Abstract

hipermetilação DNA no sangue está se tornando um marcador candidato atraente para o cancro colorectal ( CRC) de detecção. Para avaliar a precisão do diagnóstico de marcadores hipermetilação de sangue para CRC em diferentes contextos clínicos, foi realizada uma meta-análise de relatórios publicados. De 485 publicações obtidos na pesquisa inicial literatura, 39 estudos foram incluídos na meta-análise. hipermetilação marcadores no sangue periférico revelou um elevado grau de precisão para a detecção de CRC. A sensibilidade resumo foi 0,62 [intervalo de confiança de 95% (CI), 0,56-0,67] e especificidade foi de 0,91 (IC 95%, 0,89-0,93). análise de subgrupo mostraram significativamente maior sensibilidade para o gene Septin 9 metilado (

SEPT9

) subgrupo (0,75; 95% CI, 0,67-0,81) do que para os não-metilado

SEPT9

subgrupo (0,58; 95% CI, 0,52-0,64). Sensibilidade e especificidade não foram afetados significativamente pelo número de destino gene, CRC encenação, região de estudo, ou método de análise de metilação. Estes resultados mostram que os marcadores hipermetilação no sangue são altamente sensível e específico para a detecção CRC, com metilado

SEPT9

sendo particularmente robusta. O desempenho diagnóstico de marcadores hipermetilação, que têm variado em diferentes estudos, pode ser melhorada pela otimização do marcador. Pesquisas futuras devem examinar variação na precisão do diagnóstico de acordo com fatores não-neoplásicas

Citation:. Li B, Gan A, Chen X, Wang X, Ele W, Zhang X, et al. (2016) Desempenho de diagnóstico de DNA hipermetilação marcadores no sangue periférico para a detecção do câncer colorretal: uma meta-análise e revisão sistemática. PLoS ONE 11 (5): e0155095. doi: 10.1371 /journal.pone.0155095

Autor: John Green, University Hospital Llandough, REINO UNIDO

Recebido: 04 de janeiro de 2016; Aceito: 25 de abril de 2016; Publicado em: 09 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Natural Science Foundation da província de Guangdong (2015A030310057)

Conflito de interesses:. os autores declararam que nenhum concorrente existem interesses.

Introdução

o câncer colorretal (CCR) é a terceira causa mais comum de morte por câncer em os EUA [1]. A sequência de adenoma-carcinoma colorrectal normal do carcinogenesisis está bem estabelecida. A identificação e gestão de CRC em estágio inicial ou lesões pré-malignas são intervenções altamente eficazes que reduzem substancialmente a mortalidade ea morbidade CRC-specific. Assim, grande esforço está sendo focada no desenvolvimento de estratégias de detecção precoce

As diretrizes atuais dividir CRC rastreio abordagens em duas categorias:. Métodos invasivos e não invasivos [2]. métodos invasivos, como a colonoscopia, continuam a ser as ferramentas de rastreio primário devido a um desempenho muito bom de diagnóstico, permitindo a detecção e remoção de lesões pré-cancerosas. No entanto, as abordagens invasivos requerem uma preparação extensa do intestino, invasão da privacidade dos pacientes, e sedação. Baixa adesão triagem entre os pacientes representa um desafio para o desenvolvimento de estratégia de rastreio CRC. abordagens de rastreio não-invasivos, tais como exames de sangue oculto nas fezes e teste imunoquímico fecal (FIT), não são muito eficazes. Estes métodos não detectar a maioria dos adenomas avançados [3], e eles requerem a adesão do paciente em amostras de fezes de auto-recolha anualmente para a detecção de sangue oculto [4]. Até à data, as melhorias na sensibilidade e facilidade de uso de testes de fezes baseada não aumentaram o cumprimento na triagem CRC.

As expectativas para a nova geração de testes de rastreio baseados em biomarcadores moleculares presentes no sangue estão aumentando. Estes testes devem melhorar a adesão do paciente e, assim, aumentar a detecção CRC em estágio inicial, como evidenciado pelo sucesso de outros programas de rastreio, tais como aqueles baseados em alfa-fetoproteína para o carcinoma hepatocelular e antígeno prostático específico para câncer de próstata [5, 6]. Na última década, um grande corpo de pesquisa revelou várias alterações genômicas associadas à CRC, incluindo

APC

,

TP53

,

EGFR,

BRAF

e

KRAS

mutações. No entanto, cada vez mais evidências sugere que as mudanças epigenéticas são de importância semelhante como alterações genéticas na patogênese da CRC. metilação aberrante de fosfato C-L-ilhas (CPG) nas regiões promotoras de genes leva ao silenciamento transcricional de genes supressores de tumores. Níveis de DNA metilado circulando sem no sangue são aumentados em pacientes com câncer comparados com controles saudáveis ​​[7, 8]. metilação do DNA está entre os processos epigenéticos mais estudados no CRC. Análise de genes metilados específicas no CRC oferece uma variedade de novas oportunidades para o desenvolvimento de biomarcadores [9-11]. biópsias líquidos têm emergido como uma fonte de biomarcador. Detecção de biomarcadores em fluidos biológicos oferece vantagens, incluindo a capacidade de invasão mínima e fácil acessibilidade. Em particular, as amostras de sangue são uma fonte prática para biópsias para a detecção de biomarcadores de CRC. A hipermetilação de genes supressores de tumores no plasma ou soro de pacientes com CCR foi mostrado uma promessa como uma metodologia potencial para a detecção da doença [12].

A detecção de septina metilado de forma aberrante 9 (

SEPT9

) no plasma pode ser um teste valiosas e não-invasiva de reacção em cadeia de polimerase baseada em sangue (por PCR), com quase 70% de sensibilidade e especificidade de 90% para a detecção de CRC [13-16]. O utilitário de metilação para a detecção CRC tem sido relatada em um número crescente de genes, incluindo

THBD

,

NEUROG1

,

HIC1

,

DAPK

,

APC

,

MDG1

, e

TPEF

[17-21]. À medida que estas alterações ocorrem epigenética nas fases iniciais do desenvolvimento do tumor, incluindo em lesões pré-cancerosas, tais como adenomas, que pode ser útil para o diagnóstico de doenças malignas.

O desempenho diagnóstico de biomarcadores hipermetilação genéticos foi examinado em muitos estudos e tem variado muito [12, 14, 15, 19, 21-31]. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que tais alterações poderiam servir como marcadores diagnósticos eficientes para CRC. No entanto, nenhuma meta-análise com critérios padronizados de inclusão, extração de dados e tratamento estatístico foi realizado para fornecer uma visão abrangente da exatidão e precisão desses métodos. O objetivo desta meta-análise e revisão foi estabelecer a sensibilidade e especificidade de biomarcadores hipermetilação utilizando dados de pacientes com e sem CRC, com resultados histopatológicos servindo como standard.Patients de referência com adenomas não foram incluídos devido à falta de alta suficientes relatórios de pesquisa de qualidade enfrentá-los.

Materiais e Métodos

estratégia de busca Literatura

Foram pesquisados ​​o Embase, PubMed, Biblioteca Cochrane, Ovid, Science Direct, web of Science, e Google Scholar bases de dados internacionais, e quatro bancos de dados chineses [Infra-estrutura chinesa Knowledge Nacional, Wan fang DADOS, chinês Biomedical Literatura banco de dados de disco, e Tecnologia de Chongqing (VIP)] para identificar artigos relevantes publicados através do 30

de abril de 2015. as palavras-chave utilizadas para a recuperação de literatura foram “epigenética” ou “metilação” ou “hipermetilação” ou “desnaturado” e “colorectal” ou “dois pontos” ou “reto” e “câncer” ou “carcinoma” ou “tumor” ou “neoplasia “ou” adenocarcinoma “e” soro “ou” soro “ou” sangue “ou” plasma “. Para identificar artigos relevantes adicionais, nós fizemos a varredura resumos de conferências e listas de referência dos artigos identificados na busca inicial. Entramos em contato com autores para obter informações adicionais quando necessário. O conselho de revisão institucional de Huizhou primeiro hospital dispensou a exigência de aprovação ética.

Os critérios de inclusão e exclusão

Dois revisores (BS Li e XL Chen) avaliadas de forma independente todas as publicações identificadas para determinar sua elegibilidade para inclusão no estudo. Qualquer desacordo foi resolvido por meio da discussão até que o consenso foi alcançado. Estudos que satisfaçam os seguintes critérios foram incluídos na amostra: (1) confirmação histopatológica do diagnóstico de CRC, que é amplamente considerado como o padrão-ouro; (2) coleta de sangue periférico antes de qualquer tratamento; (3) O artigo completo publicado em Inglês ou chinês; (4) a detecção da hipermetilação de sangue periférico; (5) O fornecimento de dados suficientes para 2 × construção 2table; e (6) a inclusão de um grupo controle composto por pacientes com doença benigna ou indivíduos saudáveis. Quando dois ou mais métodos foram utilizados num único estudo para detectar a metilação do mesmo gene-alvo, os dados do método com melhor índice de Youden foram incluídos na nossa análise. Os critérios de exclusão foram: (1) duplicar a publicação, (2) da amostra 30 pacientes, e (3) a falta de um valor de corte clara para metilação.

Os dados de extração

Dois revisores (RX H e XY Wang) dados relevantes extraídos de forma independente de cada artigo usando um formulário padronizado (Tabela S1). Os revisores não estavam cegos para a revista e os nomes dos autores, afiliações autor ou ano de publicação, como este procedimento foi mostrado para ser desnecessário [32]. Para resolver desacordo entre os revisores, outros autores avaliaram todos os itens discrepantes e a opinião da maioria foi utilizada para análise. Os dados a seguir foram extraídas: características descritivas da população estudada (idade, sexo, estágio clínico, eo tamanho da amostra), pormenores dos estudos (primeiro autor, ano de publicação, região geográfica, gene alvo e fonte de amostra), dados de 2 × construção 2 mesa (sensibilidade e especificidade), e método de análise de metilação.

Quality avaliação

Dois revisores (AG Xu e AH Gan) avaliaram a qualidade de cada estudo, utilizando de forma independente a qualidade de sete itens avaliação de estudos de acurácia diagnóstica (QUADAS) -2 ferramenta [33], que tem sido demonstrado ser eficiente para avaliação dos estudos de acurácia diagnóstica de qualidade. A qualidade de cada item foi caracterizado como baixo, alto, ou pouco claras.

A sensibilidade e especificidade analisa

Um modelo de meta-análise bivariada foi utilizada para resumir a sensibilidade, especificidade, probabilidade positiva e negativa as proporções, e as probabilidades de diagnóstico proporção de teste metilação biomarcador, e para gerar uma curva bivariável operador receptor resumo característica (SROC) [34-37]. O modelo bivariado é considerado um modelo estatístico bastante válida para as meta-análise de diagnóstico [38-41]. Porque erros aleatórios e heterogeneidade clínica ou metodológica podem afetar os resultados do estudo, a

I

2 e

H

2 testes foram utilizados para avaliar estudo heterogeneidade.

I

2 valores 50% foram considerados para indicar a existência de uma heterogeneidade significativa [42-44].

Meta-regressão e análises de subgrupos

análise de regressão Meta foi executado para determinar se valores de diagnóstico foram afetados significativamente pela heterogeneidade entre os estudos. Primeiro, a análise de regressão de fator único foi realizada com as seguintes variáveis: estágio CRC (I-II /III-IV), metilado

SEPT9

(sim /não), gene (s) alvo (single /múltipla) , o método de análise de metilação [PCR específicos de metilação (MSP) /PCR quantitativa (qPCR) /other], ano e região (China /outro). As variáveis ​​com coeficientes de regressão significativos (

P Art 0,05) foram consideradas explicativo. Posteriormente, foi desenvolvido um modelo de regressão multivariada e usou um algoritmo passo a passo para trás para identificar as variáveis ​​com os efeitos mais significativos. Características mostrando significância estatística (

P Art 0,05) foram retidas no modelo de regressão

análises de subgrupos foram planejadas

a priori

dependendo do seguinte:. Identificação de um altamente efeito significativo na análise de meta-regressão; número de genes alvo metilado examinados ( 3); gene alvo (single /múltipla); região (China /outro), e o método de análise de metilação (qPCR /MSP /outro).

O viés de publicação dos estudos selecionados foi avaliada com um gráfico de funil e teste de Deek, que tem sido recomendada para a detecção de viés de publicação de diagnóstico estudos de precisão de teste [45]. Para detectar os efeitos de limiar de corte, a relação entre sensibilidade e especificidade foi avaliada utilizando o coeficiente de correlação de Spearman. Subgrupo e análises de sensibilidade também foram realizados quando necessário para dissecar heterogeneidade observada. Todas as análises foram realizadas com o Stata SE12.0 (Stata Corporation, EUA) e Meta-DiSc1.4 [46] software.

Resultados

características

Amostra

A busca inicial devolvido um total de 981 artigos, dos quais 495 publicações duplicados foram removidas. Na próxima fase da avaliação, 208 dos 486 restantes artigos foram excluídos. A avaliação posterior levou à exclusão de 239 publicações adicionais. Depois de ler cuidadosamente os textos, meta-análise foi realizada sobre a amostra final de 39 estudos (Figura 1), que included3853 pacientes com CRC e 6431 controlos saudáveis. Os estudos que examinam adenoma avançado, o alvo ideal de triagem, foram excluídos da análise devido ao pequeno número de publicações identificadas e porque este tema se estende além do objetivo desta revisão sistemática.

A meta-análise relatórios de amostra compreendidos na precisão dos marcadores hipermetilação no sangue periférico, para a detecção de CRC (S1 Tabela). genes únicos e múltiplos foram alvo, e as amostras foram obtidas a partir de soro /plasma de pacientes com estágios I-IV CRC. Os métodos de análise de metilação utilizadas nos estudos analisados ​​incluem qPCR [14, 15, 19, 26, 30, 31, 47-60], MSP [9, 12, 17, 21, 24, 30, 31, 50-58, 61 -68] e outros [13-15, 17, 19, 21, 24, 26, 28, 29, 47, 59, 60, 64-71]. Os revisores registrados 198/273 (72,5%) “sim” respostas e 75 (27,5%) “não /pouco claras” respostas usando a ferramenta QUADAS-2 (S2 Mesa, S1 Fig). Os estudos foram realizados em quatro continentes: Europa (

n

= 12; 9 na Alemanha, 1 na Itália, 1 na Rússia, e 1 em França), Austrália (

n

= 2), Ásia (

n

= 22; 16 na China, 2 na Coreia do Sul, e 4 no Japão) e América do Norte (

n

= 5, todos nos EUA). Dos 16 estudos realizados na China, 6 eram publicações [21, 47, 53, 54, 57, 68] em língua chinesa.

estimativas de desempenho Resumo

As estimativas de sensibilidade e especificidade do pool estavam intervalo de 0,62 [95% de confiança (IC), 0,56-0,67;

I

2 = 94,5%,

H

2 = 18,0] e 0,91 (IC 95%, 0,89-0,93;

I

2 = 92,6%,

H

2 = 13,5), respectivamente (Fig 2). A área sob a curva foi de 0,87 (IC de 95%, 0,84-0,90). Reunidas e curvas SROC hierárquicos são mostrados na S2 Fig. Os efeitos do limiar de diagnóstico e viés de publicação não foram significativas (

t

= -0,96,

P

= 0,34 e

t

= -0,47,

P

= 0,68, respectivamente). Os resultados da análise dos dados obtidos a partir de todos os estudos analisados ​​são apresentados na Tabela 1 e S3 Fig.

Meta-regressão e análises de subgrupos

de fator único a análise de regressão mostrou que apenas o metilado

SEPT9

variável foi explicativo. regressão multivariada mostrou que esta variável teve diferença mais significativa. região geográfica e método de análise de metilação contribuiu significativamente para a heterogeneidade entre os estudos; estadiamento não afetou o desempenho agrupada (Tabela 2).

Os resultados de análises de subgrupo são fornecidos na Tabela 3. A sensibilidade foi significativamente maior no

SEPT9

subgrupo metilado do que no não -methylated

SEPT9

subgrupo, mas nem especificidade significativa demonstrada. Não foi observada diferença significativa entre outros subgrupos. O 2009 lista de verificação PRISMA é fornecido como arquivo S2.

Discussão

análise Promotor hipermetilação do DNA de sangue tem o potencial de servir como método de rastreamento não-invasivo para a identificação de biomarcadores específicos , permitindo a detecção precoce de CRC. Esta abordagem é uma promessa para maior precisão, segurança, acessibilidade e adesão do paciente [16, 72].

No entanto, a detecção de lesões em fase inicial e pré-cancerosas é dificultada pelo desempenho incerto do rastreio não-invasivo ensaios [72]. Nesta meta-análise, avaliamos o valor diagnóstico e clínica de hipermetilação DNA como um marcador sorológico para o diagnóstico da CRC. A sensibilidade combinada de testes de detecção de metilação aberrante no sangue foi significativamente menor do que a relatada por FIT (0,79; 95% CI, 0,69-0,86) [73] e teste de metilação do DNA de fezes (0,75-0,78; 95% CI, 0,69-0,82) [74, 75], mas a especificidade não diferiram significativamente (0,94, 95% CI 0,92-0,95 [73, 76] e 0.90-0.91,95% CI 0,86-0,96, respectivamente). Os valores de sensibilidade e especificidade para metilado

SEPT9 Comprar e vários subgrupos de genes alvo foram consistentes com aqueles para FIT e testes de metilação do DNA de fezes, com a vantagem de melhor aceitação e cumprimento de testes serológicos para fins de triagem CRC.

Foi observado um elevado grau de heterogeneidade entre os estudos para todos os testes de metilação do DNA de sangue utilizados na triagem CRC, devido principalmente para estudar método de análise de metilação região e. A falta de um efeito significativo do estádio CRC pode ser devido à falta de CRC de armazenamento temporário, na maioria dos estudos e /ou a inclusão de alguns doentes com estádios I-II de CRC. Mais pesquisas sobre CRC em estágio inicial é esperado no futuro.

Teoricamente, o uso de vários biomarcadores para o rastreio do cancro é mais preciso do que o uso de um único marcador. Embora os testes polygenetic mostrou maior sensibilidade nesta análise, nem sensibilidade nem especificidade diferiu significativamente entre os estudos de segmentação genes únicos e múltiplos. Estes resultados podem ser explicados pelo seguinte: (1) os mecanismos subjacentes metilação de CpG em CRC permanecem pouco claros; (2) não altamente preciso gene alvo metilado CRC-specific foi identificado devido à heterogeneidade de câncer de cólon; (3) diversos métodos de teste de metilação do gene pode produzir resultados diferentes; e (4) a amostra de estudos polygene foi muito menor do que a de estudos de um único gene, e a precisão do diagnóstico do primeiro não era superior à dos últimos.

De acordo com os resultados de avaliação da presente , alguns estudos de caso-controle independentes sugeriram que metilado

SEPT9

no plasma pode ser usado para identificar indivíduos com CRC com 0,52-0,72 sensibilidade e 0.90-0.95specificity [14, 16]. Em um recente estudo prospectivo de 7941 casos, Church et al. [71] obtidas estimativas de sensibilidade e especificidade de 0,48 (95% CI, 0,32-0,64) e 0,92 (IC 95%, 0,90-0,93), respectivamente, para metilado

SEPT9

. Na presente análise, metilado

SEPT9

detecção mostrou significativamente maior sensibilidade do que métodos que não utilizam este gene, mas não há vantagem em termos de especificidade. Metilado

SEPT9

tem sido mostrado para ser um bom marcador para o rastreio de CRC, mas o seu potencial não tem sido explorado plenamente, devido ao elevado grau de heterogeneidade, o que afecta a sua disponibilidade clínica.

Cada um dos DNAs técnica de análise de metilação tem vantagens e desvantagens inerentes, e os procedimentos variar substancialmente [77]. Esses fatores têm impedido a formulação de normas unificadas e fizeram estudos de validação cruzada problemático. Nenhuma técnica única ou abordagem é o ideal porque nenhum combina a precisão quantitativa, detecção sensível, elevado conteúdo informativo local ou global, a compatibilidade de origem de exemplo, e automação de processo. Assim, a selecção técnica afecta os resultados laboratoriais e pode levar a heterogeneidade. No presente estudo, o exame de constatações segundo o método de análise de metilação não levou a nenhuma redução significativa heterogeneidade e não insensibilidade diferença ou especificidade. Assim, a melhoria nas metodologias de detecção de metilação é necessária.

Epigenética resulta da interacção entre o material genético e factores ambientais. O nível de metilação do DNA

in vivo

é regulada pela genética, estilo de vida e fatores dietéticos [78, 79]. Na presente análise, a precisão dos estudos realizados na China e em outras regiões não diferiram, mas estudos realizados na China mostraram um alto grau de heterogeneidade. Esse resultado pode ser devido a fatores dietéticos (folato e ingestão de chá), e exposição ambiental estilo de vida (tabagismo e consumo de álcool),.

diagnóstico de precisão teste de meta-análises têm características diferentes e maior heterogeneidade de meta terapêutica /intervenção -analyses devido a uma variedade de razões [35, 80], incluindo a utilização de ensaios não randomizados, a variação natural na sensibilidade e especificidade através limiares de positividade (cut-offs), e as diferenças de concepção, realização, protocolos e padrões de referência . Avaliação do potencial para publicação e viés relacionado foi mais complicado do que para ser avaliado intervenção e investigação da influência de viés de publicação em termos de pequeno estudo de efeitos é um desafio. Os modelos bivariados e HSROC utilizados neste exame são atualmente os métodos estatisticamente mais rigorosos de precisão teste de diagnóstico meta-análise e são recomendados por organismos autorizadas como a Colaboração Cochrane ea AHRQ [34-37]. Além disso, usamos uma variedade de métodos estatísticos para encontrar e analisar possíveis fontes de heterogeneidade

A incapacidade de controlar as fontes de heterogeneidade efetivamente neste estudo pode ser devido a:. 1) a falta de clareza em relação à causal relação entre metilação e CRC; 2) grande heterogeneidade de marcadores de metilação correntes em tumores; 3) efeitos de muitos fatores não-tumorais relacionadas, tais como genovariation, envelhecimento, sexo, níveis hormonais, fatores de estilo de vida (tabagismo e consumo de álcool), raça, inflamação, dieta e fatores ambientais, por metilação [78, 79]; 4) a diversidade e limitações dos métodos de detecção de metilação existentes, o que dificulta a padronização dos procedimentos; 5) falta de conhecimento sobre os mecanismos subjacentes viés de publicação em estudos precisão do teste diagnóstico, resultando na possibilidade de fraco poder de métodos estatísticos para a detecção de viés de publicação seletiva [45], e 6) análise da maioria dos testes de diagnóstico no caso-controle estudos, enquanto potenciais estudos randomizados controlados são raros.

Esta meta-análise tem várias limitações. A maioria das publicações incluídas na análise relatado em estudos de caso-controle com amostras pequenas. Além disso, os efeitos do viés de seleção idioma e tipo de literatura não pode ser ignorado em qualquer meta-análise. Finalmente, os estudos incluídos não conta para os efeitos do envelhecimento, sexo, estilo de vida, dieta e metodologia em suas descobertas.

Em conclusão, o uso de marcadores sorológicos metilados deve ser a abordagem de escolha para triagem CRC devido à maior desempenho diagnóstico, conveniência e conformidade em comparação com os métodos não-sorológicos. Metilado

SEPT9

mostrou relativamente alta sensibilidade combinada, que foi afetado por muitos fatores, mas não por CRC teste. ainda muito trabalho para reduzir o elevado nível de heterogeneidade é necessária antes de marcadores sorológicos metiladas são amplamente aplicada para o rastreio CRC na prática clínica. estudos de diagnóstico clínicos futuros de metilação no sangue devem considerar os impactos de otimização marcador e fatores não-neoplásicas (por exemplo, envelhecimento, sexo, estilo de vida, dieta, metodologia) sobre a precisão do diagnóstico. Além disso, espera-se que mais estudos de rastreio precoce CRC. Como a detecção de metilação sorológico é um método relativamente novo rastreio CRC, as melhorias na precisão pode ser esperado como a tecnologia de diagnóstico evolui.

Informações de Apoio

S1 Fig. visualização gráfica dos resultados da avaliação de qualidade

doi:. 10.1371 /journal.pone.0155095.s001

(TIF)

S2 Fig. Reunidas e receptor resumo hierárquico operacional curvas características

doi:. 10.1371 /journal.pone.0155095.s002

(TIF)

S3 Fig. teste de assimetria gráfico de funil de Deek

doi:. 10.1371 /journal.pone.0155095.s003

(TIF)

S1 Arquivo. Meta-analysis-on-genetic-association-studies-form.

doi:10.1371/journal.pone.0155095.s004

(DOC)

S2 Arquivo. . PRISMA 2009 lista de verificação

doi: 10.1371 /journal.pone.0155095.s005

(DOC)

S3 Arquivo. . PRISMA 2009 diagrama de fluxo

doi: 10.1371 /journal.pone.0155095.s006

(DOC)

Tabela S1. Características dos 39 estudos incluídos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0155095.s007

(DOCX)

S2 Table. . Qualidade dos estudos incluídos

doi: 10.1371 /journal.pone.0155095.s008

(DOC)