Abstract

Introdução

O aumento da evidência mostrou que a vigilância imunológico está comprometido em um microambiente para pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), e pode ser restaurado pela quimioterapia apropriada.

Métodos

para testar esta hipótese, analisamos a expressão do gene microarray indutor de tumores perfis de células mononucleares do sangue periférico de 30 pacientes com recém-diagnosticados estágio avançado NSCLC, e 20 por idade, sexo-e controles saudáveis ​​co-correspondida-morbidade. Todos os pacientes receberam uma média de quatro sessões de quimioterapia com cisplatina e gemcitabina para um ciclo de 28 dias como tratamento de primeira linha.

Resultados

Sessenta e nove genes diferencialmente expressos entre os pacientes e controles , foram identificados e 59 genes diferencialmente expressos, antes e após a quimioterapia. O

IL4

pathway foi significativamente enriquecida em ambos progressão e quimioterapia assinaturas tumorais.

CXCR4

e

IL2RG

foram regulados negativamente, enquanto que

DOK2

e

S100A15

foram up-regulada nos pacientes, e as expressões de todos os quatro genes foram parcialmente ou totalmente revertida após a quimioterapia. Quantitativa em tempo real RT-PCR para os quatro-regulada (

S100A15, DOK2

) e regulada para baixo (

TLR7, TOP1MT

) genes nos pacientes, e os seis-regulada (

TLR7, CRISP3, TOP1MT

) e regulada para baixo (

S100A15, Dok2, IL2RG

) genes após a quimioterapia confirmou a validade dos resultados de microarray. Outras análises imuno-histoquímica dos tecidos de cancro do pulmão embebidos em parafina identificados coloração nuclear S100A15 forte não só no estádio IV NSCLC, em comparação com estágio IIIB NSCLC (p = 0,005), mas também em pacientes com doença estável ou progressiva, em comparação com aqueles com um parcial resposta (p = 0,032). Uma elevada percentagem de células coradas nucleares S100A15 (HR 1.028, p = 0,01) foi o único fator independente associado com a mortalidade global de três anos.

Conclusões

Nossos resultados sugerem um papel potencial do

IL4

via na vigilância imunológica do estágio avançado NSCLC e potenciação imune de quimioterapia combinada. S100A15 pode servir como um biomarcador potencial de estadiamento do tumor, e um indicador de prognóstico pobre em NSCLC

citação:. Chen Y-C, Hsiao C-C, Chen K-D, Hung Y-C, Wu C-Y, Lie C-H, et al. (2013) periférica Immune Gene celular Expressão Mudanças no Avançados não-pequenas células do pulmão doentes oncológicos tratados com Primeira Linha combinação de quimioterapia. PLoS ONE 8 (2): e57053. doi: 10.1371 /journal.pone.0057053

editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Agosto, 2012; Aceito: 16 de janeiro de 2013; Publicação: 25 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa (CCMP96-RD-202) a partir da Comissão de Medicina chinesa e Farmácia do Departamento de Saúde, Yuan Executivo, Taiwan, e também apoiado em parte por doações do Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG891301 para KD Chen, e CMRPG881031 para YC Chen). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é a causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. A taxa média de sobrevida de 5 anos é inferior a 15%, que se manteve praticamente inalterado durante as últimas três décadas. A maioria dos pacientes com NSCLC apresentam-se com doença avançada no momento do diagnóstico, e aqueles diagnosticados com doença em estágio inicial muitas vezes experimentam recorrência e metástase [1], [2], [3].

Hospedar células imunes mediar vigilância imunológica por erradicar as células aberrantes, e este é comprometida de um microambiente indutor de tumores em muitos pacientes com cancro do pulmão. Vários defeitos imunológicos, incluindo uma mudança para o fenótipo de célula T auxiliar tipo 2 (Th2), são evidentes em pacientes com cancro do pulmão [4], [5]. No entanto, as mesmas células do sistema imunológico pode promover o crescimento tumoral e metástases através de angiogénese e invasão da matriz extracelular [6], [7]. Compreender os processos moleculares fundamentais que causam esses defeitos proporcionaria uma oportunidade para desenvolver terapias inovadoras. Além disso, as respostas imunitárias celulares montado por vários tipos histopatológicos e fases de tumor do cancro do pulmão pode ser diferente; No entanto, os estudos sobre este tema faltam.

várias moléculas imunossupressoras são produzidos por tumores, tais como interleucina-10 (IL-10), factor de crescimento transformante-beta (TGF-β), ou ciclo-oxigenase-2 ( metabolitos de COX-2); No entanto, terapias específicas, tais como a quimioterapia e a radioterapia podem contribuir para a alteração da função do sistema imunitário [4], [6], [8]. Evidências crescentes sugerem que uma faceta da vigilância imunológica pode ser restaurado por agentes quimioterápicos apropriadas. Por exemplo, tem sido mostrado a gemcitabina análogo de nucleósido (GEM) para aumentar selectivamente a resposta imune adaptativa e promover a resposta imune mediada por células sobre a resposta imunitária humoral em adição aos efeitos apoptóticos convencionais [9] – [12]. Além disso, o agente baseado em platina, cisplatina (CDDP), tem sido mostrado aumentar os efeitos anti-tumorais de imunoterapia citotóxica de linfócitos T mediada por [13]. Também tem sido demonstrado que o uso de duas vezes a quimioterapia à base de platina proporciona um benefício significativo em termos de resposta do tumor e a sobrevivência em comparação com um regime com um único agente [14]. O mecanismo subjacente de potenciação imune para quimioterapia combinada é em grande parte desconhecido.

O objetivo deste estudo foi o de melhorar a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam a vigilância imunológica ou progressão do tumor nas células do sistema imunológico de pacientes com NSCLC fase avançada investigar a expressão de genes em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) que podem estar envolvidos nestes efeitos. Trabalhamos com a hipótese de que as expressões de genes de PBMC envolvidos na resposta imune a NSCLC fase avançada seria muito diferente da dos indivíduos saudáveis, e que as diferenças adicionais seriam vistos entre os doentes com cancro e com adenocarcinoma (AC) e carcinoma de células escamosas (SCC) ou entre IIIB e IV. Além disso, buscamos melhorar a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam imuno induzida por quimioterapia de combinação com CDDP e GEM, com a esperança de que novos genes pode ser encontrado para ser super ou sub-expresso após o tratamento, oferecendo assim novas perspectivas para melhorar a eficácia da quimioterapia

Uma série de estudos tenham aplicada a tecnologia de microarray de ADN para investigar expressão dos genes em doentes com NSCLC [15] -. [24]. Em um desses estudos, que incidiram sobre as expressões de genes nos leucócitos do sangue, em vez de tecidos tumorais, 29 genes foram encontrados para ser alterada em doentes com NSCLC em estágio inicial em comparação com aqueles com doenças pulmonares não malignos. A medida em que os genes de leucócitos desempenham um papel no NSCLC avançado, e os efeitos da histopatologia e estágio do tumor em assinaturas genéticas não são claros [23]. Portanto, nós estendemos nossa investigação sobre NSCLC em estágio avançado através da análise de todo o genoma perfis de expressão gênica em PBMC de pacientes com NSCLC estágio avançado recém-diagnosticados e histopatologia da CA ou SCC. Além disso, para estabelecer uma ligação directa entre a expressão gênica e quimioterapia, pós-tratamento PBMC de 17 pacientes que receberam pelo menos quatro cursos de quimioterapia de combinação com CDDP e GEM foram obtidos, e os efeitos da quimioterapia em perfis de expressão gênica global foram avaliados utilizando microarray análise.

Materiais e Métodos

o estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board of Chung Gung Memorial Hospital, Taiwan. Os participantes do estudo foram recrutados das clínicas pulmonares e exame de saúde centro de Kaohsiung Chung Gung Memorial Hospital durante o período de agosto de 2007 a janeiro de 2009. Todos os pacientes incluídos tinham idade de 18 anos ou mais, com confirmação histológica, recém-diagnosticada, tratada, estágio IIIB ou IV NSCLC, com um ou lesão mais mensuráveis ​​(unidimensional) com um diâmetro igual ou maior 10 mm, medida por meio de tomografia computadorizada, subtipo histopatológico de CA ou SCC, e um performance status Eastern Cooperative Oncology Group de 0, 1 ou 2. Cada tumor foi diagnosticado de acordo com o subtipo histopatológico e grau por um patologista. estágio clínico foi julgado de acordo com a União Internacional Contra o Câncer (UICC) Tumor de classificação de metástase (6

ª edição, 2002). Um total de 42 pacientes com câncer de pulmão foram rastreados para a elegibilidade de inscrição. Os doentes com tratamento de primeira linha de regimes que não CDDP e quimioterapia de combinação GEM (4 pacientes), aqueles que receberam radioterapia concomitante (2 pacientes), doença médica ou psiquiátrica não controlada grave (1 paciente), história de outra doença maligna nos últimos 5 anos (1 paciente ), e recusando-se a fornecer uma amostra de sangue para o estudo (4 pacientes) foram excluídos. Trinta pacientes completaram o seguimento e foram incluídos para análise final. Todos os 30 pacientes receberam quimioterapia de primeira linha com CDDP (dose média de 70 mg /m2) no dia 1 mais GEM (GEMZAR®; Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN; dose média de 1000 mg /m2) no dia 1, 8 e 15 de um ciclo de 28 dias. O tratamento foi planejado para um máximo de seis ciclos (mediana 4, range 1-6), a menos que foi interrompida por causa de doença progressiva, doença estável, toxicidade inaceitável ou morte. Após a avaliação de linha de base, a resposta tumoral foi avaliada uma semana após a última dose de acordo com os critérios de avaliação da resposta em tumores sólidos. Uma resposta completa (RC) foi definida como o desaparecimento completo de toda a evidência de doença. Uma resposta parcial (PR) foi definida como uma redução de pelo menos 30% do maior diâmetro de cada lesão alvo, sem o aparecimento de novas lesões. A progressão foi definida como um aumento de pelo menos 20% do maior diâmetro de cada lesão alvo, ou o aparecimento de uma ou mais novas lesões. A sobrevida global foi definido como o tempo desde o diagnóstico até a morte por qualquer causa durante o período de acompanhamento de 3 anos. Vinte indivíduos saudáveis, sem história de doença maligna nos últimos 5 anos ou doença infecciosa recente foram incluídos como grupo controle.

Processos de isolamento de RNA e síntese | cRNA

sangue periférico (15 ml) foi coletada após consentimento informado foi obtido a partir dos 30 pacientes com o recém-diagnosticados histologicamente confirmados NSCLC, e os 20 por idade, pelo sexo, e co-pareados por morbidade controles saudáveis ​​(HC). Outros 15 ml de sangue foi recolhido de novo uma semana após a última dose de CDDP e GEM dos 17 pacientes que completaram pelo menos quatro cursos de quimioterapia de combinação. As PBMC foram isoladas por Ficoll-Hypaque de gradiente (Histopaque®-119, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO EUA) no prazo de 90 min de sangue desenho, lavadas em PBS e, em seguida armazenado em RNAlater (Ambion Inc. , Austin, TX, EUA) a -80 ° C até o isolamento de ARN. Um RNeasy® Além disso Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) foi utilizado para o isolamento de RNA total de alta qualidade, e tratado com ADNase de acordo com o protocolo de fabricação. O ARN foi, em seguida, eluiu-se em água isenta de RNase. As amostras foram corridas num RNA 6000 Nano Sistema de Gel (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, EUA) utilizando um Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent) para determinar a qualidade do ARN, e 2 ul de RNA foi usada para determinar a concentração de ARN utilizando um espectrofotómetro NanoDrap (Thermo Ciência, Wilmington, dE, EUA). Somente as amostras com proporções A260 /A280 de 1,9 a 2,1 foram utilizados para a análise posterior. Um total de 300 ng de ARN foi utilizado para a síntese da primeira cadeia de cDNA e na transcrição in vitro de ARNc utilizando um kit de amplificação de ARN Ilumina Totalprep (Ambion, Inc.).

perfil genético Expressão e Análise de Dados Microarray

Ilumina (San Diego, CA) microarrays grânulo HumanRef-8v2 foram usadas com 750 ng de ARNc marcado para cada amostra de acordo com o protocolo do fabricante. Human Ref-8 versão 2 matrizes consistem em 22,184 sondas que representam 18.189 genes humanos únicos em uma matriz formato de oito tira. Todos dataset expressão foi depositado na expressão gênica NCBI Omnibus (GEO) com o número de acesso GSE39345. A análise estatística dos dados foi realizada de microarray, utilizando software de versão GeneSpring 11 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA). Para fazer com que os valores de expressão independente da intensidade da mancha e localização, uma outra por normalização gene foi aplicado aos dados de pré-normalizadas dentro de cada matriz através da divisão dos dados em bruto por a mediana do nível de expressão do gene em amostras de indivíduos saudáveis. dados brutos gerados após a digitalização dos microarrays com fundo corrigido foram carregados a partir do módulo Expressão Beadstudio da Illumina para GeneSpring GX. Este passo foi seguido pela normalização quantil e transformação log2. Um conjunto de filtros de sonda foi aplicado para remover genes que não foram detectadas com fiabilidade. No geral, 22150 sondas do total de 22184 sondas (99,8%) mostraram que pelo menos 1 em cada 67 amostras foram sinalizadas no P bandeiras (presente) ou M (marginal) em comparação com os níveis de fundo. Um teste não-paramétrico U para comparações não emparelhadas dos dois grupos independentes ou o Wilcoxon signed rank para comparar os níveis de expressão do gene antes e após a quimioterapia foi aplicada. Utilizamos o método Benjamini-Hochberg taxa de falso-descoberta (FDR) correção de controle de falsos positivos e um corte p-valor corrigido de 0,05 foi utilizado para selecionar os conjuntos de genes significativamente para cima e para baixo-regulado com o menor FDR. Os conjuntos de genes foram então agrupadas em categorias funcionais de acordo com o Gene Ontology Biológica processos de classificação. O processo de enriquecimento via foi utilizada para identificar as características de subconjuntos significativamente alterados de genes entre os grupos fenotípicos e encontrar relações diretas entre genes de interesse. Este foi realizada em software GeneSpring com o algoritmo de “interação simples e direta”. A informação utilizada pelo algoritmo foi obtido a partir da literatura PubMed usando algoritmos de Processamento de Língua Natural para procurar palavras-chave e relacionamentos em resumos. análise de agrupamento hierárquico foi realizada por programas de agrupamento e de construção de árvore, com base nos genes filtradas que preencheram os critérios estatísticos, utilizando o método da bolha hexagonal.

Verificação de Gene Expressions utilizando TaqMan Quantificação em tempo real polimerase-transcriptase reversa Reacção em cadeia (RT-PCR)

para confirmar os padrões de expressão de certos genes candidatos, as expressões foram analisados ​​utilizando RT-PCR em um formato de 32 poços. Para cada gene de interesse, uma única reacção de RT-PCR foi realizada na mesma amostra de ARN da PBMC de doentes com cancro (n = 30) e HC (n = 20). O gene arrumação proteína ribossómica ácida humana (Hupo) foi escolhido como um controlo endógeno para normalizar os dados de expressão para cada gene. Todos os iniciadores de PCR (hexâmeros aleatórios) e sondas TaqMan foram concebidos e adquiridos a partir de Roche de acordo com os protocolos da empresa (www.roche-applied-science.com), e as suas sequências são dadas na Tabela S1, que é publicado como informação de apoio à PLoS One web site. Em resumo, em duas etapas quantitativa de RT-PCR foi realizada. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de 5 ug de ARN utilizando um kit LightCyclerTaqManMaster (Roche, Alemanha). As reacções de PCR foram realizadas num aparelho Roche Ciclo de luz 2.0. tempo real única experiência de PCR foi efectuada em cada uma das amostras para cada gene alvo, porque o sistema Roch Luz Cycler mostrou alta reprodutibilidade utilizando excelente controlo térmico e formato de detecção da sonda (https://www.roche-applied-science.com/sis /rtpcr/LCNano/index.jsp?id=LCNano_100000). níveis de expressão relativa foram calculados utilizando o método ΔΔCq com o valor mediano para o grupo HC como calibrador, como foi feito com dados de microarranjos [25].

imuno-histoquímica (IHQ) Coloração de Lung Cancer tecidos para S100A15

secções de parafina de tecido foram desparafinados em xileno, re-hidratadas por meio de soluções de etanol graduadas para a água destilada, e em seguida lavadas em solução salina tamponada com Tris. A recuperação de antígenos foi realizada por aquecimento em secções de citrato de sódio 10 mM durante 10 min num forno de microondas. A actividade da peroxidase endógena foi extinta por incubação em 3% H

2O

2 em metanol durante 5 minutos. locais de ligação não específicos foram bloqueados com bloco de proteína (Dako, Carpinteria, Califórnia, EUA) durante 20 min. As secções de tecido foram então incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpo anti-humano S100 proteína de ligação do cálcio A15 (anti-hS100A15; 1:5000; um presente de H. Stuart Yuspa, Laboratório de Biologia e cancro Genetics Center for Cancer Research, National Cancer Institute, EUA) durante a noite, seguido de 30 min-incubação com IgG de cabra anti-rato conjugada com peroxidase de rábano um polímero marcado com (Envision + System; DakoCytomation, Carpinteria, Califórnia, EUA). As lâminas foram desenvolvidas durante 5 min com cromogénio 3,3′-diaminobenzidina e contrastadas com hematoxilina. Nas seções de tecido de controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído por IgG de ratinho de isotipo específico não imune.

Avaliação da imuno-coloração para S100A15

Cada lâmina foi avaliada por S100A15 imunocoloração usando uma semi- sistema de pontuação quantitativa tanto para a intensidade da coloração e a percentagem de células epiteliais tumorais positivas /pulmonares. visão geral coloração IHC foi realizada por um leitor independente treinado (TYW), que desconhecia o resultado clínico, estágio do tumor e histopatologia. As secções de tecido foram contadas por contagem manualmente ≥1000 células com base na percentagem de células imunocoradas como: 0-10% = 0; 10-30% = 1; 30-50% = 2; 50-70% = 3 e 70-100% = 4. As secções foram também teve uma avaliação semi-quantitativa com base na intensidade de coloração como negativo = 0; = Leve 1; = Moderados 2; e intensa = 3. A pontuação total foi obtido pela soma das pontuações de porcentagem de positividade e intensidade de coloração, com coloração nuclear e citoplasmática marcou de forma independente [26].

Análise Estatística

valores contínuas foram apresentadas como a média ± desvio padrão (SD). Mann-Whitney, soma classificou Wilcoxon, Kruskal-Wallis H, e testes qui-quadrado foram utilizados para avaliar as diferenças entre os diferentes grupos se for o caso. teste de correlação de Pearson foi utilizado para avaliar a correlação entre duas variáveis ​​contínuas. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar a sobrevida global, e análise de regressão de Cox com a seleção stepwise forward foi utilizado para avaliar fatores prognósticos independentes associados com a sobrevivência. Todos os testes foram bicaudais e a hipótese nula foi rejeitada pelo p 0,05. Um pacote de software estatístico (SPSS, versão 15.0, SPSS Inc., Chicago, IL) foi utilizado para todas as análises.

Resultados

Microarrays dos 50 indivíduos que passaram os filtros de controle de qualidade foram incluídos neste estudo. Os dados demográficos e clínicos destes pacientes (30 pacientes com estágio avançado NSCLC e 20 HC), são apresentados na Tabela 1. Foram observadas diferenças significativas entre os pacientes e HC em relação à idade, sexo, co-morbidade, e tabagismo . Os pacientes com câncer incluído 9 estágio IIIB AC, 12 estádio IV AC, 5 estágio IIIB SCC, e 4 estágio IV SCC.

genes diferencialmente expressos em PBMC Associated com Tumor Progression

De as sondas de 22,150, 4463 (20.16%) foram transcritos expressos diferencialmente entre grupo de pacientes e o grupo HC usando um teste de Mann-Whitney não emparelhado com um Benjamini-Hochberg FDR de 0,05. Para que a alteração dependente de fase nos níveis de expressão de ARNm a partir de pacientes de fase III B e IV em relação ao grupo HC, um teste de Kruskal-Wallis com Benjamini-Hochberg FDR de 0,05 por um aumento de 1,5 vezes concomitante foi aplicada e 3989 transcritos expressos diferencialmente foram identificados. Além disso, 3,858 destes transcritos intersectada com aqueles encontrados no teste de Mann-Whitney. Usando as categorias de vias funcionais da ferramenta de análise de caminho GeneSpring como os critérios de selecção para posterior validação, os 3858 conjuntos de genes foram então analisadas para anotação funcional ao nível da via. Onze estatisticamente diferentes categorias funcionais foram mapeados, e 70 transcritos de genes (69 genes únicos) envolvidas na secreção, actividade de ADN-topoisomerase, actividade de metiltransferase, de actividade de acetiltransferase de histona, de actividade do factor de crescimento, actividade de tirosina-fosfatase de proteína, metabolismo de lípidos da membrana, a resposta imune inata , a ligação molécula de adesão celular, atividade inibidor metaloendopeptidase, e de citocinas /quimiocinas mediada vias de sinalização foram identificados como assinaturas putativas destas funções (Tabela S2).

genes diferencialmente expressos em PBMC após quimioterapia de combinação com CDDP e GEM em Câncer pacientes

para avaliar os efeitos da quimioterapia em células imunes periféricas, perfis de expressão gênica nos dezessete pacientes que completaram pelo menos quatro cursos de CDDP e GEM tratamento foram comparados antes e após a quimioterapia utilizando o teste Mann-Whitney U para emparelhado observações (p 0,05), e a expressão diferencial de transcritos de 3576 foi identificada. Além disso, um total de 669 transcrições foram cruzaram entre transcritos diferencialmente expressos em casos emparelhados sobre a quimioterapia e os 3858 transcritos identificados com especificidade para o cancro /staging. Usando a ferramenta de análise de caminho em GeneSpring GX, nove categorias funcionais foram mapeados e 62 transcritos do gene (59 genes originais) que envolvem a resposta imune inata, a produção de citocinas, processo baseado em microtúbulos, atividade transmembrana transportador de cátion orgânico, via secretora, topoisomerase de ADN (ATP -hydrolyzing), actividade de histona metiltransferase, actividade de acetiltransferase de histona, e a actividade de fosfatase de tirosina de proteína foram identificados a partir deste conjunto de 669 transcritos do gene (Tabela S3). Seis genes com expressões mais elevadas com a progressão do tumor mostrou expressões ainda mais após a quimioterapia:

proteína de secreção rica em cisteína 3

(

CRISP3

; proteína de resposta imune inata),

transdutor de sinal e ativador de transcrição 1 | (

STAT1

; citocina e mediador de sinalização do receptor do factor de crescimento),

família portadora de soluto 22 Estados-4

(

SLC22A4

; transporter ergothioneine),

sinapsina II, transcrito variante IIa

(

SYN2

; transmissão sináptica),

derivado do cérebro fator neurotrófico

(

BDNF

; factor de crescimento para a sobrevivência e diferenciação de neurônios e transmissão sináptica),

potássio grande condutância do canal de cálcio activada, subfamília M, membro do alpha 1 | (

KCNMA1

; transmissão sináptica, ciclo celular e migração celular). Notavelmente,

S100A15

(também chamado

S100A7A;

maturação epidérmica e defesa antimicrobiana) foi regulada com a progressão do tumor e reverteu ao normal após a quimioterapia

interleucina 4 (IL4. ) Pathway

Nós encontramos 69 genes a ser significativamente diferencialmente expressos entre os pacientes e controles saudáveis, e 59 genes diferencialmente expressos após a quimioterapia. Para investigar se os genes foram diferencialmente expressos em estágio avançado NSCLC e com quimioterapia em vias comuns, estudamos sua conectividade utilizando a ferramenta de análise de caminho GeneSpring. O

IL4

pathway foi significativamente enriquecida em ambas as assinaturas de progressão do tumor e quimioterapia. Entre os 49 genes envolvidos na via de IL4, 11 genes únicos (12) os transcritos do gene expresso diferencialmente foram entre os pacientes e controlos normais, e 16 genes únicos (19) os transcritos do gene expresso diferencialmente foram antes e após a quimioterapia. A intersecção de ambas as comparações resultou em 7 genes únicos (Figura 1 e Tabela 2). Notavelmente,

quimiocinas CXC receptor motivo 4

(

CXCR4

; receptor de quimiocina proteína G 7-transmembranar para

CXCL12

) foi regulada, e

proteína de ancoragem 2

(

DOK2

; o substrato da chmeric p210bcr /ABL oncoproteína) e receptor

interleucina 2, gama

(

IL2RG

; receptor de interleucina cadeia gama comum para

IL2, IL4, IL7, IL9, IL15

, e

IL21

) foram regulados negativamente com a progressão do tumor, enquanto expressões destes três genes alterados no sentido oposto, após a quimioterapia. Por outro lado,

fosfolipase C, gama 1 | (

PLCG1

; factor de troca do nucleótido guanina para GTPase nuclear),

Phosphoinositide-3-quinase, catalítica, delta polipéptido

(

PIK3CD;

atividade autofosforilação), e

a proteína quinase C, zeta

(

PRKCZ

; isozima atípico da serina-treonina proteína quinase C), que apresentaram diminuição expressões com a progressão do tumor foram mais para baixo-regulado com quimioterapia, enquanto que

STAT1

que mostrou uma expressão aumentou com a progressão do tumor foi ainda mais up-regulada com quimioterapia.

Onze dos 49

IL4

genes envolvidos-pathway foram mapeados na análise de enriquecimento caminho para os 3.858 transcritos diferencialmente expressos em PBMC em pacientes com câncer avançado de não pequenas ell do pulmão (NSCLC) e controles normais, enquanto que 16 genes únicos foram mapeados para os 669 transcritos diferencialmente expressos em PBMC de doentes com NSCLC em estágio avançado antes e após a quimioterapia. Sete genes de interseção entre os dois conjuntos de gene foram identificados e apresentados de um diagrama de Venn. O círculo azul indica diferencialmente expressos genes associados com a progressão do tumor exclusivamente, o círculo vermelho com a quimioterapia apenas, eo círculo roxo com ambos os efeitos.

padrões de expressão distintos em todo Estágios tumorais e histopatológicos subtipos

Para esclarecer melhor os efeitos de ambos estágio do tumor e subtipos histopatológicos sobre as assinaturas genéticas de PBMC, genes diferencialmente expressos foram agrupados por meio de um algoritmo de agrupamento hierárquico com um método de ligação média e distância euclidiana métrica na GeneSpring GX. A Figura 2 mostra dois agrupamento hierárquico dimensional de todos os pacientes com câncer e HC com base nos 73 genes que foram diferencialmente expressos entre estágio IIIB AC, estágio IV AC, estágio IIIB SCC, estágio IV SCC, e HC. Cluster 0 foi caracterizado por expressões ricos em estágio IIIB AC, estágio IV AC, estágio IIIB SCC, e uma expressão semelhante em SCC IV fase, quando comparado com HC, com uma expressão de pico no estágio IV AC. Este padrão foi observado em 19 dos 73 genes. Cluster 1 foi caracterizado por expressões ricos em estágio IIIB AC, estágio IV AC, estágio IIIB SCC, e estágio IV SCC, quando comparado com HC, e uma expressão de baixo no estágio IIIB SCC sozinho quando comparado com o estágio IV AC, com uma expressão pico em estágio IV AC. Este padrão foi observado em 16 dos 73 genes. Cluster 2 foi caracterizado por expressões ricos em estágio IIIB, estágio IV AC, e estágio IV SCC, e uma expressão semelhante em estágio IIIB SCC, quando comparado com HC. Este padrão foi o mais comum e visto por 20 dos 73 genes. Cluster 3 também foi caracterizado por expressões ricos em estágio IIIB, estágio IV AC, e estágio IV SCC, e uma expressão semelhante em estágio IIIB SCC, quando comparado com HC, mas uma maior intensidade de expressão gênica relativa em cada gene em comparação com o que, em conjunto 2. Este padrão foi observado em 18 dos 73 genes (Tabela S4). Entre estes 73 genes, dez sobreposto com os 69 genes identificados na comparação entre estágio IIIB /IV doentes com cancro e os controles saudáveis:

transforming growth factor beta 2

(

TGFB2

; modulação da proliferativa atividade, diferenciação celular e desenvolvimento embrionário),

inibina beta e

(

INHBE

; função apoptótica),

factor de plaquetas 4

(

PF4;

regulação do tráfico de leucócitos),

v-kit Hardy-Zuckerman 4 do sarcoma felino oncogene viral homólogo

(

kIT;

hematopoiéticas manutenção, crescimento e diferenciação),

tirosina proteína do tipo receptor fosfatase N

(

PTPRN;

hormonal e neuropeptídeo secreção),

Phospholipid scramblase 4

(

PLSCR4;

movimento transbilayer de fosfolipídios através da membrana plasmática),

integrina beta 8

(

ITGB8;

activação de TGF-beta),

S100A15

,

Complemento componente 1 q cadeia subcomponente C

(

C1QC;

desencadear a via clássica do complemento e aumentar a fagocitose) e

CRISP3

.

(a) de agrupamento hierárquico de pacientes com câncer de pulmão de células recém diagnosticado estágio avançado de não pequenas (n = 30) e controles saudáveis ​​(n = 20) de acordo com a expressão dos 69 genes diferencialmente expressos entre estágio IIIB adenocarcinoma (AC), estágio IV AC, estágio IIIB carcinoma de células escamosas (SCC), estágio IV SCC, e controles saudáveis ​​(HC). Os dados são apresentados num formato de matriz: cada linha representa um gene no micro-arranjo e a cada coluna um subgrupo de amostras de mRNA. As proporções de hibridação de sondas de ADNc fluorescentes foram uma medida da expressão genética relativa em cada amostra experimental de uma amostra de ARNm de referência, e são representados de acordo com a seguinte escala de cor: vermelho indica um elevado nível de expressão; azul, baixo nível de expressão; e amarelo, o nível médio de expressão. (B) os valores de expressão de genes medianos normalizado para cluster de 0-3 genes em cinco categorias temáticas (estágio IIIB AC, estágio IIIB SCC, estágio IV AC, estágio IV SCC, HC). Note-se que o cluster 1 genes mostraram expressões mais elevados em todos os pacientes com câncer de pulmão em comparação com o HC. Cluster 0 genes mostraram expressões semelhantes em SCC IV palco e HC. Ambos os clusters 2 e 3 genes mostraram expressões semelhantes em estágio IIIB SCC e HC. Os diagramas de caixa mostram a 25

th, 50

th e 75

th percentis, máximo e mínimo.

A confirmação dos resultados Microarray usando TaqMan em tempo real RT -PCR

para confirmar os resultados obtidos com as micromatrizes, os níveis de expressão de seis dos genes diferencialmente expressos em relação ao cancro do pulmão ou quimioterapia fase avançada do tratamento foram avaliados por um método independente da quantificação de ARN, real TaqMan tempo de RT-PCR, usando as mesmas amostras de ARN que foram utilizadas para a análise de micro-arranjo. As comparações dos níveis de expressão relativa de tempo real quantitativa de RT-PCR para detectar a 4 genes que foram sobre-regulada (

S100A15

, p = 0,001, Figura 3A;

DOK2

, p 0,001 , Figura 3B) ou regulada para baixo (

toll-like receptor 7

(

TLR7

; imunidade inata), p 0,001, Figura 3C;

topoisomerase I mitocondrial

(