Abstract
Fundo
vírus de Epstein Barr (EBV) infecta a maioria da população humana, causando doenças fatais em uma pequena proporção, em conjugação com os factores ambientais. Após a infecção primária, EBV permanece latente na população de células B de memória para a vida. reactivação periódica do vírus ocorre, provavelmente devido à activação dos linfócitos B de memória, o que resulta em replicação virai e re-infecção de linfócitos-B. A metilação do ADN viral no motivos CpG conduz ao silenciamento de expressão de genes virais durante a latência. Zta, a proteína virai chave que medeia o equilíbrio latência /reactivação, interage com o ADN metilado. Zta é um factor de transcrição de ambos os genes virais e hospedeiras. Um sub-conjunto de seu DNA sítios de ligação (Zres) contém um motivo CpG, que é reconhecido na sua forma metilado. A análise detalhada do promotor do gene viral
BRLF1
revelou que a interação com um metilado CpG ZRE (RpZRE3) é a chave para derrubar o silenciamento epigenético do gene.
Metodologia e Descobertas Principais
Aqui nós questionar se podemos usar esta informação para identificar quais genes hospedeiros contêm promotores com elementos de resposta semelhantes. Uma pesquisa computacional de promotores de genes humanos identificados 274 alvos contendo o 7-nucleotide RpZRE3 elemento central. A análise de ligação ao ADN de zta com 17 destes objectivos revelaram que o contexto que flanqueia o elemento de núcleo não tem um efeito profundo sobre a capacidade de zta de interagir com os locais metilados. Um segundo ZRE justapostas foi observado para um promotor. ZTA foi capaz de interagir com este site, embora o co-ocupação com o elemento central RpZRE3 não foi observado.
Conclusões /Significado
Esta pesquisa demonstra 274 promotores humanos têm o potencial de ser regulamentada por ZTA para derrubar silenciamento epigenético da expressão gênica durante a reativação viral de latência
Citation:. Flower K, Hellen E, Newport MJ, Jones S, Sinclair AJ (2010) Avaliação de um protocolo Previsão para identificar alvos potenciais de epigenética reprogramação pelo vírus do câncer Associated Epstein Barr. PLoS ONE 5 (2): e9443. doi: 10.1371 /journal.pone.0009443
editor: Maria G. Masucci, Karolinska Institutet, na Suécia
Recebido: 14 Outubro, 2009; Aceito: 02 de dezembro de 2009; Publicação: 26 de fevereiro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Flower et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo studentships da Universidade de Sussex e Brighton e Sussex Medical School. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução infecta
vírus de Epstein Barr (EBV) e provoca várias doenças em seres humanos, incluindo o linfoma de Burkitt, carcinoma nasofaríngeo, doença de Hodgkin, doença linfoproliferativa pós-transplante e mononucleose infecciosa (febre glandular) [1] – [4]. Como outros membros da família gammaherpesviruses, infecção por EBV persistir para a vida após a infecção primária. O vírus é mantido em estado de latência na memória linfócitos B e reactivação ocasional e replicação é considerado para manter o vírus dentro dos indivíduos [5]. Em linfomas induzidos por EBV, EBV também está presente em estado latente. Em linhas celulares derivadas de linfomas estes, o genoma virai é predominantemente metilado [6] – [9]. O efeito de silenciamento de expressão do gene virai não só evasão auxiliares do sistema imune [10], mas também impede a destruição de células tumorais por replicação viral. Com efeito, a reactivação de EBV de latência foi proposta como uma via para o tratamento de linfomas associados a EBV [11], [12].
latência de EBV é interrompido após activação fisiológica dos linfócitos-B, por meio da expressão de zta (BZLF1, ZEBRA, EB1, Z) [13] – [15]. Zta é uma proteína de ligação a ADN específica da sequência, que se assemelha a família de factores de transcrição bZIP e desempenha um papel crítico na reactivação da expressão de genes virais e a replicação do genoma. Através da interacção directa com elementos de resposta zta (Zres) em promotores, zta regula a expressão de genes virais e celulares. Muitos promotores virais e hospedeiras que foram avaliadas até à data contêm Zres dentro dos proximais cinco centenas de nucleótidos de sequência 5 ‘. Até agora, oito foram verificados experimentalmente sites para ZTA obrigatório em suas regiões promotoras proximais:
BSLF2 + BMLF1
[16], [17];
BRLF1
[18];
BZLF1
[17], [19], [20]; o promotor conjunta para
BHLF1
e
BHRF1
[19]; o lítica
EBNA1
promotor Fp [21];
BRRF1
[22]; e
BMRF1
[23]. Além disso, 6 genes do hospedeiro estão diretamente regulada por ZTA através Zres em seus promotores
DHRS9
[
24
];
EGR1
[25], [26];
CIITA
[27];
IL-8
[28];
IL-10
[29]; e
IL-13
[
30
]. ZTA interage com uma gama diversificada de Zres [31] e vários sites existem em alguns promotores ZTA-responsivos, por vezes em estreita proximidade. Um exemplo é o promotor viral para o
BZLF1
gene, Zp, que contém os dois ZIIIA e ZIIIB Zres funcionais dentro de uma extensão total de 20 nucleótidos [17], [19], [20].
zta tem a característica invulgar de interagindo com um sub-conjunto de Zres que contêm um motivo CpG metilado [32]. Em alguns casos zta é capaz de interagir com o ZRE não metilado, enquanto que para outros Zres a interacção com zta é dependente de metilação [22], [26], [32] – [34]. Isto levou à classificação de Zres em três classes: Classe I Zres não contêm um motivo CpG; Zres classe II contêm um motivo CpG que é reconhecida em ambos os estados metilados e não metilados; e classe III Zres contêm um motivo CpG mas apenas são reconhecidos quando metilado [35]. A capacidade de zta para interagir com contendo CpG Zres metilados permite zta para activar a expressão do gene no genoma viral latente apesar do estado de metilação repressiva e, assim, reverter a silenciamento epigenético do genoma viral [22], [32] – [35].
Até o momento, três genes com contendo CpG Zres foram estudados: EBV
BRLF1
, EBV
BRRF1
e humano
EGR1
[22], [26], [32] – [35]. Destes, a investigação da regulação do gene EBV
BRLF1
forneceram evidências convincentes de que a interação de ZTA com um ZRE metilado foi fundamental para a reativação do EBV em ciclo lítico em linfócitos-B [32] – [35]. O viral
gene BRLF1
inclui três Zres em promotor região proximal [18], [32]. Dois dos Zres contêm motivos CpG; RpZRE2, é um ZRE classe II e a outra, RpZRE3 é uma classe III ZRE [35]. A capacidade de um único ponto de mutação no zta para diferenciar entre a interacção de zta com RpZRE3 metilado e não metilado permitiu a relevância da interacção de zta com este promotor seja estabelecida [34], [36], [37]. O viral
gene BRRF1
contém dois Zres contendo CpG, que ZTA única interage em seus estados metilados [22]. A presença de um ZRE que contém CpG no promotor do humano
EGR1
gene, que é reconhecido por zta na sua forma metilada, sugere que o EBV pode tombar epigenética silenciamento de genes do hospedeiro de forma a modular a célula hospedeira ambiente [26].
O elemento central RpZRE3 (TCGCGAA), que foi claramente demonstrado que é necessário para derrubar silenciamento epigenético de
BRLF1
em linfócitos-B [34], [36], [37], foi escolhido para identificar todos os genes humanos que contêm uma correspondência exata a esta CpG contendo ZRE dentro de -500 a uma região do promotor e avaliar se eles são reconhecidos por ZTA no seu contexto natural.
Materiais e Métodos
Identificação de Promotores humano contendo RpZRE3-core Elements: amostragem
as regiões do promotor inicial (definido como -500 a +1 pares de bases do local de início da transcrição) de uma amostra de genes codificadores de proteínas humanas em Ensembl (49) [38] foram extraídos utilizando o sistema de gestão de dados Biomart [39]. A amostra representou 40% do genoma humano. A pesquisa foi feita para todas as ocorrências de um exato (frente e verso) jogo para identificar os promotores com o elemento central TCGCGAA RpZRE3
Identificação de Promotores humano contendo RpZRE3-Core Elements:. Whole Genome Scanning
Um ecrã idêntico foi realizado em todo o genoma humano a partir de Ensembl (50) [40], resultando na identificação de 274 promotores que foram designadas a RpZRE3-promotor-274-conjunto de dados. Os 7 nucleótidos do elemento de núcleo RpZRE3, juntamente com 10 nucleótidos que flanqueiam em cada lado, foram extraídos a partir de cada um dos genes de 5 a amostragem inicial. A transcrição do Factor Binding Site (TFBS) módulos Perl [41] foram usadas para criar um peso Matriz Posição (PWM), com base em todo o comprimento destas sequências de 27 nucleótidos. módulos TFBS Perl também foram utilizadas para pesquisar as regiões promotoras (-500 a +1) de todos os genes codificadores de proteínas humanas em Ensembl 50 [40], que foram extraídos utilizando Biomart [39]. Os promotores que combinavam com o PWM com um valor de limiar 80% e continha uma correspondência exata para o elemento RpZRE3-core foram adicionalmente filtradas usando 2 critérios (a) a presença de ilhas CpG e (b) função (com base no excesso representação do Gene Ontology (GO) termos [42]). A localização de ilhas CpG foram previstos utilizando o programa EMBOSS CpGPlot [43] com as opções padrão. Apenas os genes com uma ilha de CpG presente no promotor foram retidos. As anotações GO prazo para a função molecular e os processos biológicos foram extraídos a partir de Ensembl para cada gene [40]. O número de genes no conjunto de dados promotor RpZRE3 com cada termo GO anotação foi comparado com o número total de genes em Ensembl com o mesmo termo GO. Os termos GO que ocorreram com uma frequência significativamente maior (p 0,05) no conjunto de dados RpZRE3, em comparação com o genoma inteiro, foram definidos como sobre-representados
DNA Binding Análise da AESM, em RpZRE3 contendo promotores
.
de cadeia dupla sondas de ADN marcadas foram feitas por marcação de 6 pmol de oligonucleótido (27 nt de comprimento) na extremidade 5 ‘com [γ-
32P] ATP (30 uCi), utilizando cinase de polinucleótido (Roche). 12 pmol de oligonucleótido da cadeia complementar e incubou-se com a cadeia simples marcado a 95 ° C durante 2 minutos, 65 ° C durante 10 minutos, e 37 ° C durante 30 minutos para emparelhar as cadeias. A concentração da sonda foi de 33,3 nM. Os oligonucleótidos composto do núcleo 7-mer sequência rodeado por 20 nucleótidos correspondentes à sequência flanqueadora cognato para cada promotor e foram sintetizados. Quando indicado na figura, o motivo central CPG foi metilado em ambas as citocinas durante a síntese (Sigma).
Proteína
ZTA era
in vitro
traduzido usando extrato de germe de trigo (Promega). Isto foi incubado com a sonda marcada (numa concentração final de sonda de 3,3 nM) durante 30 minutos à temperatura ambiente, antes de a amostra foi fraccionada num gel de poliacrilamida nativo 8% a 100 volts durante 1 hora. Após detecção do ADN marcada com um radioisótopo utilizando um Phosphorimager Storm os sinais relativos foram quantificadas utilizando o software ImageQuant (GE Healthcare, Reino Unido).
EMSAs de competição foram realizadas com um excesso de 100 vezes de um oligonucleótido de cadeia dupla não marcado em adição à reacção de EMSA padrão. Quantidades iguais de cada um dos oligonucleótidos complementares foram hibridados na mesma maneira que as sondas marcadas e diluiu-se para se obter uma concentração da solução de 3,33 uM. Isto foi adicionado à reacção de EMSA a uma concentração final de 333 nM (ou seja, excesso de 100X).
oligonucleótidos
Os oligonculeotides utilizados eram as versões de cadeia dupla das seguintes sequências (5′-3 ‘ ):
XPC GGTGCGTCACTCGCGAAGTGGAATTTG
ZC3H8 GCTTCCCGGCTCGCGAAAGGGAGGACC
HDAC2 TCCCCCACTGTCGCGAAGCTCCCGCCC
MNT CCGCGGCGTCTCGCGAAGGGAGGGGCG
A ciclina L2 GGGCGGCTCCTCGCGAAGCTCCACGGC
RpZRE3 GTTTATAGCATCGCGAATTTTGAGTGC
CAPN2 CCGGGGAGGCTCGCGAATCGCGGTCCA
CDO1 CGTCCCAGCGTCGCGAACCACAGCGGC
FALZ GGCGCGCAGCTCGCGAAATGCCCGGCG
KIF1B GCTTCGGCCCTCGCGAAACTCCGCCCG
LLGL1 TCGGCCGGGCTCGCGAAGGGACGCCCG
LMO4 GGATCCCGGGTCGCGAAGGGCAGCCCA
MBD4 CCTCCTGCTCTTCGCGAACCGCCCCGC
PLEKHJ1 AGCCGCTCCCTCGCGAAAGTTGGCCCC
PRKD1 CTTCCTGGGGTCGCGAACTTCCCGGGC
SEC14L CGCCCGCTACTCGCGAAGCCCAGCCCG
TADA3L GCTGCGCTTCTCGCGAAAGGGCAGGCA
TOP2B CCGCGCCCCATCGCGAAGATCCGGAGC
XPCLMNTR GGTGCGTCACTCGCGAAGGGAGGGGCG
MNTLXPCR CCGCGGCGTCTCGCGAAGTGGAATTTG
XPC mCore GGTGCGTCACCCCCTTAGTGGAATTTG
XPCLM3Mcore GGTCCGCCTCCCCCTTAGTGGAATTTG
AP1 mut GATCCACCCCTTAGAGGAAAACATACG
Previsão de Fator de Transcrição Encadernação Sites Usando Promo
a ligação do factor de transcrição PROMO site do programa previsão [44] foi utilizado com a configuração padrão do valor de dissimilaridade de 15%, para identificar potencial factor de transcrição bZIP sítios de ligação dentro do oligonucleotídeo XPC.
Resultados
Identificação de promotores humano que contenham a RpZRE3-core elemento: amostragem
inicial
a busca inicial para elementos RpZRE3-core em uma amostra de promotores humanos revelou 67 genes com um núcleo RpZRE3 elemento . 5 destes que estão envolvidos na regulação de genes foram selecionados para análise de ligação ao ADN. Estes genes foram ZC3H8 5 (ENSG00000144161), HDAC2 (ENSG00000196591), XPC (ENSG00000154767), MNT (ENSG00000070444) e CyclinL2 (ENSG00000116148) e em conjunto com o elemento RpZRE3 do viral
BRLF1
promotor (R), formada o promotor RpZRE3-6-dados-conjunto.
os ensaios de ligação de ADN foram realizadas com as formas metiladas de cada um dos 5 promotores humanos utilizando 27mer oligonucleótidos de cadeia dupla abrangendo o elemento de núcleo 7-nucleótidos e 10 nucleótidos que flanqueia região de cada lado, juntamente com RpZRE3 de Rp. ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) foram realizadas com o
in vitro
traduzido proteína ZTA. complexos de proteína /ADN zta formado prontamente com os oligonucleótidos de todos os seis promotores (Figura 1). A especificidade do ensaio é mostrado pela ausência de formação de um complexo com proteína de controlo. Além disso, realizámos experiências de competição com um excesso de oligonucleótidos não marcados e incluiu uma versão com um ZRE mutante para investigar mais a especificidade da interacção. Isto confirma que zta interage com todos os seis elementos centrais RpZRE3 especificamente.
(a) a sequência de nucleótidos de um cordão de cada oligonucleótido que mede os Zres indicados é mostrado, com o elemento conservado RpZRE3 núcleo (TCGCGAA) alinhados. versões cadeia dupla destas sequências foram usados como sondas em EMSA, com os 2 citosinas dentro do motivo central CpG metilado. O promotor a partir de RpZRE3 EBV BRLF1 está incluído. (B) ligação do DNA entre
in vitro
traduzido ZTA com cada sonda foi realizada por EMSA. A capacidade de zta (Z) para interagir com a sonda foi comparado com um lisado de tradução não programado (C) como um controlo negativo. O complexo foi separado num gel de 8% por electroforese e visualizados por phosphoimaging. A sonda em excesso pode ser visto, na parte inferior do gel. A sonda utilizada em cada ensaio está indicado abaixo do gel. (C) Concorrência de cada sequência ZRE (pelo 100X excesso) contra RpZRE3 marcado foi determinada por EMSAs concorrência. Dados de pelo menos 2 experiências foi feita para calcular competição isto é, a percentagem de sonda marcada deslocada pelo competidor não marcado. Zres metilados foram utilizados tanto para sonda e competição. AP1 mut, um oligonucleótido não mostrado anteriormente para interagir com zta [36], foi usado como um controlo negativo para definir o nível de ligação não específica. As barras de erro indicam erro padrão
Identificação de Promotores humano contendo RpZRE3-Core Elements:. Whole Genome Scanning
O genoma humano completo foi digitalizada para elementos adicionais RpZRE3-core. Isto resultou em uma data-conjunto de 274 genes, denotava o RpZRE3-promotor-274 de dados em conjunto (ver Tabela S1). Para avaliar se houve uma influência da sequência flanqueadora da interação de ZTA com estas Zres que empreendemos um processo de filtragem sistemática. O conjunto de dados RpZRE3-promotor-274 foi primeiro filtrada por um peso Matriz Posição (PWM), o qual foi gerado a partir dos dados-conjunto RpZRE3-promotor-6. Partidas foram posteriormente filtrada para genes com pelo menos uma ilha CpG no promotor e um termo GO sobre-representados. Isto resultou em 12 promotores anteriormente não identificados e em mais um que tinha sido identificado na triagem inicial (Figura 2). Juntamente com os promotores a partir da tela inicial eo viral
BRLF1
promotor (RpZRE3-promotor-6 Conjunto de dados), estes formam a RpZRE3-promotor-18 conjunto de dados.
(a ) a análise bioinformática realizado para a ampla análise do genoma é representado como um diagrama de fluxo. entrada ou saída genética é representado por ovais e filtros de trapézios. (B) A posição do peso Matrix (PWM) foi criado usando as sequências alinhadas da data-set RpZRE3-promotor-6. Estas sequências são mostradas na Fig. 1 (a). Este foi usado para filtrar os dados genómicos a partir das sequências de promotor humanos (-500 a +1). (C) sobre-representados GO termos encontrados para os 274 genes foram identificados. (D) Os 13 genes identificados como genes candidatos, 12 genes previamente desconhecidos e 1 a partir da tela inicial, e seus códigos de adesão ENSEMBL associados.
Os oligonucleótidos foram projetados usando os mesmos princípios com 10 nucleotídeos de flanqueamento sequência de cada lado do elemento de RpZRE3-núcleo, e a capacidade de interagir com zta para cada local na sua forma metilada foi avaliada. A análise EMSA revelou que todos os doze dos promotores metilados recentemente identificados foram reconhecidos pelo ZTA (Figura 3).
análise EMSA com
in vitro
traduzido proteína ZTA (Z) ou um não programado lisado tradução (C) com as sondas indicadas para a direita de cada gel foi efectuada tal como descrito na Fig. 1.
Esta análise demonstrou que para o RpZRE3-promotor-18-conjunto de dados, a sequência de flanqueamento em torno do núcleo metilado elemento 7-mero não tem um efeito profundo sobre a capacidade de interagir zta com os promotores e, portanto, o elemento central foi suficiente para facilitar a ligação. Isto foi ilustrado pela geração de uma sequência de PWM usando-RpZRE3 do promotor-18 do conjunto de dados (Figura 4), que revelou conservação da sequência negligenciável do lado de fora do elemento de núcleo.
(a) um peso Matriz Posição (PWM), criado usando as sequências sonda do conjunto de dados RpZRE3-promotor-18.
o reconhecimento dos promotores não metilado
ZTA é capaz de reconhecer muitos elementos de resposta que fazer não contém um motivo CpG e, por conseguinte, não têm um elemento de núcleo metilado (Classe I Zres) [15], [35]. Além disso, reconhece um zta ZRE contendo CpG, RpZRE2, mesmo na ausência de metilação (Classe II Zres) [33]. A capacidade de zta para reconhecer os promotores nas suas formas não-metilados podem ter impacto sobre a capacidade de EBV de alterar a sua expressão do gene, de modo que investigaram a classificação de ZRE para cada um dos 17 promotores humanos.
Uma série de experimentos com os oligonucleotídeos que representam os promotores humanos no RpZRE3-promotor-18 conjunto de dados ligação de DNA, foram realizados comparando não metilado com elementos RpZRE3-core metilados. A interacção de zta com os locais foi quantitativa, tal como demonstrado pela redução na formação de complexo, como a concentração de proteína zta foi titulada em cada um dos promotores metilados (figura 5). Todos barra de um visor de ligação desprezável para os oligonucleótidos não metilados (pelo menos 10 vezes menor do que para os locais metilados) e podem, portanto, ser classificados como Zres classe III.
de ligação ao ADN de análise
in vitro
proteína traduzida zta (Z) ou um lisado de tradução não programado (C) com as versões não metilados e metilados de as sondas indicados à direita de cada gel foi levada a cabo por EMSA como descrito na Fig. 1. A titulação de proteína zta (01:02, 01:04, 01:08) foi utilizado para comparar não metilado de ligação para que o equivalente de metilado. A quantificação dos complexos formados entre as sondas e zta não metilados e metilados, a partir de pelo menos 2 experiências, é representada como um histograma para a direita do gel correspondente. A formação do complexo é mostrada em relação à ligação a cada sonda máxima. As barras de erro indicam erro padrão
ZTA exibida uma interação reprodutível com o oligonucleotídeo não metilado XPC.; a interacção chegou a 50% da ligação observado com o oligonucleótido metilado (Figura 5). Isso levanta a possibilidade de que o núcleo XPC elemento RpZRE3 é influenciada pela sequência de flancos para se comportar como um ZRE classe II.
adicionais ZRE justapostos com um elemento RpZRE3-Core em Flanquear Região de
Para identificar se sequências que conferem reconhecimento independente metilação estava confinada a um flanco de XPC específica, uma série de sondas de oligonucleótidos que mutantes trocados entre sequências de flanqueamento XPC e um local de classe III (MNT), que não é reconhecido quando não metilado, foram concebidos. A análise da interacção com zta por EMSA revelou que a capacidade de conferir zta ligação residia dentro da sequência 5 ‘de XPC; XPCLMNTR o híbrido foi capaz de ligar-se, mas não foi MNTLXPCR (Figura 6). Isto sugeriu que a sequência flanqueadora 5 ‘XPC do elemento de ligação RpZRE3 influenciado. No entanto, foi surpreendente descobrir que a mutação do elemento RpZRE3 dentro XPC não evitar a interacção com zta (Figura 6).
(a) Representação esquemática das sondas, que ilustra as sondas XPC e MNT, e o sondas de swap flanco XPCLMNTR e MNTLXPCR, adjacente à análise EMSA correspondente, realizado na mesma maneira que a descrita na Fig. foi realizado 1. (b) Quantificação dos complexos formados com cada sonda, a partir de 2 experiências. A formação do complexo é representada como uma percentagem do complexo zta com a sonda XPC não-metilada. As barras de erro indicam o erro padrão. (C) Representação esquemática das sondas, indicando sequência núcleo mutado. Análise EMSA foi realizado como descrito na Fig. foi realizado 1. (d) A quantificação dos complexos formados com cada sonda, a partir de 2 experiências. A formação do complexo é representada como uma percentagem do complexo formado com o zta XPC sonda não-metilada. As barras de erro indicam o erro padrão.
Uma outra explicação para a interacção de zta com o promotor XPC não metilado é que um ZRE obscura está presente no flanco 5 ‘. Para abordar esta mais uma tentativa para identificar Zres putativos no promotor XPC usando o fator de transcrição de ligação site do programa previsão PROMO [44], [45]. Embora este programa contém um PWM para sítios de ligação ZTA, nenhum foi previsto nesta sequência. No entanto, promo prevista a presença de AP1, c-fos e c-jun locais dentro de flanco 5 ‘do XPC (5’TGCGTCA) (Figura 7) de ligação. c-fos e c-jun proteínas são ambos membros da família dos factores de transcrição bZIP; eles formam actividade de ligação a ADN AP1 quer como homodímeros ou heterodímeros. É relevante que os dímeros fos /jun partilhar alguns motivos de reconhecimento de ADN com zta [15] – [17], [31], [46] – [49]. Isto levou à hipótese de que o local AP1 previsto na sequência flanqueadora 5 ‘é um ZRE adicional que é responsável pela ligação ao oligonucleótido não metilado XPC. Para testar a hipótese de, mais mutações foram introduzidas na sequência flanqueadora 5 ‘XPC no local previsto AP1 (5’TCCGCCT). A capacidade de zta para interagir com o AP1 /núcleo local duplo mutante (XPCLM3Mcore) foi comparada com a do núcleo somente mutante. dupla mutação do local previsto AP1 e o núcleo abolida a capacidade de zta para interagir com o oligonucleótido XPC, demonstrando que a ligação do zta ao local XPC não metilado residia com este local AP1 (Figura 7).
(a) factor de transcrição PROMO local de ligação ao software de previsão identificado um sítio que é AP1 em destaque na sequência de flanco 5 ‘do XPC. As mutações de nucleótidos específicos estão sublinhados. Os complexos formados por EMSA são mostrados à direita da sequência de sonda correspondente. , A partir de 2 experiências, foi realizado (b) quantificação dos complexos formados com cada sonda. A formação do complexo é representada como uma percentagem do complexo formado com o zta XPC mutado sonda núcleo. As barras de erro indicam o erro padrão.
Esta análise mostrou que o elemento de núcleo RpZRE3 não é reconhecido no seu estado não metilado, no contexto de qualquer um dos promotores virais ou celulares na RpZRE3-promotor-18 dados em conjunto, e que esta ZRE é especificamente reconhecida quando metilado.
Discussão
uma pesquisa computacional revelou um conjunto de 274 genes humanos com promotores celulares que contêm o elemento central 7-mer RpZRE3. sequência de flanqueio podem influenciar a interacção de alguns factores de transcrição com o DNA, por exemplo, a interacção da família E2F com ADN é influenciada por uma região de pelo menos 8 nucleótidos 5 ‘e 11 nucleótidos 3’ do nucleótido central [50]. Antes de atribuir todos os 274 genes como candidatos a regulação por ZTA, era importante para avaliar se a sequência lateral cognato teve um profundo efeito sobre a ligação por ZTA. Consideração das sequências representadas na sequência lateral deste conjunto de genes revelou que ele seja diversificada; todos os quatro nucleotídeos foram representadas em 55% dos cargos e três dos quatro nucleotídeos foram representados nas posições restantes. Com efeito, o flanco imediata do elemento de núcleo RpZRE3, que consiste de quatro nucleótidos, tanto a 5 ‘e 3’, tinha representação de 100% de todos os quatro nucleótidos. Por conseguinte, pode concluir-se que a sequência de flanqueio não impede a ligação ao núcleo RpZRE3 metilado, e um PWM gerado a partir do promotor RpZRE3-18-dados-conjunto mostrou pouca conservação fora do motivo do núcleo. Em contraste, a interacção com o elemento de núcleo não-metilada inicialmente parecia ser influenciada pela sequência de flanqueamento em apenas 1 dos 18 promotores. No entanto, uma análise mais profunda revelou que isso seja devido à presença de um segundo ZRE na sequência flanqueadora.
Estes resultados mostram que a abordagem de realização de um padrão de pesquisa computacional partida para o elemento de núcleo RpZRE3 7-mer é um método rápido e confiável para identificar promotores contendo Zres que são reconhecidos pelo ZTA apenas quando eles são metilados (classe III) Zres
a identificação de dois Zres justapostos adjacentes no promotor XPC apresenta um problema interessante.; pode ambos os sites ser ocupados ao mesmo tempo? A justaposição natural de Zres foi previamente descrito para um promotor viral;
BZLF1
e um promotor celular
EGR1
. Na
BZLF1
promotor, os elementos estão situados com 12 pares de bases entre os nucleótidos centrais; ambos podem ser ocupados simultaneamente e ambos são funcionalmente relevantes [17], [19] – [20]. Para o
promotor EGR1
, os elementos são imediatamente adjacente com apenas 8 nucleotídeos entre os nucleotídeos centrais [25], [26]. Não há nenhuma evidência para a ocupação simultânea por zta e somente um elemento parece ser funcional
In vivo
[26]. O arranjo do
XPC
promotor coloca os elementos 8 nucleótidos à parte, idênticas às
EGR1
, e não há nenhuma evidência das experiências de ADN de ligação para a ocupação simultânea dos sites. Como um ZRE é reconhecido de uma maneira dependente da metilação e o outro é reconhecida quando não metilado, é possível que a disposição pode proporcionar um mecanismo de segurança para assegurar que o gene é regulado em ambos os seus estados metilados e não metilados .
a abordagem computacional simples tomadas para identificar a localização do motivo de ligação de metilação do DNA-dependente e romance em promotores de genes humanos identificados 274 genes potencialmente regulados pela superação silenciamento epigenético durante o ciclo replicativo viral. Dadas as funções conhecidas de ZTA na reprogramação expressão genética viral, interrompendo controle do ciclo celular e replicação do DNA viral, é interessante notar que os termos Gene ontologia que estão sobre-representados no RpZRE3-promotor-274 gene-set são em grande parte envolvido em transcrição, cromatina re-modelação e mitose. Isto sugere fortemente que ZTA pode ativar este conjunto de genes celulares a fim de realizar estas funções. Testando se esses genes são ativados durante a interrupção latência na memória linfócitos B
in vivo
é tecnicamente desafiador dado tanto a escassez de linfócitos B de memória na circulação periférica e a raridade de interrupção latência
in vivo
.
o co-localização do elemento central RpZRE3 em 274 promotores humanos é improvável que tenha sido impulsionada por uma vantagem evolutiva para o vírus, mas pode refletir o envolvimento de um factor de transcrição celular interagindo com o mesmo elemento . Isto sugere que este conjunto de genes compartilhar um modo comum de regulação durante o desenvolvimento ou diferenciação humana. Além disso, será interessante questionar se co-ocorrência do elemento RpZRE3-core com sítios de ligação de outro factor de transcrição formando uma cooperativa
cis
-regulator módulo que pode iluminar a regulação destes genes do hospedeiro e virais .
Informações de Apoio
Tabela S1.
RpZRE3-promotor-274 de dados em conjunto:. Uma tabela de genes que contêm um elemento central RpZRE3 na região promotora do 500 pb
doi: 10.1371 /journal.pone.0009443.s001
(0.05 MB XLS )
Reconhecimentos
Agradecemos Queensta Miller e James Heather para discussão.