Abstract

O extrato de gengibre (

Zingiber officinale Roscoe

) e seu principal componentes pungente, [6] -shogaol e [6] -gingerol, têm mostrado ter um efeito anti-proliferativo em várias linhas celulares de tumor. No entanto, a atividade anticâncer do extrato de gengibre em câncer pancreático é mal compreendida. Aqui, demonstramos que os materiais extraída com etanol de gengibre suprimida progressão do ciclo celular e consequentemente induziu a morte de linhas celulares de cancro pancreático humano, incluindo células Panc-1. O mecanismo subjacente implicou autosis, uma forma recentemente caracterizada de morte celular, mas não apoptose ou necroptosis. O extracto marcadamente aumentou a razão LC3-II /LC3-I, diminuição da proteína /SQSTM1 p62, e melhorada a vacuolização das células no citoplasma Panc-1. Ele ativou a AMPK, um regulador positivo da autofagia, e mTOR inibido, um regulador autofágica negativo. Os inibidores autophagy 3-metiladenina e cloroquina preveniu parcialmente a morte celular. Morfologicamente, no entanto, ruptura de membranas focal, retração nuclear, inchaço focal do espaço perinuclear e mitocôndrias densas de elétrons, que são características morfológicas únicas do autosis, foram observados. O espécies reativas de oxigênio aprimorados (ROS) geração de extrato, e do antioxidante N-acetilcisteína morte celular atenuada. O nosso estudo revelou que a administração intraperitoneal diária do extracto de sobrevivência significativamente prolongada (P = 0,0069) em um modelo de difusão peritoneal e suprimiu o crescimento tumoral num modelo ortotópico de cancro do pâncreas (P 0,01), sem efeitos adversos graves. Embora [6] -shogaol mas não [6] -gingerol mostrou efeitos semelhantes, análises cromatográficas sugeriu a presença de outro componente (s) como substâncias activas. Juntos, estes resultados mostram que o extrato de gengibre tem potente atividade antitumoral contra células de câncer pancreático, induzindo autosis e garante ROS mediada por uma investigação mais aprofundada, a fim de desenvolver uma droga candidata eficaz

Citation:. Akimoto M, Iizuka M, Kanematsu R, Yoshida M, Takenaga K (2015) Anticancer efeito do extrato de gengibre contra células do cancro do pâncreas Principalmente através Espécies mediada reativas de oxigênio Autotic Cell Death. PLoS ONE 10 (5): e0126605. doi: 10.1371 /journal.pone.0126605

Editor do Academic: Guillermo Velasco, da Universidade Complutense, ESPANHA

Recebido: 06 de janeiro de 2015; Aceito: 05 de abril de 2015; Publicado em: 11 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Akimoto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas-in-Aid de: Shimane Universidade Projeto “SUIGANN” (https://www.shimane-u.ac .jp) (KT); Investigação Científica do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, Japão (https://www.mext.go.jp) (sem 25.430.110 para KT.); e no Japão Arteriosclerosis Research Foundation (KT). Este trabalho também foi apoiado pelo Suporte para Super Ciência High Schools do Japão Agência de Ciência e Tecnologia para Izumo High School (https://rikai.jst.go.jp) (KT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pâncreas é uma neoplasia altamente agressiva com muitos por quimioterapia e radioterapia fenótipos resistentes. A incidência de câncer de pâncreas está a aumentar anualmente em todo o mundo, tornando-se a quarta causa mais comum de morte por câncer no mundo. Na verdade, o número estimado de novos casos de câncer de pâncreas era 277.000 em 2008 e 338.000 em 2012, e houve 266.000 mortes por câncer de pâncreas em 2008 e 331.000 mortes por câncer de pâncreas em 2012 [1, 2]. Como a maioria dos pacientes com câncer pancreático são diagnosticados numa fase inoperável [3, 4], a taxa de sobrevivência relativa de 5 anos em geral é baixa, eo tempo médio de sobrevivência é de apenas 6 meses, mesmo em doentes que receberam tratamento de qualidade. A fim de obter novas pistas para o desenvolvimento de estratégias preventivas e terapêuticas, muitos esforços de pesquisa têm sido focados na compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes câncer pancreático progressão [3, 4].

Ginger (

Zingiber officinale Roscoe

), uma planta perene rizomatoso, é amplamente usado como um tempero em alimentos e bebidas e utilizada principalmente como um remédio para distúrbios digestivos, incluindo dispepsia, náuseas, gastrite, vómitos, cólicas, diarreia e [5, 6]. extracto de gengibre e os seus componentes pungente, tais como [6] -gingerol e [6] -shogaol, também são conhecidos por apresentar muitos efeitos biológicos incluindo anti-inflamatório, anti-oxidação e actividade anti-cancerígena [5, 6]. Devido à sua actividade anti-inflamatória forte, gengibre tem atraído recentemente a atenção como um remédio para osteoartrite e artrite reumatóide [7, 8]. No que diz respeito à actividade anti-cancro, gengibre e os seus componentes têm sido mostrados para inibir a proliferação e induzir a apoptose de uma variedade de tipos de células de cancro in

in vitro

[9-15]. Além disso, o uso de gengibre para a quimioprevenção do cancro colorectal tem atraído a atenção [16-18]. No entanto, a atividade anticâncer do extrato de gengibre e seus constituintes contra o câncer pancreático tem sido pouco investigada.

Neste estudo, examinamos a atividade anticâncer do extrato de gengibre contra as células cancerosas do pâncreas tanto

in vitro

e

in vivo

e investigou o mecanismo potencial. Aqui, nós relatamos que o extrato de gengibre leva à redução da viabilidade celular e crescimento tumoral de Panc-1 células principalmente através autosis ROS mediada, uma forma recentemente caracterizada de morte celular.

Materiais e Métodos

células e cultura de células

pancreáticas células cancerosas humanas, as células cancerosas rato pancreático Panc-1, ASPC-1, BxPC-3, Capan-2, CFPAC-1, MiaPaCa-2 e SW1990, e, Panc02 , foram utilizados neste estudo. células Panc-1 e MiaPaCa-2 foram obtidos a partir do RIKEN BRC Cell Bank (Tsukuba, Japão), e outras linhas de células pancreáticas humanas foram adquiridas a partir da ATCC (Manassas, VA). células Panc02 foram gentilmente cedidas pelo Dr. T. Hollingsworth, University of Nebraska Medical Center [19, 20]. células Panc-1-Luc-ZsGreen e células Panc02-Luc-ZsGreen que expressam a luciferase do pirilampo e ZsGreen foram estabelecidas através de transdução de lentivírus do plasmídeo pHIV-Luc-ZsGreen, que foi depositada com Addgene (https://www.addgene.org /Bryan_Welm /), e clonagem subsequente. células alveolares pulmonares humanas epiteliais (HPAEpiC) foram adquiridos a ScienCell (Carlsbad, CA, EUA) e foram mantidas em meio de células epiteliais alveolares (AEpiCM) suplementado com soro a 2% de bovino fetal (FBS), suplemento de crescimento de células epiteliais (EpiCGS) e penicilina /estreptomicina. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram obtidas a partir de Lonza Walersville, Inc. (Walkersville, MD, EUA) e foram cultivadas em EBM-2 complementado com EGM SingleQuats (Lonza). As mitocôndrias de ADN-menos P29 (ρ

0P29) células e as células cíbrido P29mtP29 que foram reintroduzidos com mtDNA P29 em ρ

0P29 células foram estabelecidas a partir de células de carcinoma do pulmão de Lewis P29 [21]. células cancerígenas do cólon (Colo320DM, HT29, LoVo, LS174T, SW480, SW620) [22], as células cancerosas gástricas (MKN1, MKN45) [23], as células do cancro do pulmão (A549, QG56, PC-10, PC-1) [24 ], células de cancro da mama (MCF7, BT549, MDA-MB-231, MDA-MB-468) [25, 26], as células de leucemia (THP-1, K562) [27], células de osteosarcoma (Saos-2) [28 ], células de cancro cervical (HeLa) [29], células de hepatoma (HepG2) [30], as células de fibrosarcoma (HT1080) [29], e células LuM1 carcinoma rato cólon derivadas de cólon 26, tumores [31] também foram utilizados neste estudo . HT29, LS174T, SW480, SW620 e células MDA-MB-468 foram adquiridos a partir de ATCC. células MCF7 e HT1080 foram obtidos a partir do Banco celular JCRB. As células THP-1 e K562 foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Y. Honma, Shimane Universidade Faculdade de Medicina. linhas celulares de cancro gástrico foram fornecidos pelo Departamento de Patologia (Dr. S. Morikawa), Shimane University Faculdade de Medicina. Outras linhas celulares foram fornecidas pelo Dr. A. Nakagawara, Câncer Research Institute Chiba Center. As características das linhas de células utilizadas neste estudo são descritos noutro local [19-31]. linhas de células de leucemia foram cultivadas em meio RPMI1640 contendo 10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS) e 40 ug /ml de gentamicina. Outras linhas de células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de FBS e 40 ng /gentamicina ml, numa atmosfera humidificada com 21% de O

2/5% de CO

2 (normoxia) ou 1% de O

2/5% de CO

2 (hipóxia). condições de cultura hipóxicos foram alcançados de O automática umidificado

2 /CO

2 incubadora (Wakenyaku, Kyoto, Japão).

Reagentes

[6] -Shogaol e [6 ] -gingerol foram adquiridos de TOKIWA FITOQUÍMICO CO., Ltd. (Chiba, Japão).

Preparação de extrato de gengibre (SSHE)

pó seco das partes profundas da Syussai Shoga (gengibre japonês), que foi cultivada na área de Hikawa em Izumo, Shimane, foi extraída com etanol (10: 1, volume de peso) durante 20 min num banho de água de ultra-sons. O etanol foi evaporado a 80 ° C para se obter um extracto de etanol bruto do gengibre (referido como SSHE). O extracto foi pesado e dissolvido em etanol ou dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração desejada.

crescimento celular e ensaio de viabilidade

O crescimento celular e a viabilidade foi medida usando o MTT (brometo de 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) brometo) -2,5-difeniltetrazólio ensaio. Resumidamente, as células (2×10

4 células /cavidade) foram cultivadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos e tratados em triplicado em 100 ul de DMEM /FBS a 10% contendo diferentes concentrações de SSHE ou solvente sozinho, para o período indicado. No final da incubação, 10 ul de MTT (2,5 mg /mL) (Sigma-Aldrich Japão, Tokyo, Japão) foram adicionados aos poços para permitir a formação de cristais de formazano de MTT durante 4 h. Depois o meio foi removido, os cristais foram solubilizados em 100 ul de DMSO. A absorvância foi registada a 550 nm. A viabilidade das células foi também testado por um teste de exclusão do azul de tripano de corante.

ciclo celular análise

células Panc-1 tratadas com SSHE durante 20 h foram fixadas em etanol a 70% e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. As células fixadas foram lavadas com PBS de Dulbecco (DPBS) e incubadas com 100 ug /ml de ARNase A e 50 ug /mL de PI (Sigma-Aldrich Japão). As células foram então submetidas a análise citométrica de fluxo utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

Medição da membrana mitocondrial potencial

potencial de membrana mitocondrial, foi monitorizada pelo JC- 1 membrana mitocondrial kit de ensaio de potencial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Para este ensaio, 100 ul /ml de Solução A coloração de JC-1 foi adicionado a células Panc-1 tratadas com SSHE durante 20 h em placas de 6 poços, e as células foram incubadas durante 15 min. Em seguida, as células foram descoladas por tripsinização, lavadas duas vezes com o tampão de ensaio, e, em seguida, submetido a citometria de fluxo.

Anexina V /iodeto de propídio (PI) a coloração

A Anexina V-FITC Apoptosis Kit de detecção (Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA) foi utilizado para detectar anexina V e /ou células PI-positivas. Resumidamente, as células Panc-1 foram lavadas com DPBS gelado e depois coradas com anexina V-FITC durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro e PI em gelo-tampão de ligação frio. células de Anexina V e /ou PI-positivas foram contadas utilizando um citómetro de fluxo FACS Calibur.

Medição da geração de ROS

A produção de ROS foi monitorizada por citometria de fluxo com 2 ‘, 7’- dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA) (Molecular Probe-Life Technologies, Carlsbad, CA) e indicador de superóxido mitocondrial MitoSOX Red (Invitrogen) como sondas. Resumidamente, Panc-1 células tratadas com SSHE foram incubadas com 10 uM de H2DCFDA ou 5 uM de MitoSOX vermelho em DMEM isento de soro durante 10 min. O meio foi removido, e as células foram separadas com um breve tratamento de tripsina a 0,25% em solução salina equilibrada de Hank. Após a adição de meio de cultura fresco, as células foram recolhidas por centrifugação, lavadas uma vez com DPBS e suspensas em DPBS. A fluorescência foi monitorizada usando o citómetro de fluxo FACSCalibur ou sob um microscópio confocal de laser (FluoView FV1000, Olympus, Tóquio).

Western blotting

Os extractos celulares foram preparados por lise de células com tampão RIPA (50 Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio, EDTA 2 mM, cocktail de inibidores de protease e cocktail de inibidores de fosfatase) em gelo durante 20 min. Os lisados ​​foram centrifugados a 12.000 ×

g

durante 10 min a 4 ° C, e os sobrenadantes foram utilizados para análises subsequentes. análises de electroforese em gel e imunotransferência de SDS-poliacrilamida foi realizada como descrito anteriormente [32]. Os anticorpos primários utilizados foram monoclonal de coelho anti-SQSTM1 /p62 (D5E2, diluição 1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anticorpo policlonal de coelho anti-LC3B (diluição de 1: 1000, Cell Signaling), anticorpo policlonal de coelho anti-fosfo mTOR (S2481) (1: 1000 de diluição, Cell Signaling), anticorpo monoclonal de coelho anti-mTOR (7C10, diluição 1: 1000, Cell Signaling), anticorpo monoclonal de coelho anti-fosfo-AMPKα (T172) (40H9, diluição 1: 1000, Cell sinalização) e monoclonal de coelho anticorpo anti-AMPKα (23A3, 1: 1000 de diluição, Cell Signaling). Os anticorpos secundários foram coelho HRP-conjugado ou rato anti-IgG (diluição 1: 3.000, Cell Signaling). Para os controlos de carga, anticorpo anti-actina β (SC-47778, 1: 3000 de diluição, Santa Cruz Biotechnology) foi usado. Os sinais foram visualizados utilizando ECL mais (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). As membranas foram digitalizados com um Luminoimaging Analyzer LAS4000 (GE Healthcare).

imunofluorescência coloração

células Panc-1 tratados com veículo sozinho ou SSHE foram fixadas com formaldeído a 4% /5% de sacarose em DPBS durante 20 min, lavadas com DPBS, e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 em DPBS durante 4 min. Em algumas experiências, as células foram coradas com 100 nM de MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen) durante 10 min antes da fixação. As células foram bloqueadas com 3% de BSA /0,1% de glicina em DPBS durante 1 h, lavadas e depois incubadas com anticorpo monoclonal de coelho anti-FIA (D39D2, diluição 1: 200, Cell Signaling) ou anticorpo anti-LC3B policlonal de coelho (1: 200 de diluição) durante 1 h. Após extensa lavagem com DPBS, as culas foram incubadas com IgG de cabra Alexa Fluor 488 conjugado com anti-coelho (diluição 1: 300, Invitrogen) durante 1 h. As células foram contrastadas com DAPI e observado sob um microscópio confocal de varredura a laser.

microscopia eletrônica de transmissão (TEM) análise

células Panc-1 não tratadas e as células tratadas com 200 ug /ml SSHE para 28 h foram colocadas em 2% de paraformaldeído e glutaraldeído a 2% em 30 mM de tampão HEPES (HEPES 30 mM, NaCl 100 mM, CaCl 2 mM de

2, pH 7,4) durante 2 h a 4 ° C e pós-fixados com um % OsO

4 durante 1 h a 4 ° C. As amostras foram desidratadas com álcool graduado e embebidos em resina TAAB812 (TAAB Laboratories Equipment Ltd., Berkshire, Reino Unido). Secções ultrafinas foram coradas durante 1 h em acetato de uranilo aquoso a 3%, lavadas e contra-coradas com citrato de chumbo a 0,3%, e eles foram examinados num microscópio electrónico de transmissão (EM-002B, JEOL, Tóquio, Japão).

plasmídeo GFP-LC3 e transfecção

plasmídeo de fusão EGFP-LC3B (pCMX-HSA /Y145F-LC3B-GFP) foi construído por clonagem de ADNc LC3B, que foi amplificado por PCR, para um pCMX-HSA /Y145F-GFP [33]. A estrutura foi verificada por sequenciação de ADN. Panc-1 ells foram transitoriamente transfectadas com o plasmídeo usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 h, as células foram expostas a SSHE e examinadas sob um microscópio confocal de varredura a laser.

Experiências com animais

Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de pesquisas com animais. O protocolo foi aprovado pela Comissão de IZUMO Campus animal Cuidado e Uso da Universidade de Shimane (Número de permissão: IZ26-7). Todos os ratinhos foram alojados no centro do animal de Shimane Universidade Faculdade de Medicina sob condições específicas isentas de agentes patogénicos, a uma temperatura controlada de 23 ± 2 ° C, humidade relativa 55 ± 10%, e com 12 h de luz /12 h de ciclos escuros. Eles receberam comida e água

ad libitum

. Os ratinhos foram verificados quanto à sua saúde durante todo o período experimental, pelo menos, uma vez por dia após a injecção do tumor. Todos cirurgia foi realizada sob medetomidina (0,3 mg /kg) /midazolam (4,0 mg /kg) /butorfanol (5,0 mg /kg) a anestesia. Os ratinhos foram sacrificados por normalmente CO

2 inalação no final do estudo. Para o modelo de difusão peritoneal, células Panc02-Luc-ZsGreen (5×10

5 células /ratinho) foram injectados por via intraperitoneal como uma suspensão de células em macho de 7 semanas de idade C57BL /6 (Crea Japão, Tokyo, Japão), e os murganhos foram randomizados e agrupados no controlo (n = 8) e os grupos SSHE (n = 8). Os regimes de tratamento foram iniciadas um dia após a inoculação do tumor. Os ratinhos foram submetidos a eutanásia num CO

2 câmara quando eles estavam moribundas, medido por uma falta de resposta a estímulos propositada sustentada suaves. Foram feitos todos os esforços, incluindo a administração subcutânea de meloxicam (5 mg /kg) para minimizar o sofrimento. A experiência foi realizada duas vezes, e os dados combinados foram submetidos a análises. Para o modelo ortotópico de cancro do pâncreas, células Panc-1-Luc-ZsGreen (1×10

6 células /ratinho) foram implantados com 50% de Matrigel em pâncreas de 6 semanas de idade, ratinhos nus fêmea (BALB /c nu /nu, Japan SLC, Shizuoka, Japão) [32]. Uma semana após a injecção, eles foram distribuídos aleatoriamente e agrupados no controlo (n = 6) e os grupos SSHE (n = 6). Os regimes de tratamento foi iniciado uma semana depois da injecção do tumor. Para experiências de carcinoma do mouse cólon, células LuM1 (3 x 10

5 células) foram implantadas subcutaneamente no sexo masculino ratinhos Balb /c (n = 6 para o controle eo grupo SSHE). Os volumes de tumores LuM1 foram avaliados por medição de dois diâmetros perpendiculares com um calibre. O volume do tumor (V) foi calculado usando a seguinte equação: V =

(a

2

xb) /2

, onde

a

é o pequeno diâmetro e

b of the grande diâmetro. No grupo de SSHE, os ratinhos foram administrados por via intraperitoneal de 80 mg /kg uma vez por dia SSHE. No grupo controle, os ratos foram administrados solvente sozinho em DPBS.

imagem de bioluminescência

In vivo

bioluminescente imagiologia foi realizada utilizando o sistema de imagem IVIS (Caliper Life Sciences, Hopkinton , MA). Todos os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com 150 mg /kg de d-luciferina (Promega, Fitchburg, WI) e anestesiados com 2,5% de isoflurano. Dez minutos mais tarde, fotões de corpos inteiros dos animais foram visualizados utilizando o sistema de imagiologia IVIS (Caliper Life Sciences) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram analisados ​​por viver imagem 2.50 software (Caliper Life Sciences). Foram anestesiados

hematologia e bioquímica do sangue teste

Mice, e foi coletado sangue do coração. perfis de sangue periférico foram analisados ​​pelo Sysmex KX-21NV analisador de hematologia automático (Sysmex, Kobe, Japão). Os níveis de células brancas do sangue (WBC), glóbulos vermelhos (RBC), plaquetas (PLT), hemoglobina (HGB), hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), e hemoglobina corpuscular média foram examinados concentração (MCHC). Glicose (Glu) níveis, o colesterol total (T-cho) níveis, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) e de azoto da ureia no sangue (BUN) níveis foram analisadas com um analisador automático de química clínica, SPOTCHEM EZ SP- 4430 (ARKRAY, Inc., Kyoto), usando tiras de teste SPOTCHEM II.

cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (HPLC)

separações cromatográficas líquidas foram conseguidos utilizando uma fase inversa C- -18, 3 uM, 2,4 × 250 mm (Cosmosil. Nakarai Tesque, Inc., Kyoto, Japão) a uma taxa de fluxo de 1 ml /min. A fase móvel foi de 70% de metanol. O perfil de eluição foi monitorizado por espectrofotometria de UV a 228 nm.

A análise estatística

Todos os dados são apresentados como a média ± DP. significância estatística entre os conjuntos de dados foi testada pelo

t

teste de Student não pareado. Sobrevivência de ratos foram analisados ​​utilizando o teste de log-rank. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

SSHE inibe a progressão do ciclo celular e induz a morte de linhas celulares de cancro pancreático

O tratamento de células Panc-1 com SSHE para 20 h resultou numa paragem na fase G0 /G1 do ciclo celular (Fig 1A). Um aumento na fracção subG1, uma característica da apoptose, foi marginal. SSHE, eventualmente, induziu a morte de células Panc-1 e de outras linhas de células de cancro pancreático humano e do rato (Figura 1B). As células normais, como de HUVEC e HPAEpiC foram mais resistentes à SSHE comparação com Panc-1 células (Fig 1C). Nas fases posteriores da morte celular das células Panc-1, ruptura da membrana plasmática focal e o encolhimento do núcleo eram evidentes (Fig 1D). Deve notar-se que a fragmentação do núcleo, uma outra característica da apoptose, foi observada raramente, nesta fase. SSHE também foi eficaz na indução da morte de células Panc-1 sob condições hipóxicas (Figura 1E). É também causou um retardamento do crescimento significativa e a morte numa variedade de linhas de células de tumor adicionais, tais como cancro do cólon, cancro gástrico, cancro do pulmão, cancro da mama, leucemia, osteossarcoma, hepatoma, cancro do colo do útero e fibrosarcoma (Fig S1).

(A) do ciclo celular. células Panc-1 foram tratados apenas com veículo, de 100 ug /mL de SSHE ou 200 ug /mL de SSHE, durante 20 h, fixadas, coradas com PI, e, em seguida, submetido a citometria. (B) A viabilidade celular. linhas celulares de cancro pancreático foram tratados apenas com veículo ou várias concentrações de SSHE durante 42 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. bares; SD. (C) Efeito de SSHE sobre as células normais. HUVEC, HPAEpiC e Panc-1 células foram tratadas só com veículo ou 100 ug /ml de SSHE para 38 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. bares; SD. (D) Morfologia. células Panc-1 foram tratados com o veículo sozinho (esquerda) ou 200 ug /ml durante 40 h SSHE (direita). (E) Efeito do SSHE em células Panc-1 sob condições hipóxicas. células Panc-1 foram tratados apenas com veículo ou várias concentrações de SSHE durante 42 h. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio do MTT.

SSHE induz a morte celular autotic em vez de apoptose em células ou necroptosis Panc-1 |

Para investigar o mecanismo através do qual SSHE induziu a morte de Panc -1 células, foram investigados vários marcadores de células apoptóticas. O ensaio de JC-1 revelou uma redução acentuada do potencial de membrana mitocondrial após o tratamento SSHE (Fig 2A). Anexina V /PI coloração também mostraram um aumento na percentagem de células de anexina V-positivas e /ou PI-positivas, dependendo da concentração de SSHE (Fig 2B). No entanto, o inibidor da pan-caspase zVAD-fmk não melhorou a sobrevivência das células (Fig 2C). Além disso, a caspase 3 clivada foi dificilmente detectável após tratamento com 200 ug /mL de SSHE durante 24 h. Após o tratamento SSHE, cerca de 30% das células eram positivas PI, enquanto que o tratamento das células com pifithrin-μ e TRAIL activado caspase-3 (figura 2D), coincidindo com um relatório anterior [34]. Com base nos dados que sugerem que SSHE nem aumentou a percentagem da fracção subG1 (Figura 1A), nem induzida fragmentação do núcleo (Figura 1D), não foi possível obter provas concretas da apoptose nas células Panc-1-tratados SSHE. Além disso, a translocação do factor de indução de apoptose (AIF), um efector de morte mitocondrial independente de caspase, para o núcleo não era aparente (Fig S2), e necrostatin-1, um inibidor de RIP1 necroptosis mediada por cinase, não conseguiram evitar SSHE- morte celular induzida (Fig S2). Assim, nem a apoptose independente de mitocôndrias nem necroptosis estava envolvido na morte celular induzida por SSHE.

(A) potencial de membrana mitocondrial. células Panc-1 foram tratados apenas com veículo, de 100 ug /mL de SSHE ou 200 ug /mL de SSHE durante 20 h e, em seguida, submetido a ensaio do JC-1. Células saudáveis ​​com mitocôndrias funcionais que contêm vermelho JC-1 J-agregados e células em apoptose ou insalubres com mitocôndrias colapsados ​​que contêm principalmente verdes JC-1 monômeros foram detectados por citometria. coloração (B) anexina V /PI. células Panc-1 foram tratados apenas com veículo, de 100 ug /mL de SSHE ou 200 ug /mL de SSHE durante 24 h e, em seguida, submetido a anexina V /PI coloração. (C) Efeito de zVAD-fmk (zVAD) sobre a morte celular induzida por SSHE. células Panc-1 foram incubadas durante 42 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. bares; SD. (D) a activação de caspase-3. células Panc-1 foram incubadas com 200 ug /mL de SSHE para vários períodos de tempo ou tratados com 10 ^ M-pifithrin μ e 100 TRAIL ng /ml durante 60 h (serviu como controlo positivo). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de transferência de Western com anticorpo anti-caspase 3.

Por outro lado, SSHE marcadamente aumentou a razão LC3-II /LC3-I, um indicador de formação autophagosome, em uma dose e modo dependente do tempo. SSHE também diminuiu os níveis de proteína /SQSTM1 p62, um dos substratos específicos degradadas através da via autofagia-lisossomal, em células Panc-1 (Figura 3A e 3B). SSHE activado AMPK, um regulador positivo da autofagia, e mTOR inibido, um regulador autofágica negativo (Fig 3C e 3D). Os inibidores autophagy 3-metiladenina e cloroquina preveniu parcialmente a morte celular (Figura 3E). Morfologicamente, as células tratadas com SSHE mostrou vacuolização massiva do citoplasma, aproximadamente 24 h após o tratamento (Fig 4A). Esses vacúolos citoplasmáticos eram prováveis ​​autofagossomas porque GFP-LC3 puncta apareceu após o tratamento com SSHE (Fig 4B). Alguns pontos lacrimais LC3 foram co-localizada com mitocôndrias MitoTracker-positiva nas células tratadas com 100 ug /mL de SSHE durante 20 h, sugerindo a ocorrência de mitophagy (Figura 4C). Assim, a morte celular induzida por SSHE parecia ser a morte celular autophagic. No entanto, análises de MET 28 h após o tratamento demonstrou SSHE mitocôndrias densos em electrões, vacúolos vazios e inchaço focal perinuclear (Figura 4D), que não são observados no tipo autofagia clássica [35]. Assim, concluímos que a morte celular induzida por SSHE era independente de caspase e se assemelhava a morte celular autofagia. Esta forma de morte celular coincide bem com autosis, um Na recentemente caracterizada

+, K

+ – ATPase forma regulada de morte celular [36]. Infelizmente, devido a digoxina glicósido cardíaco, um antagonista de Na

+, K

+ – ATPase que é relatado para inibir autosis [36], foi muito citotóxico para células Panc-1, não foi possível avaliar o seu efeito sobre SSHE-induzida morte celular.

(a) Efeito de SSHE sobre a expressão de proteínas relacionadas com autophagy. células Panc-1 foram tratados apenas com veículo, de 100 ug /mL de SSHE ou 200 ug /mL de SSHE, durante 24 h. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot com anticorpos anti-SQSTM1 /p62 ou anticorpo anti-LC3. p-actina serviu como um controlo de carregamento. (B) o tempo de curso da conversão de LC3-I lc3-II. células Panc-1 foram tratadas com 200 ug /mL de SSHE para os tempos indicados. (C) a expressão AMPK e mTOR. células Panc-1 foram tratadas com 200 ug /mL de SSHE para vários tempos. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot com anticorpos anti-AMPK, anticorpo anti-fosfo-AMPK, anti-mTOR, ou anti-fosfo-mTOR. p-actina serviu como um controlo de carregamento. (D) a ativação da AMPK e inibição do mTOR por SSHE. A intensidade das bandas em (C) foi quantificada por programa Image J. (E) Efeito de 3-metiladenina (3-MA) ​​e cloroquina (CQ) sobre a morte celular induzida por SSHE. células Panc-1 foram tratados com SSHE à concentração indicada na ausência ou na presença de 10 uM de 3-MA (esquerda) ou 40 CQ ^ M durante 42 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. imagens de Western blot (A-C) foram cortadas para a apresentação. imagens em tamanho maior são apresentados em bares S13 Fig; SD.

(A) de contraste de fase. células Panc-1 foram tratados com o veículo por si só ou 100 ug /ml de SSHE durante 40 h. bares; 100 um. (B) LC-3 pontos lacrimais. células Panc-1 transf ectadas com pCMX-HSA /Y145F-LC3B-GFP foram tratados apenas com o veículo ou 100 ug /ml de SSHE, durante 24 h e foram observadas sob um microscópio confocal de laser. bares; 20? M. (C) A coloração por duas vezes com MitoTracker e anticorpo anti-LC3. células Panc-1 foram tratados com o veículo sozinho, 100 ug /ml ou 200 ug /mL de SSHE durante 24 h, corado com 100 nM de MitoTracker Red durante 10 min, fixa, e, em seguida, processado para imunocoloração LC3. bares; 20? M. (D) Ultra-estrutura. células Panc-1 tratadas com veículo sozinho ou 200 ug /ml durante 28 h SSHE foram processados ​​para análise de TEM. ampliação original, x2,500. PC, espaço perinuclear.

geração mitocondrial ROS está envolvido em induzida SSHE morte celular

Alterações na geração de ROS, avaliada pela coloração H2DCFDA, após o tratamento de células Panc-1 com SSHE mostrou um padrão bifásico. Nas fases iniciais (aproximadamente 10 h), a produção de ROS foi inibida por SSHE (Fig S3). No entanto, o tratamento prolongado resultou em um aumento robusto na geração de ROS (Fig 5A e 5B). MitoSOX coloração vermelha também mostrou que o aumento da produção de superóxido mitocondrial (Fig S4). O antioxidante N-acetilcisteína (NAC) atenuou significativamente a morte celular induzida por SSHE como avaliado pelo teste de exclusão do corante azul de tripano (Fig 5C). Estes resultados sugerem que a produção de ROS, como uma causa de morte celular induzida por SSHE.

(A) células Panc-1 tratadas com o veículo sozinho, 100 ug /mL de SSHE ou 200 ug /ml durante 20 h SSHE foram coradas com 10 uM H2DCFDA durante 10 min e imediatamente observado sob um microscópio confocal de laser. (B) Panc-1 em células tratadas como um foram sujeitas a citometria. (C) Efeito de NAC na morte celular induzida por SSHE. células Panc-1 foram tratadas com 200 ug /mL de SSHE, na presença ou ausência de NAC 10 mM, durante 42 h. A viabilidade celular foi avaliada por um ensaio de exclusão de azul de tripano de corante. bares; SD.

As mitocôndrias são relatados para ser a principal fonte de ROS necessária para a indução de autofagia [37]. Para examinar se ROS mitocondrial desempenhar um papel na morte celular induzida por autotic SSHE, utilizou DNA mitocondrial (mtDNA) -menos ρ

0P29 células que são derivadas de células de P29 de Lewis de carcinoma de pulmão e células P29mtP29 que foram estabelecidos pela reintrodução wild- digite mtDNA em ρ

0P29 células. Quando ρ

0P29 células foram tratadas com SSHE eles mal produzido ROS, enquanto as células P29mtP29 suficientemente produzido ROS (S5 Fig). Curiosamente, ρ

0P29 células foram revelados para ser resistente a SSHE em comparação com células P29mtP29 (S5 FIG).

SSHE retarda o crescimento do tumor de câncer pancreático

Quando as células Panc02-Luc-ZsGreen (5 x 10

5 células) foram intraperitonealmente transplantadas em ratinhos C57BL /6, eles tendem a formar nódulos disseminados preferencialmente ao redor do pâncreas e na superfície peritoneal, e os ratos desenvolveram ascite (cerca de 2,4 ml /ratinho quando moribundos) ( Fig S6). Foi examinada a eficácia terapêutica de SSHE neste modelo de difusão peritoneal.