Abstract
Nós fornecemos novos dados funcionais que silenciamento pós-transcricional do gene
RPL19
usando RNAi não só anula o fenótipo maligno de células de cancro da próstata PC-3M, mas é selectivo em relação à transcrição e tradução de outros genes. Reduzindo
RPL19
modula a transcrição de um subconjunto de genes, evidenciado por análise de matriz de expressão do gene e Western blotting, mas não compromete a proliferação celular ou apoptose
In-vitro
. No entanto, o crescimento dos tumores xenoenxertados contendo o knocked-down
RPL19 in vivo
é significativamente reduzida. Análise dos genes modulados revela a indução do fenótipo não-maligno, principalmente, para envolver a perturbação de redes de factores de transcrição e os genes de adesão celular. Os dados fornecem evidências de que as funções de regulação extra-ribossomais de
RPL19
, além da síntese de proteínas, são reguladores críticos do fenótipo celular. Segmentação membros-chave das redes afectado identificado por análise da expressão de genes levanta a possibilidade de estabilizar um fenótipo terapeuticamente benigna gerado através da modulação da expressão de um gene individual e, posteriormente, restringindo um fenótipo maligno, deixando os tecidos não malignos afectada.
Citation : Bee A, Brewer D, Beesley C, Dodson A, Forootan S, Dickinson T, et al. (2011) siRNA Knockdown de Ribossômico proteína do gene
RPL19
revoga o Fenótipo agressiva de câncer de próstata humana. PLoS ONE 6 (7): e22672. doi: 10.1371 /journal.pone.0022672
editor: Steven R. Ellis, da Universidade de Louisville, Estados Unidos da América
Recebido: 18 Janeiro, 2011; Aceito: 04 de julho de 2011; Publicação: 22 de julho de 2011
Direitos de autor: © 2011 Bee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Fundo de North West Cancer Research (UK), Cancer Research do Reino Unido, o Instituto de Pesquisa Nacional do Câncer (MRC-UK), um programa especializado de Investigação Excellence (SPORE) subvenção do Instituto Nacional do Câncer (EUA), o Grand caridade de maçons, Roseiras Trust, The Bob Champion Cancer Trust, The Orchid Recurso e David Koch Foundation. organismos de financiamento não teve envolvimento na concepção e realização do estudo, na gestão de recolha, análise e interpretação dos dados, ou em preparação, revisão e aprovação do papel
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
proteínas ribossomais (RPS) compreendem um super-família complexo de proteínas [1] altamente conservadas ao longo da evolução, indicando a sua importância funcional para os organismos vivos [2]. Esta afirmação é corroborada pelo número de pseudogenes Rp e duplicações de genes em conjunto com regiões partilhadas de identidade entre proteínas homólogas em procariotas e eucariotas [3]. ribossomas eucarióticos contêm aproximadamente 80 RPs juntamente com quatro RNAs ribossomais (rRNA) e exigem cerca de 150 fatores não-ribossomais tornar-se organizado em seus constituintes pequenas (40S) e grandes (60s) subunidades [4]. Inicialmente, considera-se que intervêm apenas na síntese da proteína, certas RPS são reconhecidos como pleiotrópico e para mediar uma variedade de funções de regulação extra-ribossomal [5], [6]. Tais RPS, incluem L5 [7], L11 [8], L13 [9] e S7 [10]. Em peixes-zebra (
Danio rerio
) um poderoso papel para RPS como supressores de tumores tem sido demonstrada por meio de que a mutação ou supressão, de qualquer dos vários genes RP prejudica o controlo de p53, promovendo assim a malignidade [11], [12]. Recentemente, o conceito de “ribosomopathy” tornou-se estabelecida por meio de que a mutação de um RP particular é patogénica para uma doença específica [13]. Aproximadamente 25% dos casos de Diamond Blackfan-anemia são causados pela mutação do gene da proteína ribossomal
RPS19
enquanto em outros 20%, mutações ocorrem em outros genes de proteínas ribossomais [14]. Atualmente, cerca de 77 individuais
RPS19
mutações foram descritos [15]. Além disso, para haploinsu- proteínas ribossomais foi mostrado, em alguns casos, ser uma causa subjacente para Diamond Blackfan anemia [16].
Presentemente, os mecanismos de mutações em genes relacionados RP para o cancro permanece desconhecido [17]. Para a região do braço longo proximal do cromossomo 17 onde o
gene RPL19
está localizado (17q), grandes mudanças específicas do câncer têm sido descritas. Estes incluem amplificações e copiar mudanças de números, em particular os da região, que incluem oncogene
ERBB2
, formação de isocromossomo 17q, duplicações, deleções, mutações e outros rearranjos genômicos. Anteriormente [18], identificamos uma maior expressão da
RPL19
mRNA em linhagens de células da próstata e tecidos para correlacionar com um fenótipo maligno agressivo. Como elevados
RPL19
ARNm ocorrido como um de um número relativamente pequeno de sequências de sobre-expresso no cancro da próstata, a hipótese de que o seu efeito era susceptível de ser selectiva, em vez de parte de uma elevação não-específico global da expressão do gene . proteína ribossomal L19E (RPL19) pertence à L19E super-família de proteínas e, em eucariotas, é um componente da subunidade ribossomal 60S grandes. O gene é expresso durante a maior parte da evolução, particularmente nos eucariotas e arqueobactérias, mas está ausente a partir de bactérias [19] [20], apesar de haver uma homologia entre as sequências de rato e em L19
proteínas ribossomais L18, L30 e S2 [21] Surpreendentemente, para um gene aparentemente tão importante,
RPL19
tem, até agora recebido pouca atenção. Nos seres humanos,
RPL19
mapas no cromossomo 17 em 17q11.2-q12, onde ele codifica 9 potenciais variantes de processamento. Em uma série de biópsias de câncer de mama humano,
RPL19
foi reportado como sendo expresso e co-amplificado, juntamente com
ERBB2 Comprar e genes
PNMT
,
PSMB3
e
NR1D1
[22]. Esta região complexa que contém vários genes tem sido sugerida como uma possível amplicon [23], [24] que se estende por alguns ~547 kb de
RPL19
através de
STRAD3
e
ERBB2
GRB7
na região 17q11.2-q12. Presentemente, não existem dados têm comprovado esta especulação. No cancro da próstata, a amplificação de erbB2 é pouco frequente, sendo relatada em apenas 0,04% [25] para 2% [26] dos casos, e, portanto, não é um mecanismo comum da sobre-expressão RPL19. Desde a nossa identificação inicial de RPL19 no câncer de próstata [18], a sua expressão tem sido mostrado para definir câncer colorretal pobre-prognóstico [27] e como um antígeno tumoral romance em adenocarcinoma pulmonar [28].
As mudanças globais em genes modulados no cancro da próstata humana foram previamente perfilado usando análise de matriz de expressão de ADN [29], que detectaram alterações na expressão dos genes seguintes sobre-regulação selectiva de genes alvo individual [30], [31] ou na sequência anti-sentido knockdown do gene utilizando [32 ] ou ARNi [33] com tecnologia subsequente transformação do fenótipo maligno. Os genes diferencialmente expressos e suas redes associadas foram avaliados como biomarcadores para segregar diferentes fenótipos de câncer de próstata de acordo com o comportamento e resposta à terapia [34]. No entanto, uma alteração do nível de expressão do gene não faz,
ipso facto
, confirmam um papel primordial no processo maligno. instabilidade genómica é a marca da transformação maligna [35] e os efeitos do ganho ou perda de um único gene são susceptíveis de ser transmitida ao longo do genoma, com a consequência de que a expressão de outros genes torna-se secundariamente modulado [36]. Tais mudanças tanto podem ter relevância imediata e ativo para o fenótipo celular resultante ou a sua expressão alterada é passiva e inconsequente. Para avaliar a relevância funcional de um gene particular, a supressão da sua transcrição permite a análise de seus efeitos imediatos sobre a expressão do genoma. Anteriormente, nós transfectadas células epiteliais prostáticas malignas PC-3M com 436 bp de comprimento oligonucleotídeo antisense para knock-down expressão de
FABP5
que melhorou o fenótipo tumor maligno ambos
in-vitro Comprar e
in-vivo
[37]. aqui, que utilizámos a técnica cirúrgica mais de interferência de RNA (RNAi) com potencialmente maior especificidade e eficácia, dependendo do gene particular a ser alvejado [38].
Os nossos dados anteriores [18] indicaram que a expressão de
RPL19
pode ser funcionalmente importante na promoção da malignidade prostática. Temos agora testado esta hipótese, reduzindo seletivamente
RPL19
expressão usando RNAi. As células PC-3M resultantes exibem um fenótipo maligno revogada ambos
in-vitro
e
in-vivo
quando submetidos a avaliação fenotípica e análise de expressão gênica. Os dados suportam a possibilidade de um papel funcional para
RPL19
, na qualidade dentro de um espectro de expressão genética alterada, na manutenção do fenótipo maligno de células de cancro da próstata humanos. Confirmação de tal cenário seria permitir direccionamento terapêutico selectiva de RPL19, seja imunologicamente [28] ou por meio de moléculas pequenas, para modular subconjuntos distintos de proteínas celulares que são promotores importantes do fenótipo maligno.
Resultados
siRNA knockdown de RPL19 em células parentais PC-3M
transfecção transiente.
análise qPCR das células PC-3M parentais utilizando os primers definidos na Tabela 1 revelou um forte
RPL19
expressão de mRNA, confirmada por sequenciação de nucleótidos.
Depois disso, transfecção transiente das sequências de siRNA para
RPL19
exão 1 (Tabela 2) revelou alvo # 1 para ser a sequência mais eficaz para silenciamento de RNA, reduzindo a expressão de apenas 7% do seu valor inicial (Figura 1A). Enquanto as outras sequências foram eficazes, somente a combinação de todos os três ao mesmo tempo era melhor do que o alvo # 1, sozinhos. Depois disso, alvo # 1 foi utilizada para todas as experiências subsequentes.
. análise qPCR de
RPL19
níveis de expressão seguinte silenciamento transitória de diferentes alvos no PC-3M
células parentais. Alvo # 1 (T1) foi o mais eficiente, com nível residual detectado apenas 7%. Esta redução só foi ultrapassado pela combinação simultânea de T1 + T2 + T3. análise B. qPCR de
RPL19
níveis de expressão seguinte silenciamento estável de 1 Alvo #. Estes dados são compilados a partir de experimentos realizados em triplicado. As medições são em relação à expressão de RPL19 em Si-PC-3M
células de encriptação. Comparativos níveis em células PNT2 benignos também são mostrados. C. morfológica aparições de (i) PC-3M
células parentais e vários tipos de colônias (II-IV) seguintes knockdown estável de
RPL19
. Algumas colónias (II) eram fracamente aderente com a maioria das células que crescem em suspensão. Outros (iii) continha formas predominantemente multinucleadas. A maioria (iv) células compostas que foram menores do que a dos pais. Clone ST-3 células utilizadas em todas as experiências subsequentes são mostrados neste painel. (Ampliação × 200)
transfecção estável.
Os níveis de
RPL19
mRNA foram medidos em PNT2, PC-3M
parental, PC -3m
corrida e si-
RPL19-
PC-3M
alvo # 1 células transfectantes transitórios (Figura 1B). De acordo com o estudo anterior [33], expressão em PC-3M
células Scramble foi fixado em unidade e expressões relativas nas outras linhas celulares foram comparados como vezes de diferenças.
expressão RPL19
no PC-3M foi 4,9 vezes maior do que a das células PNT2 e consistente com os nossos estudos anteriores confirmados por análise de transferência de Northern [18]. No si-
RPL19-
PC-3M
clone ST-3 células transfectantes, expressão de
RPL19
foi reduzido para apenas 1,3 vezes maiores do que as células PNT2. PC-3M
células mexidos revelou uma redução de 2,3 vezes em
RPL19
quando comparado com PC-3M
parental, embora este valor não foi estatisticamente significativa. clonagem de células individuais [33] seguido por qPCR e Western blot confirmou si-
RPL19-
PC-3M
clone ST-3 expressa os níveis mais baixos de
RPL19
mRNA e proteína. Este clone de células foi depois utilizado para análise fenotípica detalhado.
características de crescimento de Si-RPL19cells
in-vitro
Clones de transf si-
RPL19
células -PC-3M cultivadas sob condições padrão exibiu diferenças em morfologia (Figura 1C). Em comparação com PC-3M
células parentais, si-
RPL19
células -PC-3M eram geralmente menos aderentes ao substrato. No entanto, estas células mantiveram a capacidade de proliferar e podem ser subcultivadas com sucesso, embora uma grande proporção das células permaneceram em suspensão. Outros si-
RPL19
células -PC-3M mostrou um aumento nas formas multinucleadas, sugerindo conclusão prejudicada da mitose. Os ensaios de proliferação (Figura 2A), revelou que, durante a fase logarítmica de crescimento, a taxa de divisão celular por o Si-
RPL19-
PC-3M
clone ST-3 células transfectantes não foi significativamente afectada (
p
≥0.05) quando comparado com PC-3M
parental e si-PC-3M
corrida. A capacidade de Si-
RPL19-
PC-3M
clone células ST-3 para invadir uma matriz de colagénio extracelular (ECM) foi comparada com a do PNT2, PC-3M
parental e PC -3m
corrida linhagens de células (Figura 2B). O número de células que invadiram através da MEC foram: (PNT2) 0,6 ± 0,6, (PC-3M
parental) 279 ± 33.7 e (PC-3M
precipitação) 317 ± 28,3 (
p
0,001). O si-
RPL19
células -PC-3M exibiu um potencial invasivo comparativamente pobres e a apenas 60 ± 10,7 células transmigrando (
p Art 0,001). Assim, silenciando
RPL19
reduziu o potencial invasivo de células PC-3M aproximadamente 5 vezes. Endógenos (basal) níveis de apoptose dentro do PC-3M
parental e PC-3M
células Scramble (Tabela 3 e Figura 2C) foram semelhantes aos obtidos durante os estudos comparáveis do
PRKCZ
gene [33]. níveis basais de apoptose nas quatro linhas celulares não foram estatisticamente diferentes (
p Art 0,05). Embora sensibilidades do PC-3M
parental e si-
RPL19-
PC-3M
clone ST-3 células para camptotecina não foram alteradas, este agente aumento da apoptose em PNT2 e PC-3M
células Scramble (
p Art 0,0001)
A.. crescimento relativo de linhas celulares em cultura em monocamada revelando nenhuma diferença estatística na taxa de proliferação entre as células knockdown (si-
RPL19
-PC-3M
clone ST-3) e o de PC-3M
sub células parentais. B. ensaio de invasão
in-vitro
comparando as mesmas populações de células como as mostradas em (A) e revelando uma queda de 83% na capacidade invasiva de células do
RPL19
knockdown em relação ao PC -3m
células mexidos. níveis C. repouso de índices apoptóticos não foram significativamente diferentes na benigna (PNT2), parental (PC-3M) ou células knockdown. Após o desafio de camptotecina, nenhuma mudança foi identificado no PC-3M
RPL19
-PC-3M
clone células parentais ou si- ST-3. Embora um aumento da apoptose foi encontrado nas células benignas e em células transfectadas-precipitação, estes não foram significativos. D. crescimento de células tumorais in
in vivo
por volume estimado revelou uma correlação altamente significativa (
P
0,005) supressão do crescimento por dois dos clones transfectantes estáveis, quando comparados com o PC -3m
parental e PC-3M
células mexidos. Crescimento de células PNT2 não está incluída uma vez que já foi demonstrado [33] o crescimento de tumores para ser pouco frequentes, particularmente ao longo do período de tempo destes experimentos. E. Análise de pesos tumorais
in-vivo
confirmou clones ST-1 e ST-3 para gerar significativamente tumores (
p Art 0,005) menor do que o PC-3M
parental ou o si-PC-3M
células mexidos. análise F. imuno-histoquímica de tumores em crescimento como xenoenxertos
in-vivo
apoiou os níveis de mRNA de dados (Figura 1B) que, enquanto o original PC-3M
parental (i) e si-PC-3M
corrida (ii) células expressaram proteína RPL19 em alto nível. O si-
RPL19
-PC-3M
clone ST-3 células (iii) expressou RPL19 heterogênea e em apenas níveis muito baixos. (Ampliação × 350)
tumorigenicidade e RPL19 expressão da proteína
in-vivo
Em todos os grupos de animais, os tumores se tornou aparente no dia 2 seguinte inoculação (Tabela 4). No entanto, mais apareceu mais cedo no PC-3M
parental (3/8) e PC-3M
corrida (4/8) grupos. Nos dois grupos de clones transfectantes, tumores levou mais tempo para aparecer (2/8 tumores em animais portadores do si-
RPL19-
PC-3M
clone ST-3 células e 1/8 tumores em animais transportando a si-
RPL19-
PC-3M
clone # 2 células). Inicialmente, todos os tumores foram semelhantes no tamanho. Após 7 dias, o PC-3M
parental e PC-3M
grupos mexidos desenvolveram tumores maiores do que dois grupos transfectantes (Figura 2D). Na autópsia, 15 dias após a inoculação, uma diferença significativa (
p Art 0,001) era aparente nos pesos médios do controle e
RPL19-
tumores knockdown (Figura 2E). PC-3M
parental exibiu uma ampla gama de peso de tumor, um animal produzindo um tumor de 810 mg em 15 dias, o máximo permitido pela licença de projeto. Por outro lado, um outro animal desenvolveu um tumor de apenas 10 mg. Um fenômeno semelhante ocorreu dentro do PC-3M grupo
corrida com tumores que variam de 10-140 mg. Os pesos finais dos
tumores parentais PC-3M não foram significativamente diferentes das do PC-3M
grupo corrida (Mann-Whitney U,
p Art 0,05). Assim, a supressão SI-ARN de
RPL19
afectou o tamanho dos tumores gerados
in vivo
(
P
0,05), mas não na sua latência. Não há micrometástases foram identificados na autópsia ou por exame histopatológico subsequente dos tecidos excisadas.
A imuno-histoquímica de xenoenxertos de tumor detectado forte expressão da proteína RPL19 tanto no PC-3M
parental e si-PC-
células mexidos 3M (Figura 2F). linhas de células knockdown si-
RPL19-
PC-3M
clone ST-3 e si-
RPL19-
PC-3M
clone ST-1 exibiram relativamente pouco coloração, indicando continuou supressão da
RPL19
gene na maioria das células tumorais. A detecção de pequenas quantidades de proteína RPL19 em algumas células tumorais é considerado para representar a variação clonal resultante continuou a expressão de baixo nível do gene, em vez da sua inibição total, conforme identificado por qPCR das células
in vitro
e os resultados dos estudos de Western blotting. Enquanto expressão de mRNA e correspondentes proteína no epitélio da próstata nem sempre estão de acordo [39], aparentes discrepâncias entre
in-vitro
e
in-vivo
estudos pode ser devido ao
em -vivo
efeito de uma matriz do estroma circundante que afetam a adesão de células de tumor ou a outras influências, incluindo fatores de crescimento que modulam a expressão do gene de baixo nível individual [40] – [42].
gene comparativo perfil de expressão si- RPL19-PC-3M
clone células ST-3
perfis de expressão do genoma-largas obtidas de microarrays de oligonucleotídeos de ADN (não modificada Agilent Human Genome 44K) foram utilizados para identificar genes modulados seguintes
RPL19
derrubar. Comparação de genes expressos pelo PC-3M
parental e PC-3M
linhas celulares mexidos não revelou diferenças estatisticamente significativas (
p
≥0.05), indicando que a técnica de transfecção não era responsável pela apreciável efeitos fora do alvo que aquele viés poder os dados experimentais. Um total de 916 sequências de DNA, o que representa 768 genes foram identificados como diferencialmente expressos (
p
≤0.05, Benjamini e Hochberg correção de testes múltiplos aplicada). Destes, 404 foram reforçadas e 364 sub-regulada. Dentro desse conjunto de dados, 184 genes diferentes foram modulados pelo menos quatro vezes, 62 sendo regulado para cima e 122 sub-regulada. Os primeiros 50 genes diferencialmente expressos nestas duas categorias estão resumidas na Apoiando tabelas de informações S1 e S2 e graficamente (Figura 3). dados de expressão derivadas das matrizes foram validados por qPCR fornecendo evidências quantificáveis independente da magnitude e direção da mudança de genes individuais. A observação de que apenas 768 genes foram modulados seguinte
RPL19
knockdown, com os níveis de ARNm para uma ampla gama de proteínas mantida ou elevada, sugere que a proteína ribossómica RPL19 é diferencialmente envolvidos na síntese de proteínas, em vez de afectar todos celular síntese de proteínas de uma forma não específica.
mapa de calor dos 50 principais genes up-regulamentados e genes TOP50 regulada seguinte expressão-profiling de mRNA expresso por si-
RPL19
-PC- 3M
clone células ST-3 quando comparado ao PC-3M
células parentais utilizando o PC-3M
células mexidos como o denominador comum. agrupamento hierárquico é mostrado. O verde indica genes sobre-expressos em células numa amostra em comparação para embaralhar-transfectadas. O vermelho indica genes regulados negativamente na amostra quando comparado células para embaralhar-transfectadas. Correspondente dados numéricos são apresentados em tabelas de informações Apoio S1 S2
análise de enriquecimento funcional identificação de alguns ontologia 20 Gene (GO) termos de processos biológicos e três termos de função molecular (Informações de Apoio Tabela S3) a ser significativamente associados (
p 0,001) com o knockdown (
p Art 0,001). Além disso 13 vias KEGG teve uma representação excessiva significativamente de genes diferencialmente expressos entre
RPL19-
PC-3M
clone ST-3 e PC-3M
corrida (Informações de Apoio Tabela S4). análise de caminho Ingenuity foi usado para identificar redes biológicas significativas e caminhos em que os genes diferencialmente expressos como consequência da
PRKC-ζ
knockdown estavam envolvidos. Os cinco principais vias classificou interligados (Informações de Apoio Tabela S5) e a ontologia de três Gene (GO) termos de função molecular (Informações de Apoio Tabela S6) são altamente significativos (
p
≤10
-27) no que diz respeito de genes diferencialmente expressos depois
RPL19
knockdown.
genes de proteínas ribossomais.
a hipótese de que siRNA induzida por infra-regulação da
RPL19
pode ser compensado por modulação de outras proteínas ribossomais foi abordado através da avaliação da expressão relativa das sequências de grande gene da proteína ribossomal mitocondriais (n = 71) e as sequências de grande gene da proteína ribossomal citoplasmáticos (n = 136) para detectar se a regulação positiva de um gene já expressa ou neoexpression de um gene da proteína ribossomal anteriormente silenciosos tinha ocorrido. Deste último grupo, 44 genes codificados RPs conhecidas, 7 foram RP-like e 5 foram pseudogenes RP. O número de sequências que representam cada gene variou de um (19 genes) a 14 (
RPL21
). RPL19 foi identificada por uma única sequência. De acordo com SCOP (Classificação estrutural de proteínas, mais recente lançamento 9
th novembro de 2010, https://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop) RPL19 é um membro da superfamília de proteínas de proteínas de tradução contendo o SH3-like domínio estrutural barril dentro da classe que compreende todas as proteínas beta. A família também contém proteínas ribossomais RPL14e, RPL21e e RPL24p eo domínio C-terminal de RPL2 (https://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi?sunid=50104). Alternativamente, a proteína RPL19 poderia ser substituída por RPL29 ou RPL39e, sendo os membros estruturalmente semelhantes de o grupo α-helicoidal de RPS globulares com caudas estendidos capazes de se ligarem ARNm [43]. Embora as flutuações ocorreram nos níveis de expressão de sequências de genes RPL indivíduo seguinte
RPL19
knockdown, estes não foram significativos, incluindo a do gene da proteína ribossômica
RPL23A
também localizado no cromossomo 17q11.2. Apenas expressão de mitocondrial
MRPL42
foi significativamente regulada para baixo (
p Art 0,05). Não foi detectada a maior expressão de qualquer gene RP. Assim, a inibição da
RPL19
com a perda de proteína RPL19 não foi compensado por um gene RP diferente. Por outro lado, os efeitos de uma redução
RPL19
poderia ser mediado pela função independente de codificação do gene ou dos seus mRNAs pseudogene [44].
genes de glicosiltransferase.
Transformação de as células epiteliais de um tumor benigno para um fenótipo maligno é frequentemente acompanhada por alterações estruturais nos domínios de oligossacáridos das glicoproteínas e glicolípidos celulares [45]. Particularmente, a expressão de sialilada e
β-1,6
ramificada oligossacáridos ligados a N são necessários para a invasão de células de cancro e metástase [46]. A enzima chave neste processo é manosil (
α-1,6
-) – glicoproteína
β-1,6
N-acetil-glucosaminyltransferase codificada pelo gene
MGAT5
e regulada por sinalização RAS-RAF-MAPK da via. Juntamente com
PTEN
,
MGAT5
regula a dinâmica da membrana de PI3K /Akt sinalização para promover o fenótipo maligno invasivo [47]. No caso em que a malignidade é reduzida após a manipulação de fenótipo celular, alterações nas estruturas de oligossacáridos de superfície celular são postulados para ocorrer. Tais alterações, mediadas por glicosiltransferases pode ser evidenciado por alterações na expressão dos genes correspondentes. Dos 768 genes diferencialmente expressos, apenas dois genes de glicosiltransferase foram significativamente afetadas seguinte
RPL19
knockdown (Informações de Apoio Tabela S7). Ao contrário do espectro de glicosiltransferases modulados seguinte knockdown si-RNA de
PRKC-Ç células
em PC-3M [33], nenhuma mudança foi evidente em genes silayl- ou fucosil-transferase. No entanto, uma redução de 4 vezes foi identificado no nível de
MGAT4A
(
P
0,05) que codifica a enzima manosil (
α-1,3 -) –
glicoproteína
β-1,4-
N-acetilglucosaminiltransferase e está envolvido na mediação da glicosilação das proteínas codificadas por
SLC43A3
(proteoglicano 2), SLC14A1 (transportador de ureia) e
SLC8A1
(sódio /trocador de cálcio), controlando assim a sua expressão na superfície celular. Na verdade, todos os três últimos genes foram modulados seguinte
RPL19
knockdown. Por outro lado, um aumento 2~3 vezes foi identificado no nível de
GALNACT-2
(
P
0,05) que codifica a enzima de sulfato de condroitina N-acetilgalactosaminiltransferase 2 e N- transferências acetilgalactosamina (GalNAc-) a partir de UDP-GalNAc [48] para condroitina, sulfato de condroitina, preferencialmente para oligosacfocharides complexos contendo
β1 → 4
ligações [49], tais como os gerados por
MGAT4A
.
Ion canais e genes associados
O fenótipo maligno de células epiteliais da próstata pode ser modulada pela expressão diferencial dos canais de iões [50] -. [52]. Estudos deste laboratório [52] e em outros lugares [53] estabeleceram uma relação funcional entre canais iônicos sensíveis à voltagem e o fenótipo invasivo de células de câncer de próstata [50]. Interrogatório das matrizes de expressão revelou vários canais iônicos e alguns genes associados para ser modulada seguinte
RPL19
knockdown (Informações de Apoio Tabela S3). Os canais de potássio mostrou uma resposta mista. O K voltagem-
+ alfa canal e beta subunidades (
KCNQ2
e
KCNAB2
) foram regulados negativamente de 3,5 e 2,25 vezes, respectivamente (
p
0,05 para ambos). O interior-retificador K
+ canais (
KCNJ6
e
KCNJ12
) mostrou uma resposta mista, sendo regulado para cima 5,5 vezes e sub-regulada 2,5 vezes, respectivamente (
P
0,01 para ambos). Dois tensão fechado Na
+ genes canal (
SCN3A
e
SCN9A
) foram regulados positivamente, 9 vezes (
p Art 0,005) e 2,3 vezes (
P
0,05), respectivamente. Finalmente, dois tensão fechado Cl
– canais /Cl
– H
+ antiport transportadores (
CLCN4
e
CLCN5
) foram regulados positivamente, 2,1 e 1,8 vezes, respectivamente, (
P
0,05 para ambos).
Outros genes e redes associadas
Nenhum dos genes de controlo do ciclo celular, incluindo a. 31 que anteriormente mostrou-se associada com uma alta probabilidade de progressão do câncer de próstata [54] foram modulados na sua expressão a seguir knockdown ou
RPL19
. Da mesma forma, nenhum dos genes reconhecidos para mediar a apoptose foram modulados nos transfectantes. Das 19 sequências que abrangem a família caspase de genes de apoptose,
CASP1
foi regulada para baixo ~ 7 vezes (
p Art 0,005) seguinte
RPL19
knockdown. A expressão de outros membros da família não foi alterada. Em apoio dos dados de matriz, Western blot confirmou que caspases clivados -3 e -9 não foram expressos quer no PC-3M
parental ou na si-
RPL19-
PC-3M
clonar ST-3 células transfectantes. Estes resultados suportam a proposição de que a alteração da expressão de
RPL19
não afeta o ciclo celular ou as vias apoptóticas. Por outro lado, as principais vias afetadas seguinte
RPL19
knockdown associar as redes de genes que regulam a homeostase e da interação entre as células malignas e seu ambiente (Figura 4). Como um exemplo, a expressão do gene regulador de
AGR2
foram identificados como sendo elevados em cancros da próstata de fenótipo agressivo [55] foi regulada para baixo -11 vezes (
P
0,02) seguinte
RPL19
knockdown. O produto deste gene se liga ao receptor ErbB3 e é regulado pelos reguladores de transcrição de ligação a DNA e forkhead Foxa1 Foxa2. Western blot confirmou abolição desta proteína nas células de knockdown (Figura 5), suportando os dados de matriz (Apoiando tabelas de informação S1 S2). Em contraste, HOXB13 que codifica um factor de transcrição que pertence à família do gene homeobox que se mostrou ser um biomarcador específico do tecido do epitélio da próstata benigna e maligna [56] foi elevada ~ 3 vezes (
P
0,001 ) seguinte
RPL19
knockdown.
Análise de genes modulados seguinte
RPL19
knockdown identificou cinco vias interligadas principalmente afetadas (Informações de Apoio Tabela S5). Quatro destes incluem genes que codificam enzimas MMP (A); o complexo ICAM1-integrina (B); o NFkB complexo (C) e regulação PI3K (D). Esta análise confirmou vários genes modulados pela expressão regulada por baixo de
RPL19
a ser interligados, destacando os numerosos caminhos para o cross-talk entre os processos biológicos aparentemente distintas.
Nestes estudos, comparação foi feita com si-
PRKC-ζ
-PC-3M
T1-6 [33] e si-
FABP5
-PC-3M
clone 3 [62] células knockdown-RNAi para confirmar que as mudanças nos níveis de proteína eram específicos para
RPL19
knockdown e não parte de uma resposta geral à inibição de genes utilizando si-RNA. Após a coloração com anticorpos primários, as membranas foram re-corados para a beta-actina. A intensidade desta banda foi utilizado para normalizar os níveis de proteínas individuais. A. RPL19: Seguindo
RPL19
knockdown, níveis reduzidos a ~ 5% dos que estão no PC-3M
células parentais, enquanto que os níveis foram mantidos em si-
PC PRKC-ζ- -3m
T1-6 e si-
FABP5
-PC-3M
clone 3 células. B. S11A4: Níveis foram mantidas em todas as linhas de células, sendo afetada pela
RPL19
knockdown.