Abstract

Purpose

microRNAs surgiram como principais reguladores da expressão do gene e sua expressão alterada tem sido associada com tumorigênese e progressão tumoral. Assim, microARNs têm potencial como ambos os biomarcadores de cancro e /ou potenciais novos alvos terapêuticos. Embora o acúmulo de evidências sugere que o papel da expressão microRNA aberrante na carcinogênese endometrial, ainda existem poucos dados disponíveis sobre o significado prognóstico de microRNAs em câncer endometrial. O objetivo deste estudo é investigar o valor prognóstico dos microRNAs-chave selecionadas no cancro endometrial pela análise de tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina de arquivamento.

Experimental Design by

Total de RNAs foram extraídos 48 emparelhado espécimes normais e tumorais endometriais usando abordagem baseada Trizol. A expressão de miR-26a, deixou-7g, miR-21, o miR-181b, miR-200c, o miR-192, o miR-215, miR-200c, e miR-205 foram quantificadas por análise de expressão de qRT-PCR em tempo real. Alvos dos miRNAs diferencialmente expressos foram quantificados utilizando imuno-histoquímica. A análise estatística foi realizada por GraphPad Prism 5.0

Resultados

Os níveis de expressão de miR-200 ° C (p 0,0001). e miR-205 (P 0,0001) foi significativamente aumentada nos tumores endometriais comparado para os tecidos normais. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier revelou que níveis elevados de expressão de miR-205 foram associados com pior sobrevida geral do paciente (hazard ratio, 0,377; teste Logrank, P = 0,028). Além disso, a diminuição da expressão de um alvo de miR-205 PTEN foi detectado em tecidos de câncer de endométrio em comparação com tecidos normais.

Conclusão

miR-205 possui um potencial único como um biomarcador de prognóstico no câncer de endométrio.

Citation: Karaayvaz M, Zhang C, Liang S, Shroyer KR, Ju J (2012) significado prognóstico de miR-205 no câncer de endométrio. PLoS ONE 7 (4): e35158. doi: 10.1371 /journal.pone.0035158

editor: J. Christopher Unidos, Universidade de Louisville, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de novembro de 2011; Aceito: 13 de março de 2012; Publicação: 13 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Karaayvaz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Stony Brook University Translational Research Laboratory Start-up fundo (Dr. Ju), R01CA155019 (Dr. Ju) e R33CA147966 (Dr. Ju). Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer endometrial é o tumor maligno mais comum do trato genital feminino nos Estados Unidos [1]. A sobrevida global em cinco anos de cancro do endométrio é de aproximadamente 80% entre todas as fases. Embora tenha uma taxa relativamente baixa de mortalidade em comparação com outros cancros ginecológicos, certos tipos histológicos são altamente invasiva, frequência metastática e têm taxas de sobrevivência pobres. O subtipo mais dominante, o cancro endometrial endometrioid (CEE) é responsável por aproximadamente 80% dos casos. A cirurgia é tipicamente curativa com a maioria destes casos diagnosticados numa fase precoce. Em contraste, pacientes com estado avançado ou cancros endometriais nonendometrioid tendem a exibir características mais agressivos e têm um prognóstico muito menos favorável [2]. Embora as alterações morfológicas reflectir informações importantes sobre o cancro do endométrio, há uma necessidade urgente de biomarcadores de prognóstico moleculares altamente sensíveis e específicos para prever melhor o resultado de cancro do endométrio, em particular em mais de 25% dos tumores do endométrio endometrióides com alto risco de desenvolver mais doenças agressivas.

instabilidade de microssatélites recentemente, estudos moleculares identificaram e mutações no PTEN, K-ras, beta-catenin, p53, HER-2 /neu, p16 e genes e-caderina em casos de cancro do endométrio [ ,,,0],3]. Particularmente, a incidência de PTEN mutações tem sido relatada como sendo o mais elevado entre outras alterações genéticas, existente em 34-55% dos cancros do endométrio [4] – [6]. PTEN é um supressor de tumor importante no cancro do endométrio, e a identificação destes rearranjos moleculares podem ajudar na melhor compreensão da biologia do cancro endometrial, e também podem conduzir à descoberta de novos alvos moleculares para detecção, prognóstico e tratamento. Embora estas alterações genéticas têm sido descritos como importante, eles não são universalmente presente em todos os casos que sugerem que os mecanismos epigenética (tais como microARNs) podem também estar envolvidos.

MicroRNAs (miARNs) são pequenas moléculas de RNA, não codificantes de 19-25 nucleótidos que regulam a expressão do gene de pós-transcricionalmente através da ligação à região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) de mRNAs alvo, causando a clivagem do mRNA, a repressão translacional, ou ARNm de decaimento [3], [7] miARNs têm foi encontrada para regular muitos processos celulares críticos incluindo a apoptose [8] – [11], a diferenciação [12] – [14], e proliferação de células de [8], [13], [15], [16]. expressão aberrante de miARNs é observado na maioria dos tipos de tumores, indicando um papel na carcinogénese e um potencial como biomarcadores de prognóstico /diagnóstico em cancro [17], [18]. Nós razão que miARN pode ser utilizada como um melhor classe de biomarcadores, devido às suas funções reguladoras largos. Além disso, a estabilidade superior do miARNs em tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) e vários fluidos corporais (por exemplo, plasma, soro) facilita ainda mais a utilidade clínica de miARN.

Uma série de estudos recentes têm relataram os perfis de miARNs expressão em cancro do endométrio [19] – [26]. Neste estudo, teve como objetivo investigar o valor prognóstico dos miRNAs utilizando amostras de arquivamento FFPE de pacientes com câncer de endométrio. Nós sistematicamente quantificado as expressões de miRNAs candidatos envolvidos em processos celulares críticos, tais como controle do ciclo celular, chemoresistance, morte celular e de transição EMT (miR-26a, deixe-7g, miR-21, miR-181b, miR-192, miR-215 , miR-200c, e miR-205) utilizando análise quantitativa por PCR em tempo real (qRT-PCR). Estes miARNs foram escolhidas com base nos seus genes críticos de destino que são interrompidos durante a carcinogénese do endométrio (por exemplo, p53, K-ras, PTEN) [27] – [32]. Os nossos resultados mostram que os níveis de miR-200c e miR-205 de expressão foram significativamente sobre-expresso em cancro do endométrio. No entanto, apenas a expressão de miR-205 foi significativamente associada à sobrevida do paciente. Estudos anteriores identificaram PTEN como um dos alvos directos de miR-205 [33], [34]. Considerando a importância da PTEN na biologia do cancro endometrial, temos a hipótese de que o mecanismo de inibição mediada miR-205 PTEN pode ter um

in vivo

relevância fisiológica no câncer de endométrio. Com efeito, os nossos resultados demonstraram que os níveis de miR-205 de expressão foram significativamente inversamente correlacionado com os níveis de expressão de PTEN. Como resultado, nossos resultados sugerem que miR-205 pode ser titular de um potencial único como um biomarcador para o prognóstico de câncer endometrial.

Resultados

A expressão de miRNAs em câncer endometrial humana e avaliação do seu valores prognósticos

os parâmetros clínico-patológicas de 48 pacientes com câncer de endométrio utilizados neste estudo estão descritos na Tabela 1. Metade dos pacientes tinham carcinoma endometrioid, e os demais pacientes foram diagnosticados com a histologia nonendometrioid (13 carcinoma seroso, 5 carcinoma de células claras, 5 maligno tumor misto de Mullerian (MMMT), e um carcinoma indiferenciado). Desses pacientes, 26 casos tiveram fase I (54%), quatro casos tiveram fase II (8%), 6 casos tiveram fase III (13%), e 12 casos tiveram estágio IV (25%) da doença. Para investigar o significado clínico dos miRNAs selecionados nestes doentes com cancro do endométrio, quantificamos seus níveis de expressão de 48 tumor de arquivo emparelhado e amostras normais de tecido FFEP tempo real, análise de qRT-PCR. Dos miARNs testados, não houve diferença significativa nos níveis de miR-26a expressão, deixa-7g, miR-21, o miR-181b, o miR-192 e miR-215 entre tecidos de tumor e as correspondentes amostras normais (P = 0,742 ; P = 0,91; P = 0,641; P = 0,313; P = 0,106; P = 0,336, respectivamente) (Figura 1A-F). Em contraste, a expressão de ambos miR-200c (P 0,0001; Figura 1G) e miR-205 (P 0,0001; Figura 1H) eram significativamente sobre-regulada em amostras de cancro do endométrio em comparação com os tecidos normais adjacentes. Para analisar melhor o significado do miR-200c e miR-205 em termos de prognóstico clínico, análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada, utilizando a sobrevida global do paciente (Figura 2). Nossos resultados indicaram que os níveis de miR-205 de expressão foram significativamente associados com a sobrevida do paciente. Pacientes com níveis baixos (15 vezes de corte de miR-205) tendem a ter melhor sobrevida do que pacientes com altos níveis de miR-205 (razão hazar, 0,377; teste Logrank, P = 0,028) (Figura 2B). Isto apoia a noção de que níveis elevados de miR-205 em tecidos tumorais poderia levar a taxas de sobrevivência piores em pacientes com câncer do endométrio. No entanto, os níveis de miR-200c expressão não foram associados com a sobrevida do paciente (P = 0,576; Figura 2A).

A quantificação relativa dos miRNAs foi expressa como normalizada com um gene de controle RNU6B interno. (A) a expressão de miR-26a (P = 0,742). (B) deixe-7g expressão (p = 0,91). (C) o miR-21 expressão (P = 0,641). (D) Expressão de miR-181b (P = 0,313). expressão (E) miR-192 (P = 0,106). expressão (F) de miR-215 (P = 0,336). (L) a expressão de miR-200c (P 0,0001). (H) expressão de miR-205 (P 0,0001). A significância estatística foi calculada pelo teste t de Student emparelhado.

. Kaplan-Meier curvas de sobrevida global foram traçados com base na expressão de miRNA. (A) miR- expressão 200c (P = 0,576, teste de Logrank). (B) miR-205 expressão (P = 0,028, teste de Logrank).

Correlação de expressão de miR-205 e PTEN em doentes com cancro do endométrio

Tem sido relatado que o miR-205 tem como alvo um gene supressor de tumor PTEN crítica [33], [34], que está frequentemente mutado ou eliminado em cancro do endométrio [4] – [6]. No entanto, alterações genéticas não pode ser responsável por todas as perdas de proteína PTEN observada em carcinomas do endométrio, sugerindo fortemente o envolvimento de uma regulação pós-transcricional da expressão de PTEN [35], [36]. Uma vez que os níveis de expressão de miR-205 foram elevados em tecidos de tumor, nós concluímos que a inibição aumentada de PTEN por miR-205 pode ser um mecanismo fisiologicamente relevante durante a carcinogénese do endométrio. A fim de investigar um

in vivo

relação entre miR-205 e expressão da proteína PTEN, construímos microarrays de tecido (TMAs) a partir de amostras de arquivo de tecido FFPE e realizada imuno-histoquímica com anticorpo PTEN 6H2.1 em TMAs seccionada. Os nossos resultados indicam que a expressão da proteína PTEN foi diminuída em comparação com cancro do endométrio endométrio normal. A Figura 3A mostra que a expressão de PTEN mediano foi significativamente menor em tecidos de tumor (mediana da pontuação 85) em comparação com tecidos normais (mediana da pontuação 132) (P = 0,0058). A Figura 3 (B-E) mostra exemplos de coloração de PTEN em endométrio normal (3B), carcinoma endometrióide (3C), carcinoma seroso (3D), e carcinoma de células claras (3E).

(A) Gráfico de dispersão de imunocoloração pontuações para PTEN no endométrio normal e cancro do endométrio calculado pela quantificação da intensidade de coloração utilizando o software ImageJ. As barras representam a mediana para cada categoria (mediana normal = 85, mediana tumor = 132). a expressão da proteína (B-E) PTEN é detectado no endométrio normal (B), o carcinoma endometrióide (C), carcinoma seroso (D), e carcinoma de células claras (E), como detectado por imuno-histoquímica.

para confirmar ainda mais a relação inversa entre o miR-205 e expressão de PTEN, foi realizada uma análise de correlação de Spearman não paramétrica usando os casos que têm ambos os dados de quantificação de proteínas miR-205 e PTEN. Os nossos resultados indicam a presença de uma correlação inversa em 69% dos casos (coeficiente de correlação de Spearman = -0,502, P = 0,034) (Figura 4A). Figura 4B e Figura 4C mostram exemplos de coloração PTEN acompanhado por níveis de expressão de miR-205 em casos individuais. Figura 4B demonstra um carcinoma indiferenciado com coloração de alta PTEN e apenas um ligeiro aumento da regulação da expressão de miR-205 entre tumor e tecido normal adjacente (-1,25 vezes). Figura 4C demonstra um carcinoma de células claras com muito baixa coloração PTEN e ~350 dobrar-regulação no miR-205 expressão entre tumor e tecido normal adjacente.

(A) Correlação de miR-205 e expressão de PTEN foi analisada por bicaudal Spearman teste de correlação não paramétrico (P = 0,034, Spearman coeficiente de correlação = -0,502). a expressão da proteína PTEN acompanhada por expressão de miR-205 (em triplicado) é ilustrado em casos individuais; carcinoma indiferenciado (B), e carcinoma de células claras (C).

Finalmente, para apoiar a nossa hipótese de que a diminuição da expressão da proteína PTEN é mediada por um controle pós-transcricional, quantificamos os níveis de mRNA PTEN usando reais -tempo de qRT-PCR. Os nossos resultados indicam que os níveis de expressão de ARNm de PTEN em amostras de cancro do endométrio não mostrou nenhuma diferença quando comparado aos tecidos normais adjacentes (Figura 5). Estes resultados sugerem que a falta de correlação de ARNm de PTEN com a perda de proteína de PTEN em cancro do endométrio foi provavelmente devido a um mecanismo pós-transcricionalmente regulados.

A quantificação relativa de ARNm de PTEN foi expressa como normalizado com um controlo interno β-actina do gene (p = 0,31). A significância estatística foi calculada por um teste t de Student pareado.

Discussão

Neste estudo, identificamos significativamente sobre-expressa miR-200c e miR-205 no câncer de endométrio em comparação com tecido endometrial normal (Figura 1). Este resultado é consistente com muitos outros estudos relatando níveis elevados destes dois miRNAs em diferentes tipos de câncer endometrial [19] – [24], [26]. Portanto, sugerimos que a assinatura sobre-expressão destes miRNAs em câncer endometrial não é específica para o tipo histológico. Chung

et al.

Informou que a expressão aberrante de miR-205 foi correlacionada com estágio avançado em câncer endometrial [22]. No entanto, nossos resultados mostraram que a expressão de miR-205 não estava relacionada com a doença em estágio ou tipo de tumor (Figura S1). Descobrimos que a expressão de miR-205 foi significativamente associada à sobrevida do paciente global de tal forma que os pacientes com níveis mais elevados de miR-205 tendem a ter um fenótipo pior sobrevida (Figura 2). Os resultados suportam a noção de que o miR-205 pode ter potencial como um biomarcador para prognóstico negativo de câncer de endométrio e abordagens terapêuticas visando elevados níveis de miR-205 deve ser explorado como uma nova abordagem para melhorar os resultados clínicos.

a família de miR-200 e miR-205 também foram relatados para ser desreguladas em outros tipos de cancro. A família de miR-200 tem sido relatado para ser regulados positivamente em cancro do ovário e colangiocarcinoma [37] – [39], mas sub-regulada no carcinoma hepatocelular, cancro da mama e carcinoma de células renais [40] – [42]. Em contraste, o miR-205 tem sido relatada como sendo sobre-regulada no ovário, bexiga, e carcinomas da mama [37], [43], [44], mas sub-regulada na próstata e cancros esofágicos [45], [46] . Estes padrões de expressão diferentes em alguns tipos de cancro pode reflectir a presença de mecanismos específicos do tipo de tumor que são mediadas por miARNs reguladoras. A função mais bem conhecido da família de miR-200 e miR-205 é a sua capacidade para regular a expressão de E-caderina repressores transcricionais ZEB1 (também conhecidos como δEF1) e SIP1 (também conhecido como ZEB2), factores importantes para mesenquimais epitelial transição (EMT) e metástase do tumor [32]. No entanto, o miR-200 e miR-família 205 funcionam como supressores de tumores através da inibição da EMT. Uma vez que a expressão destes miARNs está aumentada nas amostras de tumor, nós concluímos que outras proteínas visadas por estes miARN pode estar envolvido no cancro do endométrio. Um dos objectivos apresentados de miR-205 é um gene supressor de tumor crítica, PTEN [33], [34].

expressão de PTEN foi relatado para ser reduzido no carcinoma do endométrio [4], portanto, tem uma papel crucial no cancro endometrial biologia [35], [36], [47], [48]. No entanto, mutações /deleções de PTEN não são a única razão para a expressão de PTEN reduzida. Em vez disso, mecanismos epigenéticos, como a metilação do promotor, o aumento da degradação da proteína PTEN ou regulamento através miRNAs também são importantes [49]. Com isto em mente, foram analisados ​​os níveis de expressão de mRNA PTEN e proteína em pacientes com câncer do endométrio. Mostrámos que, embora não houvesse nenhuma mudança na expressão de ARNm de PTEN, a expressão das proteínas PTEN foi diminuída em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais adjacentes. Isto apoia a hipótese de que uma regulação pós-transcricional de PTEN, possivelmente mediada por miARN, é válido. Juntamente com os relatórios que PTEN é o alvo directo de miR-205, os nossos resultados suportam o papel potencial de miR-205 na regulação de PTEN em cancro do endométrio.

De um modo geral, uma diminuição na expressão de PTEN está associada com endometriod o carcinoma e podem ser um biomarcador útil para distinguir entre carcinoma endometrióide de carcinoma seroso [4]. No entanto, outros estudos reportaram nenhuma diferença significativa na expressão de PTEN, sugerindo que PTEN pode não ser sempre útil para distinguir estes subtipos de tumor [50], [51]. Portanto, a utilidade clínica de PTEN como um biomarcador permanece a ser determinada. Nós raciocinar que miR-205 pode ser um biomarcador superior do que PTEN devido ao seu amplo impacto em múltiplos alvos e caminhos.

Em resumo, os nossos resultados indicam que a expressão de miR-205 e PTEN são inversamente correlacionadas em endometrial pacientes com câncer, o que implica o significado fisiológico do mecanismo de inibição PTEN mediada miR-205 na biologia do câncer endometrial. Mais importante, a expressão do miR-205 está associada com a sobrevivência do paciente cancro do endométrio. Assim, raciocinar que miR-205 pode regular PTEN e outra expressão de proteínas na patogênese do câncer endometrial. Futuros estudos são necessários para validar totalmente a utilidade clínica do miR-205 como biomarcador de prognóstico com multicêntricos coortes de pacientes grandes câncer endometrial.

Materiais e Métodos

Ética

Exemplo de Clínica coorte utilizado para este estudo foi aprovado pela Instituição Review Board da Stony Brook University Medical Center. consentimento informado por escrito foi recebida de todos os participantes envolvidos no estudo.

Pacientes e amostras

Aprovação do Review Board instituição foi obtido tanto para a recolha de tecidos e uso de formalina-fixo de arquivo parafina (FFPE) blocos de tecido embutidos. Para a extração de RNA, amostras de tumor e os tecidos normais adjacentes foram obtidos de 48 pacientes com câncer de endométrio submetidas à histerectomia, em Stony Brook University Hospital, Stony Brook, Nova Iorque. As características destes pacientes são mostradas na Tabela 1. Para imuno-histoquímica, tecidos de tumor foram obtidas de 47 pacientes de cancro do endométrio e tecidos endometriais não-patológicas como controlos normais foram obtidas a partir de cinco pacientes com cancro não-endometriais. blocos de parafina contendo espécimes fixados em formalina dos tecidos (FFPE) foram adquiridos a partir das colecções de arquivo do Departamento de Patologia e usado para análises posteriores. Os espécimes foram selecionados 1995-2010 com até 15 anos de acompanhamento clínico informações.

Tissue microarrays (TMAs)

microarrays de tecido foram preparados a partir de blocos de FFPE de espécimes de histerectomia. Hematoxilina e eosina secções coradas de todos os casos foram cuidadosamente revistos. Para cada caso, foram designadas áreas de câncer endometrial e endométrio normal. Usando o Advanced Tissue Arrayer (Modelo: ATA-100, Millipore, Billerica, MA, EUA), com uma agulha de diâmetro 1,5 mm, três núcleos foram extraídos a partir da área de tumor e três núcleos foram removidos a partir do endométrio benigno para cada caso. Os núcleos foram incorporados em um bloco de tissue microarray de parafina em posições pré-determinadas, com até 60 núcleos em cada tissue microarray e dois núcleos adicionais colocados para designar a orientação do bloco.

imuno-histoquímica (IHQ) Análise de PTEN Expression

TMA foram seccionados a 5 ^ m e as secções foram calor imobilizadas em lâminas de vidro a 60 ° C durante a noite. Após desparafinização, a recuperação de antigénio foi realizado num tampão de citrato de [20 mmol /L (pH = 6)] a 120 ° C durante 10 minutos, seguido de peróxido de hidrogénio a 3% durante cinco minutos. A coloração foi aplicado a tecidos FFPE, utilizando um método de avidina-biotina (ABC) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). As secções foram incubadas durante uma hora com um anticorpo monoclonal de ratinho PTEN, PTEN 6H2.1 (Cascade Biosciences, Winchester, MA) a uma diluição de 1:300. Monoclonal de IgG de ratinho (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) foi usada como um controlo de isotipo negativo. coloração PTEN foi visualizada utilizando 3, 3′-diaminobenzidina (Dako, Carpinteria, CA), e as secções foram contrastadas com hematoxilina diluído, desidratados, e lamínulas por microscopia de campo brilhante. Coloração para IHC foi quantificada pela intensidade média de três núcleos de cada caso (software ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/)).

RNA Isolation

Usando tecidos de arquivo FFPE, áreas separadas de tumor e endométrio normal foram identificados utilizando o correspondente hematoxilina e eosina secções de núcleos e medindo 1,5 mm de diâmetro e 2 mm de comprimento (aproximadamente 0,005 g) foram extraídos. Subsequentemente, as amostras foram desparafinadas, hidratadas, digeridas com proteinase K, e, finalmente, os ARN totais foram isolados usando o reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad CA, EUA).

em tempo real de qRT-PCR A análise de miARN Expressão

o miR-26a, deixe-7g, miR-21, miR-181b, miR-192, miR-215, miR-200c, e miR-205 primers específicos e o gene controle RNU6B interna foram adquiridos da Ambion ( Applied Biosystems, CA, EUA). a síntese de cDNA foi realizada pela alta capacidade kit de síntese de ADNc (Applied Biosystems, CA, EUA) com iniciadores específicos de miARN. Em tempo real quantitativa de RT-PCR (qRT-PCR) foi realizada num Applied Biosystems 7500 do sistema em tempo real (instrumento ABI 7500HT) com os iniciadores específicos de miARN por Gene Expression Assay TaqMan.

em tempo real de qRT-PCR análise do ARNm de PTEN

a fim de detectar o ARNm a partir de tecidos FFPE, síntese de cDNA foi realizada pela alta capacidade kit de síntese de ADNc (Applied Biosystems, CA, EUA) com iniciadores aleatórios. Para a análise de qRT-PCR, costume concebidos iniciadores de PCR em tempo real e sondas para PTEN e foram utilizados os genes β-actina de controlo interno (Applied Biosystems CA, EUA). Os iniciadores foram desenhados para obter produtos de amplificação pequenos quanto possível, devido à preocupação sobre a degradação de ARNm em tecidos FFPE [52]. As sequências destes iniciadores /sondas estão listadas na Tabela 2. qRT-PCR foi levada a cabo em um instrumento ABI 7500HT com iniciadores específicos de ARNm por Gene Expression Assay TaqMan sob as seguintes condições: 50 ° C, 2 min de transcrição reversa; 95 ° C, 10 min; 95 ° C, 15 s; 60 ° C, 1 min durante até 40 ciclos (n = 3). A expressão de mRNA PTEN foi normalizado de acordo com o controle interno β-actina, e os valores de expressão relativa foram plotados.

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 5.0 . Gene valores ΔCt expressão de miARN de cada amostra foram calculadas por normalização de acordo com a expressão RNU6B controlo interno, e os valores foram representados graficamente quantificação relativa. As diferenças entre tecidos tumorais e normais foram analisados ​​por um teste t de Student emparelhado. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram gerados para avaliar os níveis de miR-200c e miR-205 de expressão com a taxa de sobrevivência. teste t de Student foi utilizado para analisar a diferença de coloração PTEN entre tecidos tumorais e normais. A significância estatística foi estabelecida para P 0,05 em cada teste

Informações de Apoio

Figura S1..

relação entre a expressão de miR-205 e diferentes estágios de câncer endometrial. expressão de miR-205 foi expressa como normalizados com um gene de controlo RNU6B interna. (A) One-way ANOVA foi utilizado para analisar a associação de miR-205 expressão em fase I, fase II, fase III e estágio IV de câncer endometrial. t-teste (B) de Student independente foi utilizado para analisar a associação de miR-205 expressão em estágio I II

vs

fase III IV

doi:. 10.1371 /journal.pone.0035158.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer Haiyan Zhai, Stephanie Burke, Saira Mehmood, e Penelope Georgakopoulos de assistência técnica e comentários úteis. Agradecemos ao Dr. Xiao Xu (Bioestatística do núcleo para o Digestivo Doenças Research recolha de tecidos Facilidade de Stony Brook University) por sua assistência na análise estatística. Agradecemos a revisão crítica da Sra Sonya Lorrain e sugestões de nossos colaboradores.