Humana

Abstract

Fundo

solúvel guanilato ciclase (GCs) desempenha um papel central na óxido (nO) de transdução de sinal mediada por nítrico nos sistemas cardiovascular, do sistema nervoso e gastrointestinais. splicing alternativo do ARN tem emergido como um mecanismo potencial para modular a expressão e actividade de sGC. C-α1 GCs é uma forma alternativa de união que é resistente à degradação de proteínas induzida por oxidação e demonstra distribuição subcelular preferencial para o ambiente oxidada do retículo endoplasmático (ER).

Metodologia /principais conclusões

aqui mostramos que o splicing de C-α1 GCs pode ser modulada por H

2O

2 no tratamento BE2 neuroblastoma e as células humanas de adenocarcinoma de MDA-MD-468. Além disso, mostramos que a H

2O

2 tratamento de células MDA-MD-468 diminui seletivamente níveis de proteína de PTBP1 e fatores /B1 emenda RNPhn A2 identificados como reguladores de splicing potencial de genes α1 pela

in silico

análise. Demonstramos ainda que a regulação negativa da PTBP1 por H

2O

2 ocorre no nível de proteína com regulação variável observada em células de cancro da mama diferentes.

Conclusões /Significado

A nossa dados demonstram que a H

2O

2 regula RNA splicing para induzir a expressão da subunidade GCs resistente à oxidação C-α1. Nós também relatam que H

2 Tratamento

2O altera seletivamente a expressão de reguladores chaves splicing. Este processo pode desempenhar um papel importante na regulação da adaptação celular a condições de estresse oxidativo

Citation:. Cote GJ, Zhu W, Thomas A, Martin E, Murad F, Sharina IG (2012) Peróxido de Hidrogênio Altera emenda de solúvel guanilato ciclase e seletivamente Modula Expressão dos Reguladores da emenda em células cancerosas humanas. PLoS ONE 7 (7): e41099. doi: 10.1371 /journal.pone.0041099

editor: Marcelo G. Bonini, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de novembro de 2011; Aceito: 21 de junho de 2012; Publicação: 20 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Cote et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede RO1 HL088128 e 3R01HL088128 e AHA Sul Central da filial Grant-in-Aid 09GRNT2060182 a eM e fundos start-up departamentais para IS Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o splicing alternativo expande diversidade transcriptoma [1], [2] e permite que as células para atender aos requisitos de um ambiente extracelular em constante mudança. factores de stress comuns, tais como choque térmico, inanição de aminoácidos ou toxicidade de etanol foram demonstradas para regular splicing alternativo [3], [4]. O stress oxidativo, muitas vezes persistir no microambiente celular quando há um desequilíbrio na produção e a eliminação de espécies de oxigénio reactivas (ROS). Este desequilíbrio é associado com uma variedade de condições patológicas, incluindo a carcinogénese, distúrbios cardiovasculares e neurodegeneração [5], [6], [7], [8], [9]. Evidências recentes indicam que o splicing alternativo pode ser influenciada por alterações no equilíbrio oxidativo. condições de hipoxia e hipoxia /reoxigenação, que alteram ROS homeostase, têm sido demonstrados para modificar o splicing de um número de genes em tecidos normais e de linhas celulares de cancro [10], [11], [12], [13], [14]. Além disso, os dados indicam que emergentes ROS também pode alterar a abundância de factores de splicing ou de modificar a sua actividade. As baixas concentrações de peróxido de hidrogénio (H

2O

2), uma molécula ubíqua ROS, têm sido demonstrados para induzir fosforilação do factor de splicing hnRNP C levando a modulação da sua afinidade de ligação a ARN [15]. Aumento da expressão RNPhn-C também é encontrada em hiperplasia da íntima e aterosclerose, que se propõe a ser associada a aumentos em H

2O

2 níveis produzidos pelo endotélio vascular activado [16].

ciclase solúvel ciclase (GCs) é uma enzima-chave do óxido nítrico (nO) e via de sinalização desempenha um papel importante na cardiovascular, neuronal e funções gastrointestinais [17]. GCs proteína activa é um heterodímero ferroso contendo heme composto por subunidades a e p, o qual é activado em resposta à ligação de NO ao heme sua porção. oxidação do heme é proposto para ser um dos mecanismos responsáveis ​​pela atenuação de NO /cGMP sinalização em condições de stress oxidativo [18]. O inibidor específico da GCs 1H- [1], [2], [4] oxadiazolo [4,3, -a] quinoxalin-1-ona (ODQ) oxida GCs heme ferroso para férrico a forma de suprimir a ligação de NO. A exposição de células e tecidos para ODQ desencadeia a degradação GCs devido à desestabilização de sGC heterodímero através de ubiquitinação e degradação proteossómica alvo [18]. Temos anteriormente identificada uma nova isoforma de splicing alternativo de sGC, C-α1, o qual é completamente funcional, apesar de uma extensa deleção no terminal N [19]. Surpreendentemente, a forma de splicing C-α1 foi significativamente mais resistentes à degradação de proteínas induzida pelo tratamento com ODQ [19] e tinha uma localização celular diferente na diferenciação de células estaminais do que o α1 canónica GCs [20]. Estudos recentes realizados por Kraehling et al. revelaram que, ao contrário do α1 canónica GCs isoforma, a isoforma C-α1 tende a localizar com o ambiente mais oxidada do retículo endoplasmático (ER) no interior da célula [21]. Estas observações levaram-nos a propor que a expressão da isoforma de proteína alternativa C-α1 pode ser induzida por estresse oxidativo, como parte do mecanismo de adaptação para preservar a atividade GCs em condições oxidativas.

No presente estudo, nós examinamos Se o splicing do gene GCs α1 pode ser modulada por ROS, especificamente, por tratamento com H

2O

2. Descobrimos que H

2O

2 induz a expressão de C-α1 transcrição e proteína C-α1 em células de cancro humano que expressam α1 /β1 GCs. Num esforço para obter informações sobre o mecanismo regulador, foram examinados os níveis de várias proteínas de ligação a ARN potencialmente envolvidos no splicing da variante de splicing C-α1 expressão. Nossos estudos mostram que H

2 Tratamento

2O diminui seletivamente a expressão de α1 putativo GCs reguladores de splicing PTBP1 e RNPhn A2 /B1. Além disso, demonstra-se que a degradação H

2O

2-induzida de PTBP1 difere em várias linhas celulares de cancro da mama. Para o nosso conhecimento, este é um primeiro relatório demonstrando que H

2O

2 induzida por estresse oxidativo afeta splicing alternativo de GCs e modula seletivamente nível de proteína dos principais factores de splicing.

Resultados

H

2O

2 induz a expressão de C-α1 GCs variante de processamento

para investigar se splicing alternativo de GUCY1A3 (α1 gene da subunidade GCs) é regulada em resposta ao estresse oxidativo, nós tratados humana MDA468 carcinoma da mama e neuroblastoma humano linhas celulares BE2 com mM H 1

2O

2. células MDA468 e BE2 expressam endogenamente α1 e β1 GCs. O H

2O

2 concentração foi escolhido com base em observações anteriores demonstram que a interacção com as proteínas do soro em meio de cultura celular, a absorção pelas membranas celulares e de neutralização por componentes enzimáticos de defesa anti-oxidativo celular consomem uma parte significativa de adicionado exogenamente H

2O

2 [22], [23]. células MDA468 e BE2 demonstraram um aumento significativo em C-α1 GCs expressão transcrição alternativa mediante H

2O

2 do tratamento (Fig. 1 A, B). O aumento relativo da isoforma C-α1 em comparação com a transcrição α1 foi maior em células BE2, consistente com os nossos estudos anteriores [19]. Os resultados indicaram que GUCY1A3 splicing é alterada para permitir o reconhecimento do sítio 3 ‘de união específica C-α1 dentro do exão 4 em resposta a H

2O

2 exposição. Embora em algumas experiências a nível de C-α1 foi aumentaram ODQ, nem linha de células demonstraram alterações estatisticamente significativas no nível de transcrição C-α1 sugerindo que o tratamento ODQ por si só não é suficiente para afectar a regulação splicing

:. RT- detecção por PCR de α1 (topo) e C-α1 (banda inferior) transcrições sGC após o tratamento com H

2O

2 (1 mM) ou ODQ (20 pM), conforme indicado. Os produtos de RT-PCR são separados em gel de agarose a 3% e coradas com brometo de etídio. banda superior representa a mensagem que codifica a proteína canónica α1 (Transcrições 1-4, 270 pb); faixa do meio é um produto não-específicas; banda inferior indica a transcrição GCs C-α1 (Transcrição 5, 94 pb). triplicados biológicos representativos de três experiências independentes são apresentados. B: Rácio de (média ± DP) da abundância relativa de C-a1 a1 e transcritos quantificados por densitometria. * P 0,05 pelo teste t de Student. C: detecção por transferência de Western de α1 (topo) e de proteínas C-α1 (parte inferior). células MDA468 foram tratados com 1 mM de H

2O

2 tal como indicado na presença ou ausência de MG132 (10 uM). borrões apresentados são representativos de quatro experiências independentes, com resultados semelhantes. D: Relação entre a abundância relativa das proteínas C-a1 e a1 quantificados por densitometria. Os dados são apresentados como média ± SD de quatro experiências independentes.

Em seguida, foi avaliado o tempo de curso das mudanças na abundância de α1 e proteínas sGC C-a1 em resposta a H

2O

2. Coincidente com aumentos de GUCY1A3 splicing observou-se uma modulação dependente do tempo de α1 e os níveis de proteína C-a1 sGC. Como mostrado na Fig. 1C e D, H

2O

2 incrementa o teor relativo de proteína C-α1 em MDA468 células. Para avaliar a contribuição de degradação dependente de proteassoma na regulação das formas de emenda sGC a1, foi realizado o experimento na presença de MG132, um inibidor do proteassoma de células-permeável potente. Verificou-se que o pré-tratamento com MG132 não afectou a taxa de acumulação de variante de splicing C-α1, ou a nível da subunidade GCs α1 canónica. Estes dados sugerem que o aumento observado em C-α1 abundância de proteínas (Fig. 1D) é provavelmente devido a uma expressão C-α1 aumentada, e não a uma degradação selectiva de α1 canónica GCs. Digno de nota é que o tratamento MG132 também níveis elevados de um polipéptido desconhecido reconhecido por anticorpos anti-a1 com peso molecular mais baixo do que o C-α1 sGC (Fig. 1D). À medida que a identidade desta proteína permanece a ser determinada, a sua intensidade não foi incluído na análise de densitometria.

Juntos os nossos resultados sugerem que H

2O

2 induz splicing preferencial e expressão de C-α1 forma de emenda GCs em nossos modelos celulares.

In silico

análise identifica potencial a1 sGC (GUCY1A3) reguladores de splicing

Para obter a percepção inicial em potenciais mecanismos de α1 splicing GCs regulação, realizamos

in silico

análise utilizando várias ferramentas de bioinformática [24]. A variante de processamento C-α1 é gerado através da utilização de uma alternativa de 3 ‘local de junção 179 pares de bases a jusante do local constitutiva (Fig. 2A, Fig. S1). locais de splicing constitutivos e alternativas para o exão 4 de GCs α1 foram definidos com a ferramenta UCSC Genome Bioinformática e seu valor relativo consenso examinado usando Humano emenda do Finder [25], [26]. O splicing alternativo do exon 4 desempenha um papel central na GUCY1A3 diversidade transcrição; em adição ao local constitutiva, o exão 2 contém locais dadores e 2 alternativos locais aceitadores alternativo (ver Fig. 2A e Fig. S1). Com a excepção do constitutiva 5 ‘dador de local de splicing, a força relativa de consenso de todos os sítios provou ser baixo (Fig. S1). Esta é uma característica comum de exons em alternativa processados ​​que é pensado para facilitar a regulação por parte da serina-arginina rica (SR) e as proteínas ribonucleoprote�a nuclear heterogênea (RNPhn) [2]. A, splicing alternativo /ferramenta ASD emenda do arco-íris da European Molecular Biology Laboratory [27], foi usado para analisar o exão relevante e sequências de intrão proximais para os potenciais reguladores SR e RNPhn de exão 4 splicing. Geramos uma visão composta de locais de ligação do regulador utilizando os valores obtidos para as proteínas SR e RNPhn individuais (Tabela S1). Esta análise identificou uma distribuição relativamente uniforme dos sítios de ligação SR todo exão 4 e as regiões flanqueadoras. Ao mesmo tempo, a região constitutiva 3 ‘local de splicing do intrão mostrou um pico densa de locais de ligação hnRNP (Fig. 2a). Um exame mais detalhado identificados nesta sequência vários sobreposição de locais de ligação para RNPhn 2A /B1, proteína polipirimidina vinculativo de trato 1 (RNPhn I, PTBP1), SRp20, SRp40 e Hu antígeno R (Hur, ELAVL1) reguladores de splicing (Fig. S1) . A localização destes locais sugeriu que correspondentes factores de splicing são susceptíveis de afectar o uso de ambos os locais de splicing canônicas e alternativas, promovendo a geração dos GCs transcrição C-α1

A:. Representação esquemática do GUCY1A3 splicing alternativo para gerar C-α1. A distribuição relativa dos locais de ligação e SR hnRNP prevista é mostrada. B: análise de Western de PTBP1, hnRNP2A /1B, Hur e SR expressão de proteínas no controle e H

2O

2-tratada (1 mM, 24 horas) MDA468 células. C: H

2O

2 avaliação dose-dependente da PTBP1 e os níveis de proteína /B1 RNPhn A2 em MDA468 células. Western blots apresentados são representativos de pelo menos três experiências independentes, com resultados semelhantes. D, F: análise de densitometria dos níveis de proteína /B1 PTBP1 e PRNhn A2 normalizada em β-actina. Os dados são apresentados como média ± SD de três experiências independentes.

H

2O

2 altera seletivamente a expressão de fatores de splicing

Está bem estabelecido que a expressão os níveis e a estequiometria relativa dos factores de splicing modular splicing alternativo [28]. Por isso, investigamos o efeito do H

2O

2 exposição nos níveis de proteína dos factores de splicing identificados pelo nosso

in silico

análise como potenciais reguladores sGC. Como mostrado na Fig. 2B, a exposição de células MDA468 a H

2O

2 diminuiu selectivamente o nível de proteína de PTBP1 e PRNhn A2 repressores /B1 splicing. H

2O

2 não afetou o nível de regulador Hur e níveis ligeiramente alterados de proteína SRp40 da família SR de promotores de splicing. Ambos PTBP1 e PRNhn A2 /B1 proteínas são diminuídos de uma forma dependente da dose em células MDA468 (Fig. 2 C, D e F). Nossos dados indicam que a observada H

2O interruptor

2-dependente no splicing do gene GUCY1A3 coincide com as mudanças no nível de factores de splicing reguladoras. No entanto, o mecanismo exato e a contribuição dos fatores de emendas específicas na regulação dos GCs splicing continua a ser determinado.

Insights sobre o mecanismo do H

2O

2 induzida pela degradação de proteínas PTBP1

Em seguida, explorou possíveis mecanismos de regulação RNPhn por H

2O

2. Escolhemos para focar PTBP1 uma vez que esta proteína de ligação a ARN extensivamente estudada desempenha um papel importante em vários passos do processamento de mRNA celular, incluindo splicing, a regulação da estabilidade, localização e tradução [29]. Além disso, PTBP1 tem sido demonstrada ser essencial na regulação do crescimento celular e do cancro células sobrevivência [30], [31], [32]. A capacidade de H

2O

2 para reduzir os níveis de PTBP1 sugerido que, adicionalmente, pode jogar um papel na regulação de adaptação celular a condições oxidantes. No entanto, o efeito de níveis elevados de ROS na expressão PTBP1 nunca foi examinada anteriormente.

Em primeiro lugar temos investigado se H

2O

2 Altera mRNA PTBP1 níveis de estado estacionário. análise de RT-qPCR realizada com amostras de RNA isoladas a partir de MDA468 células tratadas com diferentes H

2O

2 concentrações encontrada nenhuma alteração nos níveis de ARNm PTBP1 (Fig. 3C), indicando que PTBP1 é susceptível de ser controlada ao nível da proteína. Para examinar o papel da degradação proteossómica, que monitorizada a dinâmica das alterações na proteína PTBP1 em resposta a H

2O

2 de tratamento ao longo de um período de 16 horas na presença ou ausência de inibidor de proteassoma MG132. Descobrimos que a proteína PTBP1 foi reduzido de uma maneira dependente do tempo a partir de 8 horas pós-exposição (Fig. 3 A, B). Curiosamente, a degradação da proteína não foi evitada, mas, em vez aumentado, por tratamento MG132. Isto foi particularmente evidente nas 16 horas posteriores e pontos de tempo (Fig. 3A e dados não mostrados). Assim, enquanto que o tratamento MG132 mostrou que o proteassoma não teve qualquer efeito directo sobre a degradação PTBP1, o facto de a sua inibição acelera a degradação implica um papel na regulação indirecta, muito provavelmente através de estabilização de uma protease ou proteína cofactor desconhecido. O pré-tratamento de células MDA468 com ciclo-heximida (CHX, o inibidor de

de novo a síntese de proteínas) também não impediu PTBP1 redução, indicando que H

2O

2 foi a indução de uma pré-existente via de degradação da proteína (Fig. 3D). Foi previamente demonstrado que a apoptose celular leva à degradação através da activação PTBP1 Capase-3 [33]. Assim, exploramos a possibilidade de que a caspase-3 pode desempenhar um papel em H

2O

2-PTBP1 induzida diminui. No entanto, descobrimos que a adição de caspase-3 inibidor IV (Ac-DMQD-CHO, Calbiochem) não impediu H

2O

2-induzida degradação PTBP1 (resultados não são apresentados), indicando que a caspase-3 não está envolvido neste processo. Para determinar se outras fontes exógenas, além de adição directa de H

2O

2 solução, pode afectar a estabilidade da PTB1, aplicou-se glucose oxidase (GO) para o meio de cultura celular. Consistente com o papel direto do H

2O

2 na indução de degradação PTBP1, a produção estável de H

2O

2 por tratamento GO reproduzido o efeito.

A : PTBP1 degradação ocorre de uma maneira dependente do tempo e não é impedida pelo inibidor de proteassoma MG132. células MDA468 foram tratados como na Fig. 1C com mM H 1

2O

2, na presença ou ausência de MG132 (10 uM). A análise por Western blot foi realizada para visualizar a expressão de PTBP1. β-actina serviu como um controlo de carregamento. duplicados biológicos para cada tratamento são mostrados; borrões são representativos de três experiências independentes com resultados semelhantes. B: análise de densitometria dos níveis de proteína normalizada em PTBP1 β-actina. Médias para duplicatas biológicos representativos de cada tratamento são mostrados. C: H

2O

2 exposição não afeta os níveis de mRNA PTBP1. células MDA468 foram tratadas com concentrações indicadas de H

2O

2 para 24 horas. A abundância relativa do ARNm de PTBP1 em amostras foi analisado por análise de RT-qPCR. ΔCt média ± SD para triplicatas biológicas são mostrados. D: degradação PTBP1 depende de oxidação tiol e não é resgatado por inibição da

de

síntese de proteínas novo. A análise de transferência de Western realizadas sobre lisados ​​celulares MDA468 tratadas durante 24 horas com inibidor de síntese de proteínas cycloxemide (2 ug /ml) e diferentes factores indutores de stress oxidativo: 1 mM BSO (GSH depleção indutor); HEDS 1 mM (tiol oxidação indutor) e 0,01 unidades /ml de glicose-oxidase (aumenta a produção de ROS). Western blot mostrados são representativos de três experiências independentes, com resultados semelhantes.

H

2O

2 induz modificações pós-traducionais de proteínas, tais como a oxidação de tióis intracelulares e ânions tiolato. Estas modificações são uma parte integrante do H

2O

2 sinalização que afecta uma variedade de processos celulares [34]. Foi previamente demonstrado que, em condições oxidantes, podem formar dímeros PTBP1 devido à formação de pontes dissulfureto intermoleculares [35]. Com efeito, nas nossas experiências é também detectado a formação de uma banda de proteína de elevado peso molecular reconhecido por anticorpos PTB1 após o tratamento de células MDA468 com H

2O

2 (resultados não são apresentados).

para avaliar a contribuição de oxidação tiol à degradação PTBP1, expusemos MDA468 células para dois diferentes compostos que alteram o metabolismo de tiol celular. O tratamento com dissulfureto de 2-hidroxietilo (HEDS), um agente que actua como oxidante específico do tiol, diminuiu significativamente os valores PTBP1 (Fig. 3D), indicando que a oxidação directa de tiol pode desempenhar um papel importante na resposta a degradação PTBP1. Para outro teste, se a degradação PTBP1 é induzida pela atividade de redução de tiol celular diminuída em resposta a H

2O

2, temos também tratados as células com L-butionina-S, R-sulfoximina (BSO). BSO é um inibidor irreversível da biossíntese da glutationa, diminuindo piscina glutationa intracelular. Não se observou degradação significativa do PTBP1 em resposta a BSO, sugerindo que uma diminuição do nível de GSH não é suficiente para induzir PTBP1 degradação (Fig. 3D). Estes resultados também pode estar relacionada com a capacidade intrínseca de células MDA468 para compensar a perda de GSH induzida pela BSO, como foi previamente relatado para linhas de células com expressão elevada de SOD [36]. Assim, a oxidação de tióis Cys por H

2O

2 poderia iniciar a formação dos dímeros PTBP1 e contribuir para a degradação da proteína subsequente.

H

2O

2 na proteína PTBP1 níveis varia em diferentes linhas celulares de cancro da mama

Para determinar a generalidade do H

2O

2 induzida pela degradação PTBP1, testamos linhas de câncer de mama adicionais, incluindo: MDA-MD-453, MDA MD-231 e MCF7. A análise Western blot de H

células

2 tratados com 2O demonstraram vários graus de redução PTBP1 em células MDA468, MCF7 e MDA231, mas nenhuma mudança na MDA453 células (Fig. 4A). A incapacidade para induzir a degradação PTBP1 em células MDA453 foi observada em H 2O

2 sub concentrações que prontamente eliciados diminuições significativas em células MDA468 (comparar a Fig. 4B a FIG. 2B e C). Estes dados sugerem que a extensão do H

degradação

2 induzida 2O de PTBP1, pensou prevalente, ainda é bastante linhagem celular específica. Para explorar se a resistência à degradação da proteína PTBP1 está associada com o aumento da capacidade das células para sobreviver o stress oxidativo, que em comparação H

2O

2-citotoxicidade induzida em células MDA468 e MDA453. células MDA468 foram menos resistentes ao H

2O citotoxicidade

2-induzida (IC

50 = 450 ± 60 pM) em comparação com MDA453 células (IC

50 = 660 ± 2 uM) (Fig. 5 ). Em uma tentativa de ligar diretamente uma redução nos níveis PTBP1 a H

citotoxicidade

2 induzida 2O realizamos mediada por siRNA knockdown PTBP1 em MDA453 células. Apesar de uma redução superior a 50% em ARNm PTBP1 (como detectado por RT-qPCR), as medições de viabilidade celular revelou apenas uma pequena diminuição insignificante na resistência à H

2O

2 do tratamento (Fig. S2). Estes dados sugerem que o nível de expressão PTBP1 por si só não é criticamente importante para suportar a resistência oxidativo em células MDA435

A:. A análise de transferência de Western expressão examinando PTBP1 em células MDA231, MDA453, MDA468 e MCF-7 tratadas com 1 mM de H

2O

2 para 18 horas. duplicatas biológicos representativos são mostrados. B: células MDA453 são resistentes a H

2O

2 induzida pela degradação PTBP1.

Painel superior

: celular MDA453 foram tratadas com diferentes concentrações de H

2O lisados ​​celulares

2 e foram submetidos à análise de Western blot com anticorpos para com PTBP1 e β-actina. borrões apresentados são representativos de quatro experiências independentes, com resultados semelhantes.

Painel inferior

: análise de densitometria dos níveis de proteína PTBP1 normalizada sobre os níveis de beta-actina. As médias de duplicados biológicos representativos de cada tratamento são mostrados.

Sobrevivência curva foi gerado em resposta a H

2O

2 de dosagem utilizando o método de exclusão com Trypan e expressos como% de sobrevivência para os controlos não tratados . A média ± DP de três passagens independentes realizadas em triplicata são mostrados, * – p . 0,05 pelo teste t de Student na comparação de controlar

Discussão

Neste relatório nós demonstramos que o estresse oxidativo induzido por H

2O

2 influências splicing do gene α1 GCs (GUCY1A3) e seletivamente diminui nível de proteína de PTBP1 e fatores /B1 splicing RNPhn A2. Nós previamente estabelecido que os transcritos GUCY1A3 sofrer splicing alternativo e que o C-α1 GCs splicing isoforma codifica uma proteína que é resistente à degradação induzida por ODQ [19], [37]. ODQ induz a degradação por oxidação do grupo heme prostético sGC, que desestabiliza a proteína. Um processo semelhante foi proposto que ocorra em condições de stress oxidativo e a ser responsável pela diminuição do nível de proteína GCs em inflamação vascular [23]. Neste estudo nós investigamos se GCs splicing pode ser modulada por ROS como um potencial mecanismo para favorecer a expressão de forma emenda C-α1 resistente à oxidação.

H

2O

2 é um ROS onipresente molécula que é produzida nas células por superóxido dismutase como um metabolito do anião superóxido (O

2-). H

2O

2 é um relativamente estável e com carga neutra que lhe permite membranas celulares para facilmente cruzadas. Estas propriedades conduziram à proposta de que H

2O

2 podem estar envolvidos na sinalização parácrina estresse oxidativo [38], [39]. Assim, optou-se por analisar H

2O

2 como um mediador do estresse oxidativo em nossos estudos realizados em neuroblastoma BE2 humana e linhas de células de adenocarcinoma de mama MDA468. Os nossos dados demonstram, pela primeira vez que uma exposição a H

2O

2 aumenta a quantidade relativa de ARNm e proteína C-α1 nestas linhas celulares (Fig. 1). Este resultado estabelece que o splicing C-α1 pode ser modulado pelo composto fisiologicamente relevante ROS, e sugere que a emenda pode desempenhar um papel importante na modulação da GCs propriedades enzimáticas em resposta a alterações no equilíbrio oxidativo do microambiente. Um estudo adicional em apoio a esta ideia foi recentemente relatado por Kraehling et al. [21]. Este relatório independente confirmou nossas descobertas anteriores de que as formas sGC C-a1 heterodímeros altamente estáveis ​​e totalmente ativas com GCs β1. Além disso, a diferença na distribuição subcelular de C-a1 a1 e canónica subunidades sGC foi demonstrada utilizando proteína fluorescente etiquetado; a isoforma C-α1 foi localizado no ambiente mais oxidada do retículo endoplasmático. Em conjunto, estes dados sugerem que o processamento alternativo do gene de GUCY1A3 pode participar na resposta celular adaptativa para preservar a função GCs em estresse oxidativo. Mais estudos para avaliar a importância fisiológica dessa adaptação são necessárias.

Para obter uma visão sobre possíveis mecanismos envolvidos na splicing alternativo de α1 GCs, foi realizada uma

in silico

análise da intrônica GUCY1A3 relevante e sequências ex�icas para identificar potenciais elementos reguladores [40], [41]. A distribuição do previsto

cis

sequências -regulatory era consistente com um modelo em que as proteínas SR favoreceria o uso local de união canónica, enquanto a ligação de hnRNPs, especificamente PTBP1 e RNPhn A2 /B1, iria bloquear o reconhecimento do exão 4 constitutiva 3 ‘local de splicing para promover a produção da isoforma C-α1 (Fig. 2A e Fig. S1). Para testar nosso modelo, examinaram a expressão de factores de splicing antes e após a exposição a H

2O

2. Apesar de a regulação de splicing é normalmente conseguida por modulação do nível de factores reguladores [28] expressão, o impacto do stress oxidativo em que este processo não tem sido previamente caracterizado. Contrariamente às nossas expectativas, os dados mostraram que H

2O

2 exposição induziu uma redução seletiva de PTBP1 e RNPhn A2 /B1, e não teve efeito sobre Hur e expressão da proteína SR (Fig. 2). Nossos resultados experimentais indicam uma regulação mais complexa de GCs splicing do que o previsto pelo

in silico

modelo. Investigações adicionais são necessárias para explicar essa diferença. Por outro lado, a redução específica e dramática de dois fatores-chave RNA splicing sugeriu que selectiva infra-regulação dos reguladores de emenda poderia ser um dos mecanismos subjacentes às mudanças no splicing alternativo em resposta ao estresse oxidativo.

peças PTBP1 um papel crucial num certo número de processos de regulação pós-transcricional, e a sua actividade tem sido associada à proliferação celular, apoptose, tumorigénese e resposta a hipoxia [30], [42], [43], [44]. Por isso, optamos por explorar ainda mais o efeito de H

2O

2 tratamento na expressão PTBP1. Os nossos resultados demonstram que a H

2O

2 diminui a expressão PTBP1 numa dose e dependente do tempo maneira (fig. 2C, F e a Fig. 3A, B). Não se observou qualquer alteração no nível de ARNm PTBP1, indicando que a diminuição da regulação pós-transcricional ocorre (Fig. 3C). Além disso, o atraso de várias horas, em resposta a H

2O

2 tratamento sugere um mecanismo indirecto de PTBP1 a sub-regulação. Esta conclusão é suportada pela observação de que MG132 inibidor de proteassoma facilitada, e não inibiu, a diminuição

2-a induzida H

2O em proteínas PTBP1 (Fig. 3A, B). Porque a degradação PTBP1 não requer síntese de novas proteínas (não foi bloqueada por tratamento cicloheximida) nossos resultados indicam que H

2O

2 pode, potencialmente, melhorar a degradação proteossómica de algum fator desconhecido responsável pela estabilização PTBP1. Dado que H

2O

2 exposição é conhecido por induzir a apoptose [45], foi considerada uma degradação mediada por caspase de PTBP1. Estudos anteriores demonstraram que PTBP1 é alvo de Capase-3 durante a resposta apoptótica [33]. No entanto, Inibidores de IV não conseguiu impedir H

redução 2O

2-mediada nos níveis de proteína PTBP1 (dados não mostrados). Assim, podemos concluir que H

2O

2 provavelmente induz a degradação PTBP1 por um diferente de mecanismos descritos anteriormente.

Também é importante salientar que a degradação PTBP1 não se limitou à adição direta de H

2O

2 solução para as células. Aplicação de oxidase extracelular glicose (GO), que catalisa a conversão da glicose em H

2O

2 e D-glucono-δ-lactona, também induziu uma redução significativa de proteína PTBP1 em MDA468 células (Fig. 3D) .

a reação de H

2O

2 com tióis protéicos (R-SH) e ânions tiolato (RS

-) é conhecido para gerar ácidos Sulfênicos modificações (RSOH) e promover dissulfeto formação de ligação. Estas proteínas foram implicados numa ampla variedade de efeitos bioquímicos que medeiam a sinalização ROS [34], [46]. Curiosamente, a dimerização das moléculas através da formação intermolecular PTBP1 ponte Cys foi anteriormente observado em condições oxidantes, [35]. Nós exploramos a possibilidade de que a sub-regulação de proteína PTBP1 por H

2O

2 é mediada por oxidação tiol. Na verdade, tiol não específica oxidante HEDS compostos provocou uma diminuição significativa dos níveis de PTBP1, semelhante a um H direta

2O

2 exposição (Fig. 3D). Assim, a dimerização através da oxidação de cisteína pode PTBP1 proteína alvo para a degradação posterior. Delineação de um mecanismo exato responsável pela degradação induzida ROS seletiva deste importante regulador pode oferecer importantes insights adicionais em resposta oxidativo celular

Anteriormente, expressão PTBP1 tem sido correlacionada com o aumento da proliferação e potencial metastático das células cancerosas.; No entanto, este efeito varia em diferentes linhas de células [31], [32], [47], [48].