Sumário

Récepteur d’origine nantais (Ron) é abundante em um painel de pâncreas células cancerosas e amostras de tecidos de pacientes com câncer pancreático. Ron pode ser activado pela sua proteína ligando estimulante de macrófagos (MSP), activando assim as vias de sinalização oncogénicos. A diafonia entre Ron e EGFR, c-Met, ou IGF-1R pode fornecer um mecanismo subjacente a resistência aos medicamentos. Assim, Ron segmentação pode representar uma nova estratégia terapêutica. IMC-RON8 é o primeiro anticorpo monoclonal Ron (mAb) entrar ensaio clínico para a segmentação Ron superexpressão. Nossos estudos mostram IMC-RON8 downmodulated expressão Ron em células de cancro do pâncreas e significativamente bloqueada activação MSP-estimulado Ron, Akt jusante e fosforilação ERK e expressão de mRNA survivina. IMC-RON8 dificultado a migração celular induzida pelo MSP e transformação de células reduzido. inibidores de histona-desacetilase (HDACi) são relatados para atingir a expressão de vários genes por meio de modificação de histonas de nucleossomas e proteínas não-histonas. Nosso trabalho mostra HDACi TSA e panobinostat (PS) diminuiu Ron mRNA e expressão de proteínas em células de câncer de pâncreas. PS também reduziu de sinalização a jusante de pAkt, survivina, e XIAP, assim como a apoptose celular aumentada. Curiosamente, PS reduzida a formação de colónias em células knockdown Ron, em maior medida do que as células de controlo de corrida Ron na formação de colónias e ensaios de agarose mole. IMC-RON8 também poderia sensibilizar as células de cancro do pâncreas para PS, como reflectido pelo número de colónias e tamanho reduzidos em terapêutica de associação com IMC-RON8 e PS sozinho comparado com tratamento único. O co-tratamento reduziu ainda mais expressão Ron e pAkt, e aumento da clivagem de PARP em comparação com qualquer tratamento sozinho. Este estudo sugere a possibilidade de uma abordagem nova combinação que pode vir a ser de grande valor no tratamento de câncer pancreático

Citation:. Zou Y, Howell GM, Humphrey LE, Wang J, Brattain MG (2013) Ron Knockdown e Ron Anticorpo monoclonal IMC-RON8 Sensibilizar o cancro do pâncreas para histona Deacetilase (HDACi). PLoS ONE 8 (7): e69992. doi: 10.1371 /journal.pone.0069992

editor: Lu-Zhe Sun, da Universidade do Texas Health Science Center, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de março de 2013; Aceito: 13 de junho de 2013; Publicação: 29 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health para financiamento: CA34432, CA38173, CA72001 e CA54807, atribuído a MG Brattain. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma doença altamente maligno, com cerca de 40.000 novos casos diagnosticados em os EUA em 2012 [1]. A taxa de sobrevivência de cinco anos é muito baixa ( 5%) [2]. Actualmente, menos de 10% dos doentes são elegíveis para a cirurgia curativa, enquanto que mais de 90% com doenças localmente avançado ou metastático, são tratados com radioterapia e /ou quimioterapia [3]. O câncer de pâncreas, eventualmente, desenvolve resistência a estas terapias. Os estudos moleculares revelaram que alterações genéticas e epigenéticas conduzir câncer pancreático [4]. Uma melhor compreensão das bases moleculares do câncer de pâncreas irão beneficiar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

Recentemente, Ron foi identificada a ser sobre-expresso em um subconjunto de pacientes com câncer pancreático e estabelecidas linhas celulares de cancro [5], [ ,,,0],6]. Ron pertence a MET de tirosina-cinase do receptor da família (RTK). Estudos anteriores mostraram que os níveis Ron são elevados em muitos cancros epiteliais, incluindo da mama [7], do cólon [8], o pulmão [9], e da bexiga [10] cancros. Ron sobreexpressão foi prognóstico de sobrevivência pobre e correlacionada com a progressão da doença [11].

estudos funcionais demonstraram que RON pode ser activado pela sua MSP ligando para iniciar uma cascata de sinalização molecular, incluindo a via PI3K /Akt, MAPK, β -catenina, JNK e as vias de FAK para regular várias funções celulares [12]. O eixo MSP /Ron foi mostrado para influenciar a migração celular e invasão, e potencialmente promover a metástase tumoral [12], [13]. Regulação negativa de Ron por knockdown reduzida resultou em proliferação celular, a transformação, o crescimento tumoral, metástase e aumento da apoptose celular, em células de cancro do cólon [14], [15]; e as células de câncer de pâncreas sensibilizados à gemcitabina [16]. Assim, Ron desempenha um papel importante na manutenção do fenótipo maligno de cancros humanos. IMC-41A10 foi a única Ron mAb anti-humana que foi reportado como tendo actividade anti-cancro [17]. IMC-41A10 inibida MSP ligação a Ron, reduziu MSP mediada por fosforilação Ron, PI3K /Akt e ativação de MAPK e migração de células

in vitro

. Recentemente, um romance humano mAb IMC-RON8 foi gerado e entrou fase I de ensaios clínicos como a primeira Ron mAb.

A resistência aos medicamentos é um grande obstáculo na terapêutica do câncer. Crosstalk entre RTKs podem representar um dos mecanismos de resistência aos medicamentos. Ron tem sido relatada a hetero-dimerizam com c-Met [18], e conversa cruzada com o EGFR [19], [20] para activar os RTKs de forma recíproca. Integrina e IGF1-R também pode activar Ron através de um modo independente de MSP-[21], [22]. Superexpressão de Ron maior resistência aos medicamentos de inibidor IGF1-R BMS-536924 em sarcoma infância [23]; enquanto knockdown de Ron sensibilizados as células resistentes a BMS-536924 [23]. Estes resultados sublinham um benefício potencial para tratamentos de combinação racionais com base em redes de Ron tirosina quinase.

Epigenetic alterações, tais como a acetilação e metilação, são as principais modificações pós-traducionais e dos resíduos lisina altamente carregadas de núcleo histonas nucleossomais. Alterações a acetilação de histonas estão sob o controlo das actividades dos acetytransferases histonas (HATs) e histona desacetilases (HDACs) [24], que determinam a activação da transcrição ou da repressão da expressão do gene opostas. Chapéus e HDAC também desempenham um papel importante na acetilação e desacetilação de proteínas não-histona [25], [26].

A super-expressão de HDAC foi encontrada no cólon, mama, pâncreas, e outros tipos de cancro [27] – [31], o que sugere que eles podem ser alvos atraentes anticancerígenos. inibidores de HDAC são relatados para atingir a expressão de vários genes por meio de modificação de histonas de nucleossomas e proteínas não-histonas. O pan-HDACi TSA, Vorinostat, belinostat e panobinostat (PS) têm sido amplamente investigadas. PS exerceu efeitos anticancerígenos robustas em células de leucemia através hiperacetilação de histonas nucleossomos e regulação positiva da transcrição da p21 e expressão p27 [32]. PS reduziu o crescimento do cancro do pâncreas através da inibição da proliferação das células e indução de apoptose de células [33]. TSA aumentou a resposta das células de cancro do pâncreas às quimioterapias convencionais incluindo a 5-FU e gemcitabina [2], [34]. No entanto, os mecanismos precisos subjacentes tratamento HDACi são em grande parte desconhecido. O nosso laboratório mostraram que HDACi belinostat induziu a expressão de TGFp RII epigeneticamente silenciosa e por conseguinte restaurado TGFp na sinalização mediada por inibição do crescimento de células em Smad4 tipo selvagem (wt) de células de cancro do pâncreas (por exemplo, MiaPaCa-2), [35]. Ron é altamente expresso em células de cancro do pâncreas mutantes Smad4. tipo selvagem expressão Smad4 foi relatado para suprimir a expressão Ron [36]. Knockdown de Smad4 ou inibição da sinalização de TGF-p resultou na indução da expressão de Ron. Os estudos aqui mostram que HDACi PS e TSA subregulado Ron e sua sinalização a jusante em células de câncer de pâncreas. Ron KD ou Ron mAb sensibilizados células cancerosas pancreáticas para PS. Oral PS foi usado na fase II de ensaios clínicos em pacientes adultos com refractário ensaio I /recaída de linfoma de Hodgkin e de fase para o tumor sólido avançado [32]. Nossos estudos têm explorado um possível mecanismo subjacente tratamento PS de câncer pancreático e forneceu provas importantes para o potencial de um tratamento de combinação racional para Ron-expressando células de câncer pancreático.

Materiais e Métodos

Cell Cultures

linhas celulares de cancro pancreático humano Capan-1 e CFPAC-1 foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e L3.6pl células foram originados a partir Dr. IJ Fidler [37]. As células foram cultivadas em meio SM (meio isento de soro de McCoy 5A com piruvato, vitaminas, ácidos aminados e antibióticos), suplementado com 10% de FBS. Todas as células foram mantidas numa atmosfera humidi ficada e 5% de CO

2 a 37 ° C

Anticorpos e Reagentes

Anticorpos para Ron C-20, a survivina, MAPK e pErk1 /2. foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. poli- (ADP-ribose) polimerase (PARP), pAkt (Ser

473), Akt, Caspase 9 anticorpos foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology. anticorpo de XIAP era de Abcam. clone anti-PTRY 4G10 foi comprado da Millipore. O anticorpo para a actina foi adquirido de Sigma

MSP humano recombinante foi adquirido à R . D systems (Minneapolis, MN) e usadas a uma concentração de 400 ng /ml em todas as experiências. IMC-RON8 foi fornecida por ImClone LLC sistema (Nova Iorque, Nova Iorque). Panobinostat (PS) foi obtido a partir de Selleckchem. A tricostatina (TSA) foi da Sigma-Aldrich. Ambos PS e TS foram solubilizados em DMSO e armazenado a -80 ° C até à sua utilização.

Geração de Ron Knockdown linhas celulares estáveis ​​

A precipitação expressão (PSR-SC) e shRNA PSR-Ron plasmídeos foram fornecidos pelo Dr. J. Wang [15]. Para estabelecer linhas celulares estáveis ​​com Ron derrubado por shRNA para células L3.6pl, PSR-Ron e um vector de controlo (PSR-SC) foram co-transfectados para uma linha celular de pacote HEK293GP em conjunto com vírus da estomatite vesicular-G (G-pVSV ) Plasmid usando o reagente de transfecção de Fugene HD. O sobrenadante foi recolhido após 48 h e utilizadas para infectar células L3.6pl. Puromicina foi usado para seleccionar as células infectadas. As células individuais foram, em seguida, isolado por plaqueamento das células reunidas em baixas densidades. Dois clones A6 e B21 com Ron específica KD foram utilizados nos estudos posteriores.

Análise Western Blot

As células foram lisadas em tampão de lise NP40 a [50 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,4) , 150 mmol /L de NaCl, 0,5% de NP40, 50 mmol /L, NaF, 1 mmol /L de Na

3VO

3, 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 mmol /l de DTT, 25 ug /ml de aprotinina, 25 ug /mL de inibidor de tripsina e 25 ug leupeptina /ml] a 4 ° C. Os lisados ​​de células foram fervidas em tampão de gel de carga e separadas por SDS /PAGE em géis 4~15%. Após PAGE, as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (Millipore). Após transferência, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite em TBST durante 1 hora. Em seguida, as membranas foram sondadas com os anticorpos primários indicados a 4 ° C durante a noite. Após lavagem três vezes em TBST, as membranas foram incubadas durante 1 hora com os anticorpos secundários conjugados com HRP específico de espécies apropriadas. Após outra lavagem três vezes, as membranas foram processados ​​e visualizados com reagentes reforçada quimioluminescência (ECL) (Amersham).

In Vitro

Proliferação ensaio utilizando MTT

A proliferação celular foi analisada utilizando-se 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazólio ensaio (MTT). Resumidamente, Capan-1, células CFPAC-1 e L3.6pl foram semeadas a uma densidade de 2000~3000 células /poço em placas de 96 poços. As células foram tratadas com diferentes concentrações de PS no dia 2. Quarenta e oito horas após o tratamento, as células foram então incubadas com MTT (0,5 mg /ml) durante 2 horas a 37 ° C. Após o meio contendo MTT foi removida, 150 ul de DMSO foram adicionados a cada poço e misturou-se no agitador. As placas foram lidas a 570 nm utilizando um leitor de microplacas (Bio-Rad). A absorvência medida é directamente proporcional ao número de células viáveis ​​na cultura.

ADN A fragmentação (morte celular ELISA)

A apoptose foi quantificada utilizando o kit de fragmentação de DNA celular Morte de detecção ELISA Plus ( Roche) segundo as instruções do fabricante. As células foram tratadas com PS como descrito acima. Fold aumentos de fragmentação de ADN foram normalizados com os valores de MTT a partir de condições de tratamento idênticos.

Extração de RNA e quantitativo em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi preparado a partir de células tratadas com o isolamento de ARN alta puro kit (Roche). Expressão de ARNm de Ron foi medida quantitativa por PCR em tempo real com reagentes TaqMan (Applied Biosystems) em ADNc reversamente transcrito a partir de 2 ug de ARN total. O ARNm de GAPDH foi amplificada em simultâneo para um controle endógeno.

A imunoprecipitação (IP)

Os lisados ​​celulares com 600 ug de proteína foram incubadas com 10 ug de anticorpo anti-Ron e grânulos Sepharose durante a noite a 4 ° C . No dia seguinte, os grânulos foram recolhidos por centrifugação e o sobrenadante foi removido para análise posterior. As esferas foram lavadas três vezes com PBST. Após a lavagem final, as esferas foram ressuspensas granulada em 30 ul de tampão de amostra de SDS. As amostras foram aquecidas a 95 ° C durante 5 min. Os complexos imunes resultantes foram executados em um gel de SDS-PAGE 8%, seguido por Immunoblot (IB) para pTyr e Ron.

deve Ensaios de cura e Transwell Motilidade Ensaios

células Capan-1 foram semeadas em 60 milímetros-dish e cresceu até confluência. Eles foram, em seguida, jejuadas durante a noite antes do tratamento IMC-RON8 durante 1 h. Monocamadas confluentes de células foram, em seguida, manualmente ferido por uma ponta de pipeta para formar uma abertura. O meio de cultura celular foi substituído com meio SM fresco seguido por estimulação MSP para 24h e 48h. o fechamento da ferida foi monitorizada por microscopia.

a migração celular em resposta a MSP foi medida utilizando uma câmara de Boyden modificada com 8 filtros de policarbonato Transwell de poro de 6,5 mm (Corning Costar). Após tripsinização, suspensões de células isoladas foram semeadas sobre as câmaras superiores em meio SM em placas de 24 poços. MSP quimio-atractor foi adicionado nas câmaras inferiores, com 10% de FBS foi utilizado como um controlo positivo. IMC-RON8 foi adicionado na câmara superior 2 horas antes da adição de MSP. As células foram deixadas migrar para a câmara do fundo com a quimio-atractores. Após a incubação de 24 horas, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-foi adicionado ao meio. As células na câmara superior do filtro foram removidas com uma mecha de algodão, e as células que migram para a parte inferior do filtro foram visualizadas ao microscópio seguido por solubilização em DMSO e quantificação a 570 nm.

Formação de Colónias ensaios e suave Agarose ensaios

células SC L3.6pl e clones shRNA KD A6 e B21 foram plaqueadas em placas de 24 poços a uma densidade de 300 células /poço. As células foram tratadas com PS no dia 2 em concentrações indicadas, durante 48 horas. Em seguida, as células foram lavadas com PBS três vezes. Foram adicionados meio fresco com 10% de FBS. Após um período adicional de 10 dias de incubação, as colónias de células foram visualizadas por coloração com MTT, seguido por solubilização em DMSO e quatifying a 570 nm.

ensaios de agarose mole foram utilizados para determinar as propriedades de transformação de CFPAC-1 e L3. 6PL células na presença ou ausência de IMC-RON8 e /ou PS. Resumidamente, as células foram suspensas em 2000 células /ml em 1 ml de 0,4% de agarose em meio SM contendo 10% de FBS e plaqueadas no topo de 1 ml de agarose a 0,8% no mesmo meio, em placas de 6 poços. As placas foram incubadas durante 2 semanas a 37 ° C com 5% de CO

2 numa incubadora humidificada. colónias de células foram visualizadas por coloração com 0,5 moles de

P

-iodonitrotetrazolium violeta (Sigma) e fotografada. número de colónias foram contadas. O crescimento independente de ancoragem de L3.6pl SC e células Ron KD também foram medidos por ensaios de agarose moles com ou sem tratamento PS.

Análise Estatística

Os dados foram resumidos como média ± erro padrão ( SE). A significância estatística foi calculada utilizando o software SPSS com o estudante

t

teste ou análise de variância para determinar as diferenças de médias. A significância foi aceito para

p

valor

0,05. Todas as experiências foram repetidas três vezes de forma independente.

Resultados

IMC-RON8 Downmodulated Ron Expressão e inibido MSP-dependente Ron fosforilação e sinalização a jusante

Para avaliar o efeito de IMC- RON8 em expressão em Ron Ron que sobre-expressam as células de cancro do pâncreas, células Capan-1 e CFPAC-1 foram tratadas com 100 nM de IMC-RON8 para vários intervalos de tempo, seguido por análise western blot. Figura 1A mostrou que a redução de Ron foi observada após tratamento com IMC-4H RON8 e durou até 48 horas em ambas as linhas celulares. IMC-RON8 foi, em seguida, avaliados quanto à sua capacidade para bloquear a activação Ron e seus efectores a jusante, MAPK e AKT. células CFPAC-1 foram privadas de soro durante a noite e tratados com IMC-RON8 seguido por estimulação MSP durante 30 minutos. Os resultados de IP (Fig. 1B) que se demonstrou IMC-RON8 não induziu fosforilação de Ron, indicando que IMC-RON8 não tem efeitos agonistas. A fosforilação da tirosina de Ron foi significativamente aumentada pela estimulação MSP, mas em grande parte, anulada por meio de tratamento IMC-RON8. Um estudo anterior relatou que a estimulação MSP ativa Ron jusante de sinalização PI3K /Akt e MAPK em células de câncer de pâncreas [6]. Por conseguinte, foram investigados o papel de IMC-RON8 em MAPK e fosforilação de Akt em Capan-1, L3.6pl e células CFPAC-1. Os nossos resultados mostraram que todas as linhas celulares de cancro pancreático foram examinados exibiram uma forte fosforilação dependente de MSP de Akt e MAPK, e que o tratamento com IMC-RON8 bloqueado induzida MSP activação de Akt e MAPK em todas as linhas de células (Fig. 1C). Para determinar se a activação Ron pode aumentar a expressão de XIAP e de survivina, que trataram células Capan-1 e CFPAC-1 com IMC-RON8 seguido por estimulação MSP durante 12 horas após privação de soro durante a noite. Os resultados mostraram que a estimulação de MSP a expressão aumentada de ARNm de survivina (Fig. 1D), mas não o nível de ARNm de XIAP, (dados não mostrados). IMC-RON8 pode bloquear este aumento da expressão de ARNm de survivina. Não observamos aumento significativo de XIAP e expressão da proteína survivina após a estimulação MSP em western blot.

A) Efeito do IMC-RON8 (100 nM) na expressão de Ron. Western blot para Ron. β-actina serviu como um controlo de carregamento. B) Efeito do IMC-RON8 na ativação Ron induzida MSP. As células foram privadas de soro durante a noite e tratados com IMC-RON8 durante 1 hora, seguido por estimulação MSP durante meia hora. lisados ​​celulares foram submetidos a IP e IB para pron. C) Efeito de CMI-RON8 de sinalização a jusante. Mesmo tratamento B). Western blot para pERK e pAkt. D) activação Ron e a expressão de ARNm de survivina. Capan-1 e células CFPAC-1 foram tratados com IMC-RON8 seguido por estimulação MSP durante 12 horas após privação de soro durante a noite. RT-qPCR foi realizada em ARN total para determinar o nível de ARNm de survivina. mRNA GAPDH foi utilizado como um controlo interno.

IMC-RON8 significativamente inibido celular orientado a MSP Motilidade

Para avaliar o efeito do IMC-RON8 na motilidade celular, um ensaio de migração transpoço foi realizada em células Capan-1 com o tratamento com IMC-RON8 na presença ou ausência de MSP. IMC-RON8 MSP- reduziu significativamente a migração celular induzida em células Capan-1 por 80~90% (Fig. 2A).

In vitro

ferida ensaios de cura ainda confirmada a capacidade do IMC-RON8 para bloquear a migração celular. células Capan-1 estimuladas com MSP começou a migrar para a área da ferida 24 horas após a zero (Fig. 2B). A ferida estava quase curado por células que migram em 48 horas após o tratamento MSP, enquanto IMC-RON8 reduziu significativamente a mobilidade celular

.

células Capan-1 foram privadas de soro durante a noite. A migração celular foi avaliada por ensaio Transwell com MSP como um quimioatractivo na câmara inferior. A) Imagens de células que migraram com sucesso para o lado inferior da membrana Transwell. B) Quantificação de células que migraram. C.

In vitro

cicatrização de feridas ensaio.

HDACi subregulado Ron mRNA e expressão de proteínas e Downstream Sinalização

Para determinar o efeito da HDACi na expressão Ron, Capan -1, L3.6pl e células CFPAC-1 foram tratados com pan-HDACi PS durante 8, 24 e 48 horas. Os resultados mostraram que o PS empobrecido Ron expressão em todas as linhas de células que expressam-Ron examinados (fig. 3A). Redução de Ron foi observado dentro de 8 horas com o aumento da depleção ocorrendo ao longo de períodos de 48 h (Fig. 3a). A regulação baixa pronunciada de Ron também foi visto em células de câncer de pâncreas tratados com outro pan-HDACi, TSA (Fig. 3B), indicando redução de Ron é uma característica comum para o tratamento Pan-HDACi. Em seguida, determinar se as alterações na proteína Ron foram, pelo menos, parcialmente devido a alterações na sua transcrição. O tratamento com PS diminuiu significativamente o nível de ARNm de Ron de uma forma dependente do tempo (Fig. 3C). Além disso, as células tratadas com apenas DMSO (solvente para o PS e o TSA) não teve influência na expressão de Ron tanto nos níveis de ARNm e de proteína. Estudos anteriores mostraram que a fosforilação Ron ativa uma cascata de moléculas de sinalização a jusante, incluindo Akt fosforilação [6], [15], [17]. A seguir, determinou os efeitos do PS sobre a sinalização celular a jusante. células Capan-1, L3.6pl e CFPAC-1 foram tratados com PS. Após o tratamento durante 8 e 24 horas, Akt fosforilação foi reduzido de uma maneira dependente da concentração em todas as 3 linhas de células do cancro do pâncreas (Fig. 3D). Ps para tratamento de 24 e 48 horas, também reduziu as concentrações de proteína XIAP e survivina de uma forma dependente da concentração, em células de cancro do pâncreas (Fig. 3D).

A) células de cancro pancreático foram tratadas com diferentes concentrações de PS Para 8h, 24h e 48 horas. Western blot para Ron foi realizada. β actina serviu como um controlo de carga. B) As células foram tratadas com TSA com IB para Ron. número substancial de células foram mortos (cerca de 80%) em células Capan-1 tratados com TSA 1000 nM às 48 horas. C) As células foram tratadas com 50 nM de PS durante 8, 24 e 48 horas. RT-qPCR foi realizada em ARN total para determinar o nível de ARNm de Ron. ARNm de GAPDH foi usada como um controlo interno. D) As células foram tratadas com diferentes concentrações de PS nos pontos de tempo indicados. Western blot para pAkt, XIAP e expressão survivin. B-actina foi usado um controle de carga.

PS crescimento reduzido celular e aumento da apoptose celular através da indução do ciclo celular regulador p21 e caspase Atividade

A função do IAP membros da família XIAP e survivina é inibir caspases 3, 7, 9 e actividade de apoptose celular dependente de caspase através da ligação às caspases activas [42]. Mostra-se que após 48 horas de incubação, PS reduziu a proliferação celular (Fig. 4A) e aumento da apoptose de células (Fig. 4B) de uma maneira dependente da concentração em todas as 3 linhas de células testadas, conforme determinado por MTT e fragmentação do ADN. Estudos anteriores relataram que HDACi tratamento resulta na proliferação diminuída de células de cancro do pâncreas devido a uma paragem no ciclo celular e a indução da morte celular programada dependente de caspase [33]. Detectamos um aumento do inibidor da cinase (CDK) dependente de ciclina p21 em células de cancro do pâncreas após tratamento HDACi (Fig. 4C). Aumento Capase-9 e clivagem PARP activação da caspase seguinte também foi observada em Capan-1 e células L3.6pl (Fig. 4C). Nós descobrimos que em células CFPAC-1, o aumento da caspase 9 clivagem foi detectada apenas em concentrações elevadas de tratamento PS a 48 horas, mas não às 24 horas. Correspondentemente, a clivagem de PARP foi observado apenas na elevada concentração de tratamento PS em células CFPAC-1, indicando, assim, que as células CFPAC-1 são relativamente resistentes à apoptose PS-celular induzida em comparação com células Capan-1 e L3.6pl.

As células foram tratadas com diferentes concentrações de PS, A) o crescimento de células foi medida por MTT; B) a apoptose das células foi medido por fragmentação de ADN; C) Western blot para p21 e caspase actividade (PARP e caspase 9 clivagens). B-actina foi usado como um controle de carga.

Ron Knockdown ou Ron mAb IMC-RON8 sensibilizado cancro do pâncreas células para tratamento PS

Ambos IMC-RON8 e PS downmodulated expressão Ron. IMC-RON8 reduz a sinalização oncogénica através de pAkt e pERK e inibe a migração celular em células de cancro pancreático. No entanto, IMC-RON8 não afecta a proliferação celular e a apoptose de células

In vitro

como evidenciado por MTT, PARP e caspase 9 clivagens, que é o mesmo para Ron knockdown (dados não mostrados). PS, no entanto, induz significativamente a apoptose de células e reduz a proliferação celular em células de cancro pancreático. A combinação entre Ron knockdown ou IMC-RON8 e PS pode compensar a falta de inibição da sobrevivência das células em Ron segmentação IMC-RON8 ou Ron knockdown. Para determinar os efeitos proliferativos de Ron knockdown e PS tratamento, foi realizado um ensaio de formação de colónia padrão. Em primeiro lugar, os mexidos (SC) e Ron shRNA plasmídeos foram entregues nas células por transfecção L3.6pl-infecção para estabelecer L3.6pl controlo SC e linhas celulares estáveis ​​knockdown Ron. Os clones de uma única célula A6 e B21 foram seleccionados após o tratamento puromicina. Ron shRNA especificamente derrubado expressão Ron, uma vez que c-Met, que tem identidade de sequência de alta com Ron, não mostrou qualquer alteração (Fig. 5A). Em seguida, as células L3.6pl SC e clones Ron KD A6 e B21 foram tratadas com baixas concentrações de PS. Os resultados mostraram que tanto L3.6pl SC e crescimento celular Ron KD foram significativamente inibidas por PS em uma maneira dependente da concentração (Fig. 5A). tratamento PS na mesma concentração reduzida de formação de colónias em células Ron KD L3.6pl a uma maior extensão do que as células de controlo SC Ron (Fig. 5A). Ron si KD não alterou a proliferação de células em células de cancro pancreático. Nós próxima realizados ensaios de agarose mole para continuar a determinar as propriedades de transformação de células L3.6pl com Ron KD e tratamento PS. Figura 5B mostrou que clones L3.6pl Ron KD produziu menos colónias (30~40%) do que as células SC Ron na agarose macia. PS reduziu significativamente colónias formadas em ambos L3.6pl Ron SC e clones de células kD (Fig. 5B). Curiosamente, o tratamento conduziu a PS significativamente mais menos número de colónias em células L3.6pl Ron KD do que em células SC L3.6pl em todas as concentrações de PS (Fig. 5B). Os tamanhos de colónias em células tratadas PS L3.6pl Ron KD foram obviamente menor do que PS células tratadas com SC (dados não mostrados). Para determinar o papel dos Ron em câncer pancreático, IMC-RON8 foi introduzido para medir os efeitos potenciais de combinação, juntamente com PS. Em ambas as células L3.6pl (Fig. 5C) e CFPAC-1 (Fig. 5D), o bloqueio de Ron com IMC-RON8 poderia reduzir a formação de colónias em comparação com os controlos sem qualquer tratamento (até 50%). O tratamento combinado com PS e IMC-RON8 ainda gerado um número significativamente menor número de colónias com tamanho menor do que o tratamento medicamentoso único sozinho em ambos L3.6pl e células CFPAC-1 (Fig. 5C e 5D).

L3

A). 6PL células foram estavelmente transfectadas com os plasmídeos e Ron SC shRNA. Os clones Ron KD A6 e B21 foram seleccionados para ensaio clonogénico: L3.6pl Ron SC e os clones A6 KD e B21 foram tratados no dia 2 com PS nas concentrações indicadas, durante 48 horas. Após lavagem, as células foram cultivadas durante um adicional de 10 dias em 10% de FBS contendo meio. colónias de células foram visualizados após coloração com MTT e quantificada em DMSO. B). o crescimento ancoragem independente dos L3.6pl SC e os clones Ron KD tratados por PS foi determinada como descrito em Materiais e Métodos. ensaio argrose macio também foi realizado para C) células L3.6pl e D) CFPAC-1 células tratados com IMC-RON8 ou PS sozinho ou suas combinações.

Os mecanismos subjacentes IMC-RON8 sensibilização dos as células do cancro do pâncreas PS

Para determinar o efeito do tratamento com a combinação de PS e IMC-RON8 sobre a expressão de Ron, Capan-1, L3.6pl e CFPAC-1 as células foram tratadas com as concentrações indicadas de IMC-RON8 , PS ou sua combinação. Descobrimos que Ron foi degradada por IMC-RON8 após o tratamento 24 horas (Fig. 6A). PS único tratamento reduziu Ron, pAkt e aumento da clivagem de PARP. No entanto, a co-tratamento ainda mais reduzido expressão Ron (Fig. 6A), em comparação com sozinho em todas as três linhas de células de cancro pancreático foram examinados único tratamento. Por outro lado, o co-tratamento também ainda mais reduzida e um aumento de pAkt clivagem de PARP (Fig 6B). Estes podem explicar a formação de colónias reduzida em terapêutica de associação em relação ao único agente sozinho.

A) expressão Ron após co-tratamento de Capan-1, L3.6pl e células CFPAC-1 com IMC-RON8 e PS. B) Efeito do co-tratamento de IMC-RON8 e PS em pAkt e clivagem PARP. β-actina foi usado como um controle de carga.

Discussão

Este estudo identificou um potencial nova abordagem terapêutica em câncer pancreático utilizando uma estratégia de combinação através da exploração de recursos genéticos e epigenéticos. O câncer de pâncreas é um dos problemas mais difíceis na terapia do cancro. A quimioterapia corrente por gemcitabina tem uma taxa de resposta muito baixa ( 20%) e resistência aos medicamentos desenvolve-se rapidamente, resultando em falha do tratamento [2]. Assim, são urgentemente necessárias novas estratégias terapêuticas.

Ron foi recentemente relatado para ser altamente expressa em células de cancro do pâncreas e amostras de doentes com [5], [6]. Estimulação com MSP activa Ron e a sua sinalização a jusante, incluindo a via PI3K /Akt e MAPK e promove a migração celular e invasão. No entanto, a activação Ron não teve nenhum efeito sobre a proliferação de células de cancro do pâncreas [6]. Knockdown de Ron mostrou aumento da susceptibilidade à apoptose de células cancerígenas do cólon ao estresse privação de fator de crescimento através da ativação mutante p110α [14], [15]. No entanto, as células de câncer de pâncreas não contêm mutações p110α. Ron KD não teve nenhum efeito sobre a proliferação celular e a apoptose, avaliada por MTT, PARP e caspase 9 clivagens

in vitro

(dados não mostrados) em células de cancro pancreático.

Os nossos estudos mostraram que aqui IMC -RON8 downmodulated expressão Ron, que foi consistente com estudos anteriores que rato anti-Ron mAbs Zt /g4, Zt /F2 e Zt /c9 reduzida expressão Ron em células cancerígenas do cólon [43]. Human mAb IMC-41A10 eficiência reduzida ativação Ron MSP-mediada e sua PI3K a jusante /Akt e MAPK activação [17]. redução de sinalização MAPK por IMC41A10 foi evidenciado pela diminuição pERK em todas as linhas celulares de cancro escolhidas. No entanto, o efeito de IMC41A10 em pAkt não é consistente em todas as linhas celulares. Por exemplo, IMC41A10 tinha forte impacto na redução da activação de Akt em HT29, DU-145 e AGS, enquanto IMC-41A10 não se alterou de pAkt em outras células, incluindo a linha celular de cancro pancreático BxPC3 [17].

IMC-RON8, Ron outro mAb anti-humano totalmente, exibiu actividade anti-tumoral contra o cólon humano, de pulmão e pancreático xenoenxertos em ratinhos nus [44]. Os nossos estudos demonstraram que aqui IMC-RON8 eficazmente inibida Ron fosforilação em células CFPAC-1, bem como pMAPK a jusante e a activação de pAkt em todas as linhas celulares de cancro pancreático foram examinados incluindo BxPC3 (dados não mostrados). Isto indicou que o IMC-RON8 é funcional para a inibição das vias de sinalização mediadas por MSP e exibe uma forte eficácia no que diz respeito ao bloqueio da via PI3K /Akt.

trabalho anterior no nosso laboratório e outros tem demonstrado que a activação de Akt está ligada a