente no cromossoma 3p braços, 4p, 6P, 6Q, e 11q, onde foi observado em mais de 40% de todos os pacientes. Além LOH todas as regiões cromossómicas mostram a presença de desequilíbrios em, pelo menos, 10% das amostras (figura 3). O padrão de desequilíbrio é um pouco complementar ao padrão de LOH

Além da altura do gráfico, As cores indicam a frequência de LOH.; preto: 10%, verde: 20%, azul: 0%, vermelho: 40%. O grupo de equilíbrio não é mostrada; É o complemento destes 2 grupos.

Copiar alterações numéricas.

CNA usando o contínuo CN pode ser visto por todo o genoma (Figura 4). Mais de 20% dos pacientes apresentam ganhos em 1q, 3q, 5p, 8q e 20q e perdas nos cromossomas 2q, 3p, 4p, 11q e 13q. Ganho na 3T foi encontrada em . 40% de todas as amostras

Os ganhos são retratados em cima dos ideogramas, enquanto as perdas são descritos abaixo. As cores indicam a frequência dentro do conjunto de dados; preto: 10%, verde: 20%, azul: 30%, vermelho: 40%. Foram identificados os ganhos e perdas quando o CN contínua desviou mais de 15% da média da amostra.

Relação entre parâmetros clínicos e alterações genéticas

estado de equilíbrio.

Quadro 2A mostra os resultados de toda a análise do genoma de LAIR eo estado de equilíbrio. Quando os 22 autossomos e cromossomo X foram analisados ​​em conjunto, único tipo histológico mostrou diferenças estatisticamente significativas no valor LAIR (p = 0,035). Não foram observadas diferenças entre os diferentes parâmetros clínicos no estado de equilíbrio (p = 0,050). Concentrando-se nos braços de cromossomos mostrou individualmente que a diferença entre os grupos histológicos não podia ser atribuída a um braço cromossomo específico.

alterações Copiar número.

Tabela 2B mostra o resultado do todo análise do genoma de mudanças no CN. valores NC contínuas mostraram diferenças estatisticamente significativas apenas para tipos histológicos (p = 0,011). O teste para CN discreta não foi estatisticamente significativa (p = 0,363). Quando DI é adicionado como um fator de confusão para a análise da CN discreta a diferença entre os tipos histológicos é significativa (p = 0,019), os perfis discretos NC dos pacientes com e sem metástases linfonodais foram significativamente diferentes (p = 0,032), e aqui a teste para CN contínua não foi significativa (p = 0,614). A inclusão de DI como um fator de confusão no teste para CN discreta agora mostra nenhuma diferença mais (p = 0,637). Veja também a Figura S3 em S1 Arquivo. Para CN contínua os testes mostram resultados comparáveis ​​com ou sem a inclusão de DI como um confundidor (dados não mostrados). Nós, então, ampliado em braços de cromossomas individuais quando se analisa os parâmetros clínicos que mostraram uma diferença. tumores escamosos apresentaram maiores perdas em 2T (FDR = 0,004), enquanto os tumores adenoescamosos foram encontrados para ter mais ganhos em 7P, 7q, e 9p (FDR = 0,006, FDR = 0,004, e FDR = 0,029, respectivamente). Para CN discreta, as diferenças entre os grupos com e sem comprometimento de linfonodos não poderia ser atribuída a qualquer um dos braços do cromossoma em particular. A Figura 5 mostra as diferenças de CN contínua para o tipo histológico sobre os diferentes braços de cromossomos.

Os ganhos são retratados em cima dos ideogramas, enquanto as perdas são descritos abaixo. Vermelho: tumores escamosos, verde: adenocarcinoma + tipo misto, azul: tumores adenoescamosos. Adenocarcinoma e tipo misto foram combinados por causa dos baixos números de amostras nestes grupos.

Discussão

extensa LOH genome-wide

Usando a análise de matriz SNP, temos mostrado e CN mudanças na câncer de colo uterino volumoso. Para nosso conhecimento, nenhum estudo anterior aplicada a caracterização genética do genoma a um número tão grande de cânceres cervicais volumosas (FIGO estágio 1b2-2b).

A análise da relação entre alterações genéticas e os fatores prognósticos histológicos tipo, profundidade de infiltração, estado dos linfonodos, extensão para o paramétrios, vaso-invasão, e padrão de crescimento revelou uma diferença estatisticamente significativa na análise da NC discreta entre os grupos com e sem envolvimento de gânglios linfáticos, e uma relação entre o tipo histológico e mudanças no LAIR e CN contínua. Mesmo que o CN discreta não mostraram diferenças entre os diferentes tipos histológicos, observou-se que, quando o índice de DNA foi usada como um fator de confusão na análise da diferença significativa entre os grupos histológicos foi restaurado (p-valor vai 0,363-0,019). Isto significa que os valores discretos NC conter uma ampla informação para distinguir os grupos, mas que as alterações relativas de ADN em comparação com o teor médio de ADN de uma célula são mais importantes para a diferença entre os grupos histológicos do que a contagem absoluta alelo.

a fim de especificar as mudanças genéticas que contribuem para as diferenças nos parâmetros clínicos, foram analisados ​​os braços cromossômicos individualmente. Na análise das alterações NC contínuas, o grupo histológico carcinomas escamosos mostrou um aumento estatisticamente significativo na perda no 2T, enquanto Carcinoma Adenoescamoso mostrou mais ganhos em 7P, 7q, e 9p. As diferenças estatísticas nestes 4 regiões são comparáveis, mas a diferença numérica é mais pronunciada para 2T cromossomo, onde cerca de 10% dos carcinomas adenoescamosos mostra perda, mas mais de 40% dos carcinomas escamosos mostra perda. Apesar de toda a diferença genoma em CN discreta entre pacientes com e sem envolvimento de gânglios linfáticos, não poderíamos vincular essa diferença a um braço cromossômico específico. Assim, esta diferença não pode ser usado para extrair um parâmetro clínico

CNA foram encontrados em estudos anteriores usando clássica matriz-CGH, ​​que examina apenas mudanças NC contínuos (ver Tabela S2 em S1 Arquivo) [29] -. [ ,,,0],39]. Como pode ser visto na tabela, os ganhos que nós encontramos foram já relatadas:

Os ganhos sobre 1T também foram encontrados em 8 dos 11 estudos incluídos, no 3T frequentemente em todos os estudos, em 5p em 5 dos 11 estudos, em 8q em 3 dos outros estudos, e sobre 20q em 6 estudos. As perdas no 2T foram relatados em 5 dos outros 11 estudos, em 3p em 8 dos 11, em 4p em 6, em 11q em 6, e em 13q em 8 dos outros estudos. Todos os nossos achados foram anteriormente encontradas por Rao et ai., E todos menos um por Lando et al., Embora as alterações adicionais sobre outros locais também foram encontrados nestes estudos. Isto pode ser explicado pela inclusão de tumores com maior fase FIGO nestes estudos.

Alguns dos estudos também investigou a relação entre os parâmetros clínicos e alterações genéticas no cancro do colo do útero (ver Tabela S2 em S1 Ficheiro) [ ,,,0],29], [30], [33], [34], [36]. Rao et al. não encontraram diferenças entre tumores escamosos e adeno fase 1b-4-B. Isto pode ser devido ao pequeno número de adenocarcinomas incluídos (5 adenocarcinomas e carcinomas escamosos 72) [34]. Não houve adenoescamosos tumores neste grupo. Em uma análise de tumores cervicais fase 1b-3b, Wilting et al. relataram significativamente mais ganhos em 9 tumores escamosos, em comparação com 7 adenocarcinomas. maiores ganhos foram predominantemente encontrado no 3T [36], embora o método utilizado para definir o tipo histológico não foi descrito. Os locais das diferenças de alterações genéticas entre carcinomas espinocelulares e adenoescamosos em nosso estudo não coincidem com os achados de Wilting et al., Mas não houve tumores adenoescamosos neste grupo.

A diferença de resultados globais entre nossa e estudos anteriores podem ser explicadas pelas diferenças na fase FIGO, tamanho da amostra, e técnicas de coloração para discriminar tipo histológico. O grupo de tumores que usamos não foi anteriormente analisado na literatura, e, exceto para os gânglios linfáticos, os parâmetros clínicos que analisamos foram estudadas antes em apenas 2 dos outros 11 estudos (Rao et al., E Wilting et al. ). Diluição provocada pelo uso de tecido do tumor, em vez de células tumorais puras também pode explicar diferenças nos resultados.

A relevância prognóstico do tipo histológico ainda é um objeto de debate e não é usado atualmente para a escolha de tratamento primário ou adjuvante [ ,,,0],1] – [4], [40] – [42]. Os resultados conflitantes desses estudos sobre o efeito do tipo histológico no comportamento do tumor e sobrevida do paciente também pode ser devido a diferenças na classificação dos tumores, onde foi aplicada nenhuma coloração específica (PAS e azul Alcian). Futuros estudos sobre alterações genômicas são aconselhados a tomar os diferentes perfis genéticos de tipos histológicos em consideração.

As regiões com as diferenças mais proeminentes contêm muitos genes. O objetivo deste estudo foi o de encontrar parâmetros pré-operatórios adicionais que poderiam ser usados ​​para a escolha do tratamento, sem saber o gene causador. Este tópico merece uma investigação mais aprofundada.

A matriz SNP utilizado neste estudo consistiu de 6.000 marcadores SNP distribuídas uniformemente ao longo do genoma, e a matriz foi otimizado para ter uma maior frequência menor de alelo na população caucasiana (europeu) . Como consequência, o número médio de sondas informativas foi maior para os pacientes caucasianos (2139 SNPs informativos) do que para o (1712) pacientes asiáticos Africano (1796) e. Isso pode resultar em uma subestimação das mudanças genéticas que ocorrem no câncer do colo do útero nessas populações. Embora teria sido interessante comparar mudanças genéticas e sua relação com parâmetros clínicos por origem étnica, os subgrupos são pequenos demais para permitir isso.

Os nossos resultados revelaram mudanças genéticas relacionadas com o tipo histológico, um parâmetro clínico atualmente não usado para a escolha do tratamento. A análise não mostrou qualquer relação de modificações genéticas nos parâmetros clínicos que podem ser usados ​​para predizer as características de prognóstico pós-operatórias desfavoráveis ​​ou seleccionar subgrupos de pacientes. Parece que, neste momento, a melhor avaliação de fatores prognósticos ainda vem de achados pré, intra e pós-operatório do oncologista ginecológica e patologista. Como diferenças na alteração de DNA entre os tumores de diferentes tipos histológicos pode ter um impacto sobre o comportamento do tumor, a resposta ao tratamento e sobrevivência, pesquisas futuras devem incluir grupos de pacientes maiores, e técnicas de coloração de uso que podem distinguir de forma confiável tipo histológico.

Apoiando informações

arquivo S1.

Figura S1, Classificação de etnia paciente em relação às populações HapMap.