Abstract

Tumor microambiente (TME) é um jogador ativo na carcinogênese e as mudanças na sua composição modificar o crescimento do câncer. fibroblastos associada a carcinoma, células estaminais mesenquimais pluripotentes derivadas da medula óssea (BMMSCs), e as células inflamatórias podem todos afectar a composição de TME levando a alterações na proliferação, invasão e formação de metástases de células de carcinoma. Neste estudo, foi confirmada uma interação entre células língua carcinoma de células escamosas (OTSCC) BMMSCs e analisando o padrão de progressão invasão e expressão do gene. Em um modelo de invasão mioma organotípicas 3-dimensional a presença de BMMSCs inibiu a proliferação mas aumentou a invasão de células OTSCC. Além disso, os sinais provenientes de células OTSCC-regulado a expressão de quimioquinas inflamatórias por BMMSCs, enquanto que os produtos BMMSC induziu a expressão de moléculas ligadas conhecidos invasão por células de carcinoma. Particularmente, após as interacções célula-célula, a quimiocina CCL5 foi abundantemente segregadas a partir BMMSCs e uma função de bloqueio de anticorpos contra CCL5 inibida BMMSC aumentada a área de invasão do cancro. No entanto, o anticorpo CCL5 bloqueio não inibiu a profundidade de invasão. Além disso, após a exposição ao BMMSCs, a expressão de ARNm de colagénio do tipo I em células OTSCC foi acentuadamente regulada para cima. Curiosamente, também alta expressão de colágeno tipo I propéptido N-terminal (PINP)

in vivo

correlacionada com a mortalidade específica do cancro dos pacientes OTSCC, ao passo que não houve associação entre os níveis de CCL5 de tecido de cancro e os parâmetros clínicos. Em conclusão, os nossos resultados sugerem que a interação entre BMMSC e células de carcinoma induzir citocinas e da matriz expressão de moléculas, dos quais alto nível de colágeno tipo I produção correlaciona-se com o prognóstico dos pacientes OTSCC.

Citation: Salo S, Bitu C, Merkku K, Nyberg P, Bello IO, Vuoristo J, et al. (2013) Osso Humano Marrow Células-Tronco Mesenquimais Induzir produção de colágeno e Tongue Cancer Invasion. PLoS ONE 8 (10): e77692. doi: 10.1371 /journal.pone.0077692

editor: Dimas Tadeu Covas, Universidade de São Paulo – USP, Brasil

Recebido: 14 de junho de 2013; Aceito: 02 de setembro de 2013; Publicação: 21 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Salo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Academia da Finlândia, o Cancer Society finlandês, o Juselius Fundação Sigrid, a Sociedade finlandesa Dental Apollonia, e as bolsas Emil Aaltonen Fundação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o microambiente tumoral (TME) sofre grandes mudanças durante o crescimento do tumor [1] e a progressão de um tumor é dependente de elementos estromais [2]. As células do microambiente, incluindo fibroblastos associada a carcinoma (FAC), células estromais de osso derivadas de medula multipotentes mesenquimais (BMMSCs), associados a tumores macrófagos (TAMs) e outras células inflamatórias, bem como células vasculares contribuem em graus variados para as características de cancro e cancro do ecossistema [3] [4]. Eles produzem matriz extracelular, factores de crescimento, citoquinas, proteases e os seus reguladores, e, assim, proporcionar um microambiente apoiar a proliferação de células de cancro e imortalidade, indução de angiogénese, reprogramando o metabolismo da energia, evitando a destruição imunitária, e favorecendo a invasão e metástase [5], [1 , 3,6], [4].

Em câncer de língua os componentes do TME têm um papel fundamental nos processos de invasão e metástase, com um impacto direto sobre os resultados clínicos dos pacientes [7]. Nós mostramos que a alta frequência de FAC está associada com mau prognóstico em pacientes com câncer de língua móveis [8], [9]. FAC também foram exibidas para localizar no local do nó de linfa metastático semelhante para tumores primários de língua correspondentes sugerindo facilitação da metástase [10]. Nosso estudo recente perfilado o cross-talk molecular entre as células de câncer bucal e TME e apresentado que o exame de componentes pró-tumorigênicos conhecidas do infiltrado inflamatório, tais como células T reguladoras, TAM2 (ie TAM subtipo apoiar invasão e metástase) células, e T-células reguladoras indução de células imunitárias, revelou impacto negativo para doentes semelhantes a FAC [11].

BMMSCs foram mostrados para incorporar num tecido danificado ou inflamada bem como a casa em tumores e o local de metástases, onde eles se integram no TEM e fornecer uma fonte de células, tais como FAC [12], [ ,,,0],13], [14], [15] ,, [2]. As citoquinas e factores de crescimento segregados por células de tumor em conjunto com factores endócrinos dos tecidos circundantes inflamatórias tumores atrair BMMSCs para estroma tumoral [16]. BMMSCs foram mostrados para promover a invasão e metástases, em vários cancros, tais como cancro da mama, do cólon e cancros linfáticos [17], [18], [19]. No entanto, o impacto eo papel da BMMSCs em TEM e os mecanismos de seus efeitos potenciais sobre diferentes tumores ainda permanecem controversos [20], [21].

Além de vários tipos de células, as proteínas da matriz extracelular (ECM) em TME também pode atuar como fatores cruciais em sistemas informativos dinâmica influenciam resultado câncer [22]. A proteína mais abundante em TME é colagénio do tipo I, que conduz ao crescimento do tumor, invasão e alastramento de cancro. Particularmente, a liberação do propeptídeo aminoterminal do procolagénio tipo I (PINP) indica que a resposta fibro-proliferativa induzida por tumor [22-24].

O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da BMMSCs e células de carcinoma interações sobre a expressão OTSCC gene, invasão e evolução clínica dos pacientes OTSCC. Aqui demonstramos que induziu BMMSCs invasão de células de carcinoma OTSCC

in vitro

parcialmente através de sinalização CCL5 quimiocinas desde a sua inibição reduziu a área da invasão. Em células OTSCC a expressão de colágeno tipo I mRNA foi regulada por sinais derivados de BMSCC, e o nível de expressão elevado do tipo imunorreativo I pró-colágeno correlacionada com a mortalidade específica por cancro dos pacientes OTSCC.

Materiais e Métodos

cultura celular

língua humana células carcinoma de células escamosas HSC-3 (JCRB 0623; Osaka Instituto Nacional de Ciências da Saúde, Osaka, Japão), SAS ( . JCRB 0260; Osaka Instituto Nacional de Ciências da Saúde, Osaka, Japão) e queratinócitos orais displásicas humanos DOK (European Collection of Cell Cultures 94.122.104, Salisbury, Wilts, UK) foram cultivadas em 1: 1 DMEM /F-12 (Invitrogen) suplementado com 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, ácido ascórbico /ml 50 ug, 250 ng fungizona mL /, 5 ug /ml de insulina (de pâncreas de bovino), 0,4 ug /ml de hidrocortisona (todos de Sigma-Aldrich), e -soro inactivado pelo calor 10% fetal de bovino (FBS). Para zimografia, soro fetal de bovino foi substituído por 0,5% de lactalbumina (Sigma-Aldrich). BMMSCs derivadas da medula óssea humana foram originalmente obtidas a partir de pacientes operados por fratura de quadril ou osteoartrite. A comissão de ética do Hospital Universitário de Oulu aprovou o protocolo do estudo (Demonstrações 4 /2000,58 /2009 e 21/2011; Research Diário 180/2001 e 12/2004) e os pacientes tinham dado o seu consentimento informado por escrito para participação no estudo . Os BMMSCs utilizadas neste estudo foram recolhidas e cultivadas conforme descrito anteriormente [25] [26]. Todas as experiências foram realizadas com células com números de passagem baixa 3 – 4. fibroblastos gengivais humanos (GF) utilizadas neste estudo foram obtidas a partir de biópsias de gengiva saudável como descrito anteriormente [27]. fibroblastos associada a carcinoma (CaDEC12) [11] derivadas a partir de um espécime de SCC língua, bem como fibroblastos normais orais (NoFS) [28] foram cultivadas no mesmo meio como FG [27]. Todas as células foram cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 a 37 ° C. Em BMMSC GF ou co-culturas com HSC-3, foi utilizado células SAS ou DOK BMMSC ou meios de cultura GF.

invasão Organotípicas ensaio

O ensaio de invasão organot�ica ea quantificação de invasão foram realizados como descrito anteriormente [29]. Em ensaios de monoculturas de 2,0 x 10

5-4 x 10

5 HSC-3 ou SAS células ou 2 x 10

5 DOK células foram cultivadas na parte superior do disco mioma durante 10 – 14 dias. Em co-cultura Ensaios de 0,5-1,5 x 10

5 BMMSCs foram adicionados juntamente com as células cancerosas na parte superior dos discos de mioma (OTSCC: rácio BMMSC variou entre 2: 1 e 5: 1). Os cortes histológicos de discos mioma foram coradas com anticorpo monoclonal pancitoqueratina (Dako, clone AE1 /AE3). A área média de invasão ou profundidade de quaisquer outras células de controlo cultivadas em monocultura HSC-3, SAS, DOK ou foi definido como 100%. Para a inibição da invasão, 50 ug /ml de anticorpo monoclonal contra CCL5 humana (R D Systems, MAB678), CXCL1 (R D Systems, MAB275) ou isotipo IgG de ratinho normal (Jackson Laboratories) foram adicionados ao meio de cultura celular .

Ensaios de proliferação

A quantificação da proliferação no ensaio de invasão organot�ica foi realizada a partir de discos mioma triplicados por linha de células utilizadas. As secções histológicas cortados a partir dos discos que representam partes internas do disco foram imunocoradas com anticorpo policlonal contra Ki67 (Abcam, # 15580). taxa de proliferação celular foi determinada como a percentagem de células que expressam Ki67 entre todas as células por campo microscópico na camada de células no topo do disco de mioma. As células cancerosas foram inicialmente marcado com uma solução de rastreamento de celular Vybrant® CM-Dil (Life Technologies) para a discriminação de células cancerosas de BMMSCs. No total, quatro campos microscópicos foram contadas por seção (12 campos por amostra). Para o ensaio de proliferação de cultura de células de 2 x 10

4 HSC-3 células foram cultivadas como uma monocultura ou como uma co-cultura de 1 x 10

4 BMMSCs ou FG em quatro lâminas de câmaras (Lab-Tek) por teste durante 24 h. As lâminas foram coradas com anticorpo policlonal contra anticorpo secundário Ki67 e Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes) e contrastadas com DAPI. 10 campos microscópicos por lâmina câmara foram examinadas e a taxa de proliferação de células foi determinada como uma percentagem de células que expressam Ki67 entre todas as células por campo microscópico.

ensaio de zero

Um total de 1 x 10

5 HSC-3 células e 1 x 10

5 BMMSCs ou GFs foram co-cultivadas em 10% FCS meios de cultura completos em placas de 24 poços (Costar) em poços em triplicado até confluência após o qual uma ferida foi feita por meio de uma ponta de pipeta. As cavidades foram lavadas com meio de cultura de célula e as áreas feridas foram fotografadas imediatamente após o ferimento (0 h) e novamente no final do estudo (20 h) quando as células foram coradas com violeta de cristal. O tamanho da área da ferida e o encerramento da ferida foram analisados ​​com ImageJ (versão 1.45s, https://imagej.nih.gov/ij/). A área da ferida foi completamente curada definido para um valor de 100.

zimografia

zimografia realizados como previamente descrito [29] foi usada para detectar a expressão de metaloproteinases 2 e 9 (MMP-2 e – 9) em HSC-3, SAS e DOK meios de cultura de células após o /n de incubação com 100 ng /ml de CCL5 recombinante (rCCL5) (R D Systems, Nº 278-RN).

Microarray

HSC-3 células foram cultivadas como uma monocultura ou numa co-cultura com células BMMSC (proporção de células 1: 1) em placas de 6 poços em duas experiências separadas para 24 h . Próxima células HSC-3 foram classificados de co-culturas com FACS (FACScan, Becton Dickinson). O ARN foi extraído e purificado a partir das células com o kit RNeasy da Qiagen de acordo com as instruções do fabricante e misturadas para microarray.

Noutro conjunto de ensaio de co-cultura, 80% de culturas confluentes HSC-3 foram cultivadas em meios HSC-3 com 2% de FBS durante 24 h. Os meios foram recolhidos, centrifugados, transferidas para culturas BMMSC e incubou-se durante 24 h, após as quais foram recolhidas as células. O ARN foi extraído como descrito acima a partir de três conjuntos separados de co-cultura.

Affymetrix GeneChip Arrays humanos foram utilizados para análise Microarray. procedimentos experimentais para GeneChip foram realizados de acordo com a Affymetrix GeneChip Expression manual de análise técnica. Os dados de expressão foi analisada utilizando o Sistema de Affymetrix GeneChip Operating (Affymetrix) e software dChip [30]. Os dados da matriz também foram depositados na GEO (número de acesso GSE44458).

A determinação dos níveis de quimiocinas

Para a medição de expressão CCL5 2 x 10

4 HSC-3, SAS e DOK células foram cultivadas como uma monocultura ou em co-cultura com 2 x 10

4 BMMSCs ou FG (razão de célula de 1: 1 a 2: 1) em placas de 24 poços (Costar). meios de cultura celular foi recolhido 40 h após o plaqueamento das células e filtrou-se. A expressão de quimiocina CCL5 foi determinada a partir de meios de cultura celular por Quantikine CCL5 /RANTES Immunoassay (R D Systems).

As amostras dos pacientes e os dados clínico-patológico

amostras de arquivo de 105 OTSCC e dez metástases linfáticas (pN1) de pacientes, tratados cirurgicamente no Hospital Universitário de Oulu entre os anos de 1981-2009, foram recuperados a partir do Hospital Universitário de Oulu, Departamento de Patologia, Oulu, na Finlândia. Mais nove pacientes assinaram como linfonodos livres de tumor (pN0) foram recuperados do Chaim Sheba Medical Center, Tel Hashomer, Ramat Gan, Israel. A idade média dos 114 pacientes foi de 64 anos (variação 27-87). O tempo médio de acompanhamento foi de 101 meses (intervalo de 18-298 meses) em pacientes sobreviventes (n = 53). A mediana do tempo de seguimento para os pacientes do estudo foi de 47 meses (intervalo de 1-298 meses). dados de sobrevida do paciente foi adquirido da Estatística Finlândia e outros dados relevantes de registros de pacientes (Tabela 1). Não foi possível recuperar dados de tratamento de três dos pacientes e dados de sobrevivência de dois dos pacientes. A recuperação dos dados paciente foi aprovado pelos Comitês de Ética e Autoridade Nacional Finlandesa de Supervisão local para Bem-estar e saúde.

N

%

idade de diagnóstico 55 yrs4035.155-70 yrs3026.3 70 yrs4438.6SexMale5649.1Female5850.9Tumour grade14035.126254.431210.5Tumour stage1-26355.33-45144.7Neck linfa nodesNegative7969.3Positive3530.7Neck dissectionNo1614.0Yes9886.0Adjuvant therapyNo6859.6Radiotherapy3429.8Radio- e chemotherapy97.9Missing data32.6Total114Table 1. Os dados clínicos do paciente.

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imunohistoquímica

a imunocoloração foi realizada em todas as nossas amostras OTSCC, que foram selecionados anteriormente para ser representativa da massa tumoral em espécimes ressecados. Depois de um método de recuperação de antigénio de alta temperatura com tampão de citrato para CCL5 (alvo real Retrieval Solution a pH 6; Dako, Glostrup, Dinamarca) ou de Tris /EDTA durante PINP (10 mmol /L de Tris, 1 mmol /L de EDTA, pH 9), secções foram bloqueadas por incubação com soro normal de cabra durante 30 min. As lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo policlonal de cabra anti-humano CCL5 (# AF-278-NA, R D Systems) a uma diluição de 1: 100. Para o anticorpo policlonal de coelho anti-humano PINP [31] as lâminas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente com o anticorpo primário PINP a uma diluição de 1: 5000. As amostras foram incubadas com anticorpos secundários específicos para cada espécie. Para a detecção foi utilizado kit Dako EnVision (Dako) com diaminobenzidina (Dako DAB-kit básico) como cromógeno. A contracoloração foi realizada na Dako Autostainer (Dako, Copenhaga, Dinamarca). Em controlos negativos IgG de cada respectivo espécie foi usado em vez do anticorpo primário.

avaliação imuno-histoquímica de PINP e expressão CCL5

A expressão de PINP e CCL5 foi avaliada por imunohistoquímica. As amostras foram analisadas por três pesquisadores independentes (K. M., J.H.K., e T. S. ou S. S., J.H.K. e T.S .; linfonodos livre de doença metastática foram examinadas por D. D. e M. V.). foram escolhidos diferentes padrões de classificação de expressão. Em primeiras amostras foram classificadas com base na diferença de coloração total entre as áreas superficiais e invasivos de os tumores foram classificados (coloração parece mais intensiva em áreas superficiais do tumor ou a coloração parece mais intensiva em áreas invasivas do tumor). A percentagem de células positivas nas células estromais de tumor e em ambas as áreas superficiais e invasivos do tumor foi pontuada numa escala de quatro pontos (0 = 0%, 1 = 0-25% 2 = 25-50% e 3 = 50%, com o título não, baixa, moderada e alta expressão, em conformidade). Além disso, a presença de coloração PINP em vasos sanguíneos e linfáticos foi avaliada. O estroma subepitelial do epitélio morfologicamente normais também foi manchado. Nos locais de mucosa displásicas ambas as células epiteliais e as células do estroma subepiteliais foram analisados.

RNA Interferência

Três RNA CCR5 short hairpin comercial (shRNA) oligonucleotídeos (Thermo Scientific # VGH5518-98903425, # VGH5518-99159618, # VGH5518-99294601) e controle não-silenciando (Thermo Scientific # RHS4348) foram obtidos a partir de Thermo Scientific Abrir Biosystems GIPZ Lentivirus shRNAmir biblioteca (Thermo Scientific). As transduções de HSC-3 células com vectores virais e de controlo foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante, com puromicina (Sigma-Aldrich) selecção. A eficiência de knockdown por CCR5-shRNA foi determinada por análise de citometria de fluxo utilizando anticorpo monoclonal anti-CCR5 (BD Pharmingen, # 556903) e isotipo de IgG (BD Pharmingen, # 555576) como controlo. Cerca de 70% knockdown de CCR5 foi obtido em comparação com células de controlo não-silenciamento com um dos oligonucleótidos comerciais (Thermo Scientific # VGH5518-99159618).

A análise estatística

Todos os ensaios foram repetidos 2 – 4 vezes, com excepção do ensaio de invasão 3D com células SAS e DOK que foi realizada apenas uma vez com discos myoma em triplicado por mono- ou co-cultura. As diferenças na proliferação celular e a cicatrização da ferida, área de invasão e profundidade foram avaliados por meio do teste t de Student. Em todos os experimentos, um

p

-valor inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para as análises estatísticas do material paciente foi utilizado 18 software PASW Statistics (corp IBM.). A-teste do qui-quadrado foi utilizado para calcular as diferenças estatisticamente significativas entre as variáveis ​​de prognóstico e clínico-patológicos. tabelas de sobrevivência foram calculadas de acordo com o método de Kaplan-Meier, e foram comparados com o teste log-rank. análises de sobrevida e recorrência multivariadas foram realizadas com o modelo de riscos proporcionais de Cox utilizando os seguintes co-variáveis: sexo (masculino ou feminino), idade no momento do diagnóstico ( 55 anos, 55-70 anos e 70 anos), estágio do tumor (1-4) e tumor grau histológico (bem = 1, moderadamente = 2 e mal = 3 carcinomas diferenciados de acordo com a Organização Mundial da Saúde cabeça e pescoço de classificação de carcinoma (2005), juntamente com variáveis ​​padrão de expressão PINP como indicado. Cox regressão foi feito usando seleção stepwise backward de variáveis, e um

p valor

de 0,05 foi adotado como o limite para inclusão de uma co-variável.

resultados

BMMSCs induzir a invasão de células câncer de língua na in vitro organot�ica modelo

o efeito da BMMSCs na invasão celular câncer de língua foi examinado no modelo mioma organot�ica [29] que é mais fiel ao TME humana do que os modelos derivados de tecido animal anteriores. células de carcinoma de língua humana em 3D, células HSC-3, ou SAS displásico DOK foram cultivadas como uma monocultura ou em co-cultura com BMMSCs na parte superior do mioma discos. Após 10 – 14 dias área de invasão e profundidade foram quantificados através da análise de imagens tiradas a partir pancitoqueratina cortes histológicos corados a partir de discos de monoculturas ea co-cultura. Como mostrado na Figura 1, BMMSCs induziu um aumento na área de invasão, e mesmo um efeito mais clara foi visto na profundidade de invasão em HSC-3-BMMSCs co-culturas (Figura 1A-1B). Um ligeiro aumento na área de invasão foi visto também com células SAS na presença de BMMSCs, embora não seja estatisticamente significativa. No entanto, parecia haver nenhum efeito na profundidade de invasão (Figura 1C-1D). Curiosamente, BMMSCs inibiu a invasão de células displásicas DOK (Figura 1D-1E), sugerindo um efeito diferente do BMMSCs em células de carcinoma comparação com as células não-malignas.

BMMSCs osso derivadas de medula melhorar a invasão de células HSC-3 (A, B), mas não células displásicas (E, F) no modelo 3D mioma organotípicas [29]. aumento menor, embora não estatisticamente significativa, foi visto na zona de invasão de SAS (C, D). Os cortes histológicos obtidos a partir de discos mioma foram coradas com anticorpo monoclonal pancitoqueratina (Dako, clone AE1 /AE3) e fotografadas em 100 x ampliações com um microscópio DMRB foto ligado a DFC 480 câmera usando software QWin V3 (Leica Microsystems). barra de escala 100 mm.

Para estudar se o aumento da invasão do HSC-3 células foi devido ao aumento da proliferação de células, as células HSC-3 e SAS foram cultivadas no topo do disco mioma como uma monocultura ou co -Cultura com BMMSCs ou GFs. As secções histológicas obtidas a partir destes discos foram imunocoradas com o marcador de proliferação Ki67 e células positivas foram calculados como descrito em Materiais e Métodos. os níveis de proliferação celular foram notavelmente inferior em HSC-3 e co-culturas com SAS BMMSCs quando comparado com co-culturas com FG (Figura 2A-2B). Para confirmar que o efeito observado em secções histológicas veio da proliferação reduzida de células de cancro, células HSC-3 foram cultivadas como um mono- ou co-cultura em lâminas de câmara de cultura de células com BMMSCs marcadas com um corante fluorescente. Após co-cultura durante a noite, as células foram coradas para Ki67. Tal como mostrado na Figura 2C, BMMSCs inibiu a proliferação de células HSC-3 significativamente também no ensaio de co-cultura de células. A viabilidade de células HSC e manteve-se ainda muito elevado foi detectado nenhum sinal de apoptose (dados não apresentados).

Os cortes histológicos obtidos a partir de discos mioma foram coradas com anticorpo anti-Ki67 policlonal. BMMSCs inibir a proliferação de células HSC-3 e SAS no modelo de invasão organotípica (A, B), bem como em ensaios de cultura celular (C), e deslocar HSC-3, mas não displásicas células DOK no sentido de um fenótipo migratório com menos célula-célula contatos (D, setas). fibroblastos gengivais normal, FG, promover o fecho da ferida mais de BMMSCs potencialmente em parte devido ao aumento da proliferação celular de células cancerosas (E). Barra de escala 50 mm.

Como a proliferação não foi aumentado, para avaliar se o aumento da invasão foi uma consequência de uma migração de células de câncer de maior um ensaio de zero foi realizado com células HSC-3 e DOK semeado sozinho ou juntamente com BMMSCs ou GFS para placas de 24 poços. BMMSCs deslocado HSC-3 células, mas não as células displásicas DOK, para um fenótipo migratório com estruturas lamellipodia e menos contactos célula-célula (Figura 2D). No entanto, FG promovido encerramento da ferida mais rápido do que BMMSCs, que pode ser em parte devido aos efeitos do soro sobre a capacidade de proliferação de células de cancro (Figura 2D-2E)

A expressão de quimiocina CCL5 é sobre-regulada em BMMSCs depois interação com as células cancerosas

BMMSCs foram então cultivadas com meios condicionados obtidos a partir HSC-3. Embora vários genes foram supra-regulados, o maior aumento na expressão do gene em BMMSCs foi visto nos genes de quimiocina (Tabela 2). Quando a expressão de quimioquinas foi examinada a nível da proteína a expressão de CCL5 verificou-se ser principalmente um resultado da interacção entre as células HSC-3 e BMMSC em vez de a partir de co-culturas de células HSC e FG-3 (Figura 3A). Descobertas similares foram obtidos a partir de co-culturas de SAS e BMMSCs, mas não a partir de células que interagem com DOK BMMSCs (Figura 3A). Ao nível da proteína, a sobre-regulação da maioria das quimiocinas listados na Tabela 2, verificou-se originar de OTSCC linhas celulares interacções com ambos BMMSCs e FG. Algumas quimiocinas, tais como CCL2, CCL20 e CXCL8, foram também regulado para cima como um resultado das interacções entre as células e BMMSCs DOK, como estudado em imunoensaios (dados não mostrados).

Gene

símbolo

Fold Mudança

quimiocinas (CC motif) ligando 2CCL2830.66chemokine (CC motif) ligando 5CCL5194.90chemokine (CC motif) ligando 20CCL20182.23chemokine (CXC motif) ligando 1CXCL1134.91chemokine (CXC motif) ligando 2CXCL280.98chemokine (CXC motif) ligando 3CXCL380 .14chemokine (CXC motif) ligando 5CXCL573.90chemokine (CXC motif) ligando 8 (interleucina 8) CXCL8 (IL8) 18.06chemokine (CC motif) ligando 13CXCL1316.86Table 2. Up-regulada genes de quimiocinas em BMMSCs depois de expor a HSC-3 condicionado meios de cultura de células (variação dobra 2).

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Co-cultura de células com OTSCC BMMSCs resulta na expressão elevada de CCL5 quimiocina em células HSC-3 e SAS, mas não em células displásicas DOK (UMA). Função de bloqueio de anticorpo monoclonal contra CCL5 (Mab CCL5) inibe ligeiramente BMMSC área invasão aumentada, mas não tem efeito sobre a profundidade de invasão, ao passo que o anticorpo contra CXCL1 não aumenta o efeito inibidor na OTSCC invasão (B, C).

Função de bloqueio de anticorpos contra CCL5 inibe BMMSC aumento da área invasão

a seguir, explorou a importância de CCL5 na propagação do câncer de língua, uma vez que CCL5 foi mostrado para promover a mobilidade das células de câncer bucal [32]. CCL5 também foi demonstrado ser importante na progressão do tumor de vários tipos de cancro, tais como cancro da mama e carcinoma colorrectal [17,33]. Portanto, testou-se o efeito do anticorpo bloqueador de função CCL5 em OTSCC e BMMSC co-culturas no modelo de invasão 3D. Também testamos o efeito potencial da função de bloqueio de anticorpos contra CXCL1 na invasão, uma vez que CXCL1 também foi expressa a partir BMMSC-HSC-3 interacção e foi anteriormente demonstrado estar presente em tumores de mama, pulmão, colorretal e próstata quer apoiar ou suprimindo a progressão do tumor [34-36]. No cancro oral, CXCL1 foi sugerido ter um papel na progressão do tumor uma vez que em amostras de doentes tem sido demonstrado a expressão de CXCL1 ser associada à infiltração de leucócitos, metástase de nódulo linfático, e a angiogénese [37]. Como mostrado na Figura 3, a função de bloqueio de CCL5 anticorpo monoclonal era capaz de atenuar significativamente a área de invasão celular BMMSC-promovido HSC-3, mas não teve nenhum efeito sobre a profundidade invasão (Figura 3B-3C). CXCL1 não tem um efeito sobre a invasão, uma vez que não aumentou o efeito inibidor da CCL5 no modelo de invasão 3D (Figura 3B-3C).

Em amostras de pacientes CCL5 se expressa principalmente por células inflamatórias e algumas células cancerosas, mas apenas FAC esparsas são CCL5 positiva

Em seguida, para avaliar a importância da expressão CCL5 em amostras de tumores de pacientes para diagnóstico de cancro da língua, secções histológicas representativas de diferentes fases de displasia epitelial e carcinomas de língua de pacientes humanos foram corados com anticorpo anti-CCL5. A expressão de CCL5 foi detectada na maior parte das células inflamatórias e, em algumas células de cancro (Figura 4A-4B), mas apenas FAC esparsos foram CCL5 positiva, como avaliado pela co-localização imuno-histoquímica de CCL5 e CAF marcador αSMA (dados não mostrados). No entanto, a expressão de CCL5 não estava associada com o resultado clínico dos pacientes OTSCC (não mostrado). A expressão de CCL5 foi ainda estudado em fibroblastos primários orais normais (NOF, [28]) e células CaDEC12 [11]. Imuno detectar CCL5 segregada no meio de cultura celular mostraram expressão CCL5 muito baixa ou nenhuma em fibroblastos normais, mas a expressão mais elevada em células CaDEC12 considerável (Figura 4C).

CCL5 é expresso principalmente pelas células inflamatórias em TME e algumas células de cancro em amostras de pacientes, como mostrado por coloração imunológica com Pab CCL5, mas apenas FAC esparsos são positivos para CCL5 (A, B). CaDEC12 células, as culturas primárias de FAC obtidos a partir de doentes com cancro da língua, expressar a quantidade relativa de CCL5 comparação com NoFS, fibroblastos normais orais (C). barra de escala 100 mm.

O papel da CCL5 eixo /CCR5 não é crítica em BMMSC aumentou invasão câncer de língua

A sinalização CCL5 nas células cancerosas foi proposto para ser mediada, principalmente, mas não é necessário exclusivamente, através do receptor CCR5 [38]. Ambas as células HSC-3 e SAS mostraram expressar este receptor (Figura 5A). Na co-cultura de aproximadamente todos CCR5 células cancerosas expressaram, no entanto, em monoculturas, aproximadamente, apenas 25% das células cancerosas foram positivos para o CCR5 sugerindo que um contacto com as células do estroma ou a indução CCL5 é necessário para a maior expressão de CCR5 (citometria de fluxo de análise, os dados não mostrados ). A associação de CCL5 e expressão de CCR5 tenha sido proposto recentemente, também por outros [39,40]. À medida que o eixo CCL5-CCR5 foi mostrado para promover a motilidade das células de cancro oral humano

in vitro

[32] e para induzir a expressão de MMP9 [32], que também examinou o efeito da expressão de MMP9 em rCCL5 níveis em HSC-3 e SAS, bem como em células displásicas DOK. Da mesma forma para a observação anterior por Chung e colaboradores [32] rCCL5 aumentou claramente a expressão de MMP9 em células HSC-3 e células de SAS, mas não em células displásicas DOK (Figura 5B). No entanto, não induziram rCCL5 transição epitelial-mesenquimal (EMT), tal como analisada por Western blotting com anticorpo anti-vimentina, ou proliferação de células de cancro (dados não mostrados).

O receptor CCR5 CCL5 é expresso em HSC-3 e células de SAS, mas não em BMMSCs (A). rCCL5 pode induzir a expressão de MMP9 em HSC-3 e SAS, mas não em células DOK (B). O silenciamento da expressão do receptor CCR5 em células HSC-3 regula negativamente a expressão de genes cerca de 70% em comparação com células de controlo e bloqueia a sinalização do aumento da expressão de MMP9 em células de cancro (C, D). CCR5 knockdown têm menor ou nenhum efeito sobre BMMSC reforçada invasão de células HSC-3 no modelo organotípico 3D (E, F).

Para explorar a importância do eixo CCL5 /CCR5 na propagação do câncer de língua, foi realizado um estudo invasão 3D com SAS e HSC-3 OTSCC células com expressão de CCR5 reduzida e com anticorpo de bloqueio de função contra CCL5. Em primeiro lugar, que inibiram a expressão de CCR5, por transdução de células HSC-3 com CCR5-shRNA e produzida uma linha celular estável com ~ 70% de inibição da expressão de CCR5 e reduzida resposta à indução rCCL5 (Figura 5C, 5D). No ensaio de invasão de co-cultura das células CCR5 3D knockdown igualmente invadido ou do que o de tipo selvagem ou controlar HSC-3 células transduzidas com não-silenciamento shRNA (Figura 5E, 5F). Resultados semelhantes também foram obtidos com um anticorpo monoclonal contra o CCR5 (dados não mostrados).

Expressão de componentes de colágeno e plasticidade epiteliais são induzidos em células cancerosas após a interação BMMSC

Os mecanismos potenciais da invasão efeito promotor de BMMSCs sobre as células cancerosas foram ainda estudadas por análise de microarray. células HSC-3 foram utilizadas para as experiências, uma vez que respondeu de forma mais clara a BMMSCs do que as células SAS, especialmente no modelo de invasão 3D. HSC-3 células foram cultivadas como uma monocultura ou co-cultura com células BMMSC em placas de 6 poços, durante 24 h, após o que as células HSC-3 foram classificadas a partir de co-culturas com FACS (não mostrado) e o RNA foi extraído para análise de microarray .