Abstract

A incidência e mortalidade do câncer colorretal (CRC) é maior em afro-americanos (AAs) do que outros grupos étnicos em os EUA , mas razões para as disparidades são desconhecidos. Realizamos perfil dos CRCs esporádicos de AAs vs. americanos europeus (EAS) a expressão do gene para avaliar a contribuição para as disparidades CRC. Nós avaliamos a expressão gênica de 43 AA e 43 tumores EA CRC pareados por estágio e 40 correspondentes tecidos colorretais normais usando o genoma matrizes inteiras humanos Agilent cDNA 4x44K. Gene e via análises foram realizadas utilizando Análise Significado dos Microarrays (SAM), validação cruzada dez vezes, e Ingenuity Pathway Analysis (IPA). SAM revelou que 95 genes foram diferencialmente expressos entre AA e pacientes EA a uma taxa descoberta falsa de ≤5%. Usando IPA determinou-se que a doença e vias mais importantes associações de genes diferencialmente expressos foram relacionados à inflamação e resposta imune. Dez vezes validação cruzada demonstrou que, após 10 genes pode prever etnia com uma precisão de 94%: CRYBB2, PSPH, ADAL, VSIG10L, C17orf81, ANKRD36B, ZNF835, ARHGAP6, TRNT1 e WDR8. Expressão destes 10 genes foi validado por qRT-PCR em um conjunto de teste independente de 28 pacientes (10 do AA, 18 EA). Nossos resultados são os primeiros a implicar expressão diferencial de genes no CRC disparidades raciais e indicar diferença de destaque no CRC inflamação entre AA e pacientes EA. As diferenças na susceptibilidade à inflamação apoiar a existência de microambientes tumorais distintos nessas duas populações de pacientes

Citation:. Jovov B, Araujo-Perez F, Sigel CS, Stratford JK, McCoy AN, Yeh JJ, et al. (2012) expressão gênica diferencial entre Africano-americanos e pacientes com câncer colorretal americanos europeus. PLoS ONE 7 (1): e30168. doi: 10.1371 /journal.pone.0030168

editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de março de 2011; Aceite: 15 de dezembro de 2011; Publicação: 19 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Jovov et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios para gastrointestinal especializada Programa de Investigação Excellence (SPORE GI, P50 106991) e pela University of North Carolina Centro de Biologia gastrointestinal e Doenças (CGIBD, P30 DK 34987). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) continua a ser o cancro gastrointestinal mais comum nos Estados Unidos, apesar das recentes melhorias no diagnóstico e tratamento da doença. As taxas de incidência e mortalidade do CRC para afro-americanos (AA) são maiores do que na população em geral EUA [1], [2]. Muitas investigações epidemiológicas e genéticas têm incidido sobre AAs [3], [4], [5], [6] com o objetivo de decifrar as razões para essas disparidades. Considerando que não se pode descontar a contribuição de fatores socioeconômicos, como um estágio mais avançado da doença no momento do diagnóstico em AAs, outros fatores biológicos também contribuem para a progressão do cancro do cólon [4]; [7]. No entanto, uma base biológica para a existência de um CRC mais agressivo em pacientes afro-americanos continua a ser ainda elucidado. instabilidade genômica é uma característica crucial no desenvolvimento do tumor e há pelo menos 3 vias distintas em CRC patogênese: instabilidade cromossômica (CIN), instabilidade de microssatélites (MSI), e as vias ilha CpG methylator fenótipo (CIMP) [8], [9]. Qualquer uma ou todas estas vias podem contribuir para uma biologia CRC mais agressivo em afro-americanos. Recentes estudos de associação do genoma em CRC têm demonstrado não só uma forte evidência para o polimorfismo de nucleotídeo único comum (SNP) associação em um número de genes e regiões cromossômicas, mas também heterogeneidade genética em associação CRC em AAs contra EAs [4], [10] [11], [12], [13]. incidência diferente de MSI e diferentes níveis de metilação de genes funcionalmente muito relevantes também foram relatados como possíveis fatores na CRC disparidades raciais [8], [14], [15].

Nossa hipótese é que os perfis de expressão gênica da CRC em pacientes afro-americano e europeu-americanas podem revelar diferenças biológicas entre as duas populações que poderiam explicar o fenótipo de câncer mais agressivo em afro-americanos. Assim, realizamos perfil de expressão de genes do genoma em um grande conjunto de amostras de tumores que foram pareados por variáveis ​​clínicas selecionadas. Analisamos nossos resultados sobre os níveis de genes e vias para identificar as principais diferenças na biologia do tumor entre os pacientes Africano-americano e europeu-americanas.

Métodos

Os pacientes

Cento e quatorze tumores (86 incluídas na análise original e 28 para estudo de validação) e 40 tecidos normais dos pacientes com CCR de-identificados foram obtidos do Conselho de Pesquisa Institucional (IRB) aprovou Universidade da Carolina do Norte (UNC) Facilidade de recolha de tecidos após UNC School of Medicine IRB aprovação para este estudo. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. Todas as amostras foram coletadas entre 1999 e 2008, no momento da operação e congelados em nitrogênio líquido. Foram excluídos pacientes com polipose adenomatosa familiar conhecida e hereditário não-polipose CRC. dados de-identificados, incluindo raça, tumor, nódulo e metástase (TNM), grau ou diferenciação, status da margem, e sobrevivência estavam disponíveis para a maioria dos pacientes.

Isolamento RNA e Microarray Hybridization

tudo o isolamento de ARN e hibridação foi realizada em Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) total humano genoma DNA microarrays 4X44 K da UNC. RNA foi extraído de amostras de tumores congelados instantaneamente macrodissected usando todos os kits de preparação (Qiagen, Valencia, CA) e quantificadas usando Nanodrop espectrofotometria (ThermoScientific, Wilmington, DE). a qualidade do RNA foi avaliada com o uso do Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). RNA foi selecionado para a hibridização usando o número de integridade do RNA e por inspeção dos 18S e 28S RNA ribossomal. Semelhante a qualidade do RNA foi seleccionado através de amostras. Um micrograma de ARN foi utilizado como um molde para a preparação de ADNc antes da hibridação com Agilent 4X44 K matrizes genoma humano inteiro. ADNc foi marcado com Cy5-dUTP e um controlo de referência (Stratagene; Número de Catálogo # 740000; Agilent Technologies, Santa Clara, CA; [16] foi marcada com Cy3-dUTP utilizando o kit de amplificação Agilent baixo de entrada de ARN linear e hibridados durante a noite a 65 ° C a Agilent 4X44 K matrizes genoma humano inteiro. Arrays foram lavadas e digitalizadas com um scanner Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA):.

Todos os dados de microarranjos são em forma compatível Miame e raw e os dados processados ​​tem foi depositado na expressão gênica Omnibus (GEO); ver https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, número de acesso:. GSE28000

Microarray e análise estatística

Todos os dados de matriz foram normalizados utilizando LOWESS normalização. os dados foram excluídos por genes com pobre qualidade de ponto ou genes que não têm uma intensidade média maior do que 10 por um dos dois canais (verde e vermelho) em, pelo menos, 70% das experiências. o rácio de log2 da intensidade do vermelho significativo sobre intensidade verde média foi calculada para cada gene, seguida por LOWESS normalização [17]. Os dados em falta foram imputados usando a imputação k-vizinhos mais próximos (KNN), com k = 10 [18]. Genes que foram significativamente para cima ou para baixo-regulados foram identificados utilizando Análise Significado dos Microarrays (SAM) [19]. SAM atribui uma pontuação para cada gene na base de uma mudança na expressão do gene em relação ao desvio padrão de medições repetidas. Para genes com pontuações superiores a um limiar ajustável, SAM usa permutações das medições repetidas para estimar o percentual de genes identificados por acaso – a taxa de descoberta de falsas (FDR). parâmetros de análise (Delta) foram estabelecidos para resultar em FDR≤5%.

Rede e ontologia gênica análise

genes diferencialmente expressos foram investigados para a rede e gene inter-funcional, Análise Ingenuity Pathways (IPA) software (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com; [20]. IPA verifica o conjunto de genes de entrada para identificar as redes usando Ingenuity Pathways Knowledge base para interacções entre o genes Focus identificados, neste estudo, os genes diferencialmente expressos entre AA e eA e os genes interagem conhecidos e hipotéticos armazenados na base de conhecimento em software IPA foi utilizado para gerar um conjunto de redes com um tamanho máximo rede de 35 genes /proteínas. Networks são apresentados graficamente como produtos de genes /gene ( ‘nós’) e as relações biológicas entre os nós ( ‘bordas’). Todas as arestas são de informações canônica armazenado no Ingenuity Pathways Knowledge base. Além disso, o IPA calcula uma pontuação para cada rede de acordo com o ajuste do conjunto de genes importantes do usuário. A pontuação indica a probabilidade de os genes Foco em uma rede de base de conhecimento da Ingenuity serem encontrados juntos devido ao acaso. A pontuação de 3, como o corte para identificar redes de genes, indica que há uma chance de apenas 1/1000 que os genes de focagem apresentados em uma rede é devida ao acaso. Portanto, uma pontuação de 3 ou superior indica um nível de confiança de 99,9% para excluir acaso.

dez vezes Cruz Validation (Ten-f-CV)

Ten-f-CV análise [ ,,,0],21] foi usado para selecionar menor conjunto representativo de genes para estudo de validação por qRT-PCR. Usando Dez-F-CV análise foram identificados 10 genes que podem predizer a etnia do paciente para o qual a matriz foi feito com uma taxa de erro de 6%, o que sugere que estes 10 genes são representativos da lista gene inteiro.

Quantitative PCR em tempo real

a validação dos resultados de microarray foi realizado em 28 pacientes com CCR (10 AA e 18 eA). Dez genes diferencialmente expressos identificados por (SAM e seleccionados utilizando o método Dez-F-CV) foram validados por qRT-PCR. O gene da sintase hidroximetilbilano (HMBS) serviu como o gene de manutenção [22]. qRT-PCR foi realizada em duplicado, utilizando ensaios de expressão genética verde SYBR (Applied Biosystems, guarda florestal City, CA), que incluem iniciador pré-optimizados conjuntos específicos para os genes a ser validado [23]. Os genes validados foram: Cristalina, beta B2 (CRYBB2), homologue fosfo fosfatase (PSPH), adenosina deaminase-like (ADAL), V-set e domínio de imunoglobulina contendo 10 like (VSIG10L), cromossoma 17 grelha de leitura aberta 81 (C17orf81) , Ankyrin domínio de repetição 36B (ANKRD36B). Zinco proteína de dedo de 83 (ZNF83), Rho GTPase proteína de activação de 6 (ARHGAP6), WD domínio repetição 8 (WDR8), TRNA nucleótidos transferase, CCA-acrescentando: 1 (TRNT1) e HMBS. Os dados foram coletados utilizando o PRISM 7500 sistema de detecção de seqüência ABI (Applied Biosystems, Forster City, CA). dados de qRT-PCR para cada amostra foram normalizados utilizando a expressão dos genes HMBS arrumação. Os gráficos foram preparados a partir de dados normalizada em relação ao HMBS. A análise estatística destes dados foi realizada com dois lados

t

-teste ou com um teste rank-sum de dois lados Wilcoxon se os dados de expressão não seguiu distribuição normal.

Resultados

Identificação de genes diferencialmente expressos entre AA e pacientes eA CRC

características população de pacientes para 43 AA e 43 pacientes eA foram pareados por estadiamento TNM (Tabela 1). As duas populações foram semelhantes em idade, sexo e localização do tumor. Quarenta tecidos do cólon não-tumorais (13 AAs e 27 EAs) foram utilizados para comparações genéticas de expressão normal do gene dois pontos entre AAs e EAs.

A comparação de perfis de expressão gênica de AA e tumores EA usando SAM 95 reveladas transcritos do gene a ser expresso diferencialmente entre os dois grupos em FDRs de ≤5%. Cinquenta e oito genes foram-se regulada (Tabela 2) e 37 para baixo regulada (Tabela 3) em tumor de AAs. Usamos Ingenuity Pathway Analysis para avaliar doenças e via associações desses 95 genes que foram diferencialmente expressos em tumores CRC por raça. A análise de associação da doença revelou associações de genes diferencialmente expressos com vias genéticas que estão ligadas à resposta inflamatória, doença do sistema hepática, transtornos do desenvolvimento, doenças genéticas e doenças neurológicas (Tabela S1). Os seis vias associadas topo para os genes expressos diferencialmente são mostrados na Fig. 1. Três destes seis vias estão relacionadas com a resposta inflamatória e imunitária. genes diferencialmente expressos em cinco redes mais altos de pontuação são apresentados na Tabela 4. funções de rede Top associado para genes diferencialmente expressos foram: 1) lesão do organismo e anormalidades, a expressão do gene, o desenvolvimento celular 2) metabolismo lipídico, pequena molécula bioquímica, transporte molecular 3) montagem celular e organização, desenvolvimento de órgãos, metabolismo de carboidratos 4) apresentação de antígenos e resposta inflamatória, movimento celular 5) comportamento, desenvolvimento do sistema digestivo e função, desenvolvimento e função do sistema endócrino. Uma dessas redes (rede 4; a apresentação de antigénio e resposta inflamatória) está graficamente representada na Fig. 2. Sete dos nove genes desta rede foram-se regulamentada em pacientes AA (HLA-DQB1, IL33, PAK2, PROKR1, SAA2, TLR4, ZNF234) e dois genes foram regulados (DHX58, IL27).

do eixo Y é uma indicação inverso do valor de p ou significado. A linha de Threshold marca a p = 0,05. (Note-se que 3 de 6 principais vias mostradas estão relacionados à inflamação e resposta imune).

Símbolos vermelhos são atribuídas para up-regulada e verde para genes regulados por baixo. forma nó corresponde ao papel funcional de moléculas, como mostrado na legenda. interações diretas ou indiretas são mostrados por linhas completas ou tracejadas.

Nós também realizadas análises SAM usando tecidos do cólon não-tumorais de pacientes com AA e EA e não ver expressão diferencial de genes (dados não mostrados), o que sugere que as mudanças que estão identificados microambiente do tumor específico.

validação dos resultados de microarray

para selecionar um grupo representativo de genes para validação qRT-PCR genes de diferencialmente expressos entre AA e os pacientes eA CRC, foi realizada uma análise de validação cruzada de 10 vezes que resultou na seleção de seguir dez genes: CRYBB2, PSPH, ADAL, VSIG10L, C17orf81, ANKRD36B, ZNF835, ARHGAP6, TRNT1 e WDR8.

Expression destes dez genes foi validado por qRT-PCR em um conjunto de teste independente de 28 pacientes de CRC (10 AA e 18 eA). Os resultados qRT-PCR estão apresentados na Fig. 3. Dois dos 10 genes diferencialmente expressos foram regulados positivamente em AA vs. pacientes EA CRC; CRYBB2, p = 0,0004 e PHSP, p = 0,001 (Figura 3;. Painel A.). Oito foram regulados negativamente em AA vs. pacientes EA CRC; VSIG10L, p = 0,015; C17orf81, p = 0,032; WDR8, p = 0,002; TRNT1, p = 0,004; ANKRD36B, p = 0,044; ARHGAP6, p = 0,049; ADAL, p = 0,074; ZNF83, p = 0,11; (Figura 3;. Painel B.). A direção da mudança (para cima ou para baixo regulamento) para os genes validados qRT-PCR estava de acordo com os resultados SAM. Oito dos dez genes no estudo de validação qRT-PCR atingiu um nível estatisticamente significativa (p 0,05; CRYBB2, PSPH, C17orf81, ANKRD36B, VSIG10L, WDR8, TRNT1 e ARHGAP6).

Painel A. expressão de dois -regulada genes em pacientes com câncer colorretal afro-americanos: CRYBB2, PSPH. Painel B. A expressão de oito genes regulados negativamente em pacientes com câncer colorretal afro-americanos: ARHGAP6, VSIG10L, C17orf81, ZNF83, ANKRD36B, ADAL, WDE8 e TNRT1. Pontos são valores Ct relativas para as amostras individuais; linhas horizontais são valores médios para o conjunto da amostra. Os genes diferencialmente expressos de forma significativa (p 0,05) entre Africano-americana (n = 10) versus Europeia-americana (n = 18) tumores de CRC são marcados por uma estrela. Os gráficos foram preparados a partir de genes normalizados dados expressão relativa ao serviço de limpeza (HMBS) gene.

Discussão

As causas da disparidade CRC que existe entre pacientes com AA e EA ainda não foram totalmente elucidado. Embora a maioria das pesquisas sobre esta disparidade tem se concentrado em fatores socioeconômicos, descobertas recentes apoiam fortemente o papel dos fatores genéticos e biológicos. foram relatadas diferenças genéticas entre AA e os pacientes EA CRC para a associação SNP, para incidência de MSI e nível de gene de metilação [4], [14], [15]. Qualquer destas diferenças podem resultar em expressão de gene diferencial entre AA e AE pacientes de CRC. Neste estudo foram analisados ​​os perfis de 86 tumores de expressão de genes de 43 AA e 43 pacientes EA. Foram identificadas diferenças significativas na expressão de genes relacionados com a resposta imune e a inflamação no interior do tumor micro-ambiente entre estes dois grupos. Esta interpretação foi apoiada por ambos associação da doença e analisa via. A maioria dos genes imuno-relacionados teve maior expressão em tumores de pacientes afro-americanos do que naqueles pacientes de Europeu-americanas. Embora preliminares, estes resultados são novos e poderia ter implicações para a terapia do cancro. A partir do presente estudo, não sei porque CRC de pacientes afro-americanos teria um perfil imunológico diferente do que tumores de pacientes Europeia-americanos. Nossa hipótese é que as causas dessas diferenças são multifatoriais. A inflamação crônica é pensado para ser um fator causal na carcinogênese colorretal [24], [25]. Foi demonstrado que uma assinatura de resposta imune no fígado de doentes com cancro e metástases prevê recorrência de carcinoma hepato-celular [26]. Assim, estudos futuros devem avaliar se o perfil imunológico da CRC em pacientes afro-americanos é um fator predisponente para a progressão de tumores e metástases. Investigações anteriores identificaram uma assinatura tumor de dois genes (CRYBB2 e PSPHL) que diferenciou com precisão entre pacientes com câncer de próstata afro-americano e europeu-americanas [27]. Esses dois genes também foram expressos diferencialmente entre os pacientes Africano-americanos e europeus americanos com cancro da mama [28] Neste estudo encontramos aumento da regulação do CRYBB2 e gene PSPH na CRC de pacientes afro-americanos. As mutações no gene CRYBB2 também são responsáveis ​​por catarata familiar [29]. PSPHL é um homólogo de PSPH. Curiosamente, PSPH está localizado no cromossoma 7p15.2, uma região cromossómica conhecido por ter ganho de função relacionada com a fase do tumor avançado em adenocarcinoma do pulmão de células não pequenas [30]. Mostrou-se que a expressão aumentada de PSPH no cancro do pulmão de células não-pequenas corresponde a resposta clínica ao tratamento com erlotinib [31]. Assim, é possível que o aumento da expressão PSPH contribui para a susceptibilidade CRC em AA e que os níveis de expressão PSPH podem ser correlacionados com a resposta ao tratamento anti-EGFR. Estas possibilidades terá que ser testada em estudos futuros. Considerando regulada genes em AAs encontramos menor expressão do gene C17orf81. A regulação desse gene foi associado com câncer de cólon [32], sugerindo que a menor expressão deste gene pode contribuir para CRC mais agressivo em AAs. Outros baixo genes regulados em AAs incluem: TRNT1 (envolvem no processamento de RNA; [33]); ARHGAP6 (promove actina remodelação: [34]); WDR8 (facilita a formação de complexos multiproteicos: [35]). Considerando as funções celulares desses genes, não é difícil imaginar como a sua expressão pode influenciar agressividade do CRC.

todo o genoma expressão genética experimentos de análise pode ser propenso a resultados que são ou única para uma população paciente selecionado ou são artificialmente criado pela tecnologia aplicada. Para excluir a possibilidade de um artefacto, duas abordagens diferentes foram usadas para atravessar validar os nossos dados de expressão de gene. Em primeiro lugar, nós comparamos nossos resultados dos genes diferencialmente expressos entre 86 tumores e 40 tecidos circundantes não tumorais com os de uma meta-análise publicada de cinco CRC conjuntos de dados de expressão de genes em Oncomine [36], [37], [38], [ ,,,0],39], [40]; Tabela S2. Encontramos um muito bom acordo entre os nossos resultados e os resultados dos outros 5 meta-análises. Dos 20 principais genes sobre-expressos em tumores CRC através das 5 outras meta-análises (Oncomine; https://www.oncomine.org), 15 também foram encontrados para ser significativamente regulada para cima (FDR, 5%) em nosso estudo. Dos 20 principais genes sub-expressos em tumores CRC através das 5 outras meta-análises, 17 foram significativamente regulada para baixo (FDR, 5%). Em nosso estudo

Em segundo lugar, validou a expressão de dez genes-chave através de qRT-PCR e confirmados diferenças na expressão genética entre CRCs de AAs e EAS de oito deles.

em conclusão, o perfil de expressão gênica CRC corresponde a diferenças na biologia do tumor entre Africano-americano e pacientes Europeia-americanos. As implicações destas diferenças em agressividade da doença e resposta ao tratamento deve ser avaliada em estudos futuros.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Ingenuity Análise Caminho de associação de genes diferencialmente expressos com os principais funções biológicas.

doi: 10.1371 /journal.pone.0030168.s001

(DOCX)

Tabela S2.

Comparação de top 40 expressa de forma diferente genes em outros cinco estudos de microarranjos CRC e este estudo.

doi: 10.1371 /journal.pone.0030168.s002

(DOCX)