Abstract

A detecção de mutantes raros usando próxima sequenciamento geração tem um potencial considerável para aplicações de diagnóstico . Detecção de ADN de tumor circulantes é a aplicação mais importante desta abordagem. O principal obstáculo à sua utilização é a alta taxa de erro de leitura de seqüenciadores de nova geração. Em vez de aumentar a precisão das sequências finais, que detectado mutações raras utilizando um sequenciador de semicondutor e um conjunto de critérios de detecção de anomalias com base num modelo estatístico da taxa de erro de leitura em cada posição de erro. Modelos estatísticos foram deduzidas a partir de dados de sequência a partir de amostras normais. Detectamos receptor do factor de crescimento epidérmico (

EGFR

) mutações no DNA no plasma de pacientes com câncer de pulmão. Single-pass sequenciamento profundo ( 100.000 leituras) foi capaz de detectar um ativando alelo mutante em 10.000 alelos normais. Confirmou-se o método usando 22 prospectivo e 155 amostras retrospectivos, consistindo principalmente de ADN purificado a partir de plasma. A análise temporal sugeriu aplicações potenciais para a gestão da doença e para decisão terapêutica fazer para seleccionar inibidores do receptor tirosina quinase fator de crescimento epidérmico (EGFR-TKI).

Citation: Kukita Y, Uchida J, Oba S, Nishino K, Kumagai T, Taniguchi K, et al. (2013) Quantitative Identificação dos mutantes alelos Derivados de câncer de pulmão em DNA-Free Cell Plasma via Anomaly Detection Usando profundo Seqüenciamento de Dados. PLoS ONE 8 (11): e81468. doi: 10.1371 /journal.pone.0081468

editor: Raya Khanin, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de março de 2013; Aceito: 13 de outubro de 2013; Publicação: 21 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kukita et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações de Osaka Medical Center para o câncer e doenças cardiovasculares. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

para alguns medicamentos direcionados moleculares contra o câncer, o exame das alterações genômicas em genes alvo tornou-se uma rotina de diagnóstico e é indispensável para as decisões de tratamento. Por exemplo, os fortes efeitos de inibidores da tirosina cinase do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR-TKI; ou seja, gefitinib e erlotinib) no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), está correlacionada com a activação de mutações somáticas no

EGFR

[1,2]. Os pacientes que são administrados estas drogas são actualmente seleccionado com base na presença destas mutações de activação. A identificação das mutações é baseada em amostras de biópsia; o procedimento é invasivo e muitas vezes difícil de realizar. Um procedimento de diagnóstico não invasivo é desejável.

DNA livre de celular no sangue consiste de DNA derivadas de tecidos de câncer e tem sido estudada para procedimentos de diagnóstico não invasivos [3]. Este DNA, denominada ADN de tumor (ctDNA) circulante, é rara no sangue, e a sua detecção é um desafio técnico. Um número de métodos têm sido examinados, mas a maior parte deles têm limitações em termos de sensibilidade e robustez. Radiante (grânulos, emulsão, amplificação e magnetismo) [4] é provavelmente o método mais sensível. Em radiante, os produtos de PCR amplificados a partir de uma única molécula são fixos a uma única pérola magnética usando emulsão de PCR. O sítio de mutação é marcado com uma sonda fluorescente ou extensão do iniciador, e o alelo mutado é quantitativamente detectados por contagem das pérolas marcadas com fluorescência. Radiante quantificado com sucesso

APC

e

KRAS

mutações no ctDNA de pacientes com câncer colorretal [5,6] e

EGFR

mutações no ctDNA de pacientes com câncer de pulmão [7] . Apesar de sua alta sensibilidade e capacidade de quantificação, radiante não ganhou popularidade porque é uma tecnologia trabalhoso e requer oligonucleotídeos para cada posição de mutação.

Porque radiante e seqüenciadores de nova geração, isto é, maciçamente sequenciadores paralelas, use a mesma ou uma técnica de preparação modelo muito semelhante, é possível aplicar seqüenciadores de nova geração para a mesma finalidade. Houve vários estudos sobre a profunda sequenciamento do DNA livre de células [8,9]. Estes estudos sugeriram a possibilidade da abordagem, mas faltava avaliação crítica dos sistemas de detecção. Em particular, eles não abordou o problema de testes múltiplos, que é inerente para aplicações de diagnóstico.

Neste relatório, nós estabelecemos um método de detecção

EGFR

mutações em ctDNA no sangue periférico de pacientes com câncer de pulmão usando single-pass profunda sequenciamento de amplificados

EGFR

fragmentos . O desenvolvimento recente de um sequenciador de semicondutores (Ion Torrent PGM) [10] abordou as deficiências dos outros sequenciadores actualmente disponíveis (isto é, um longo tempo de execução para um único ensaio e os custos operacionais elevados) e é aplicável para fins de diagnóstico. Nós aplicamos a detecção de anomalias [11,12] e determinou um conjunto de critérios de detecção com base em um modelo estatístico da taxa de erro de leitura em cada posição de erro. O método quantitativo detectado

EGFR

mutações no DNA livre de células a um nível comparável ao radiante, prometendo diagnósticos não invasivos que complementam biópsia.

Resultados

Princípio de detecção

sequenciamento profundo de um fragmento amplificado por PCR contendo um local de mutação pode ser realizado para detectar e quantificar alelos mutados entre as vastas quantidades de alelos normais derivadas de tecidos do hospedeiro. O principal problema associado a esta abordagem é a frequência de erros introduzidos durante a sequenciação e amplificação por PCR. A questão chave aqui é a definição e avaliação rigorosa dos limites de detecção. Quando a frequência de uma mudança de base de um locus alvo é maior do que uma taxa de erro de leitura predeterminado (RER), podemos julgar que a mudança seja devido à presença de uma sequência mutante. Isto é, anomalias que caem significativamente fora da distribuição de RER são considerados mutações. A RER é definida como a taxa de erro calculado a partir de dados de sequências finais, incluindo erros em ambos os passos de PCR e sequenciação. Na detecção de anomalias [11,12], como em testes de hipóteses, os falsos positivos são controlados com base em um modelo estatístico. No nosso caso, o modelo estatístico do RER pode ser construída a partir de dados de sequência a partir das regiões alvo de um número suficiente de indivíduos normais que não levam mutações.

Se ocorrer erros de leitura sob uma distribuição de probabilidade, o número de leituras necessário para atingir um determinado limite de detecção pode ser estimada. Figura 1a mostra a relação entre o limite de detecção da mutação, leia profundidade e RER em um nível de significância de p = 2×10

-5 para cada detecção individual sem correção multiplicidade, assumindo que erros de leitura ocorrem após uma distribuição de Poisson. Os dados ilustrados na Figura 1a são fornecidos na Tabela S1. Com uma profundidade crescente e decrescente leitura RER, o limite de detecção diminui. Em um estudo anterior pelo nosso grupo [7], o limite de detecção para alelos mutantes raros quando se utiliza radiante [4] era de 1 em 10.000 (0,01%). Uma vez que uma amostra de ensaio de ADN de plasma contém aproximadamente 5000 moléculas, este limite de detecção é razoável. Este objectivo pode ser atingido com 100.000 leituras quando o RER é inferior a 0,01%.

a, Relação entre a taxa de erro de leitura, leia profundidade e limite de detecção de mutações quando o nível de significância é p = 2×10

-5. eixo horizontal, profundidade ler; eixo vertical, limite de detecção (%). De cima para baixo, cada linha indica uma taxa de erro de leitura (RER) de 1%, 0,2%, 0,05%, ou 0,01%. b, a representação tridimensional de RER substituição. X-eixo, as posições de bases de EGFR exões 19-21. Da esquerda para a direita, as setas indicam as posições de T790M, L858R e L861Q. eixo y, 48 amostras de DNA de indivíduos normais. De frente para trás, as conversões para A (verde), C (amarelo), G (magenta) ou T (azul) estão alinhadas para cada amostra. eixo z, RER (%). C, a representação tridimensional do erro de inserção /deleção. X-eixo, as posições de bases de EGFR exões 19-21. A barra indica a posição da delecção do exão 19. eixo y, 48 amostras de DNA de indivíduos normais. , DNA plasmático azul; luz azul, DNA WBC (grande quantidade); azul escuro, DNA WBC (pequena quantidade). eixo z, RER (%). d, Distribuição do RER. Coluna branca, erro de substituição; coluna de cinzas, inserção /erro de exclusão. eixo horizontal, a gama de RER (%); eixo vertical, a incidência (%).

Leia erro do

EGFR e região-alvo

Para o tratamento de EGFR-TKI, um activador

EGFR

mutação é indicativo de tratamento eficácia [ ,,,0],1,2]. Os pacientes a serem administradas essas drogas são actualmente seleccionado com base na presença destas mutações de activação. Além de ativar

EGFR

mutações, um resistente à

EGFR

mutação conhecida como T790M aparece em aproximadamente metade dos pacientes submetidos ao tratamento EGFR-TKI [13,14]. Assim, três mutações ativadoras, ou seja, uma deleção no

EGFR

exão 19 e L858R e L861Q em

EGFR

exão 21, bem como a mutação resistente T790M no

EGFR

exão 20 foram seleccionados como loci alvo.

Foram determinadas as RERs em uma região 169 de base ao redor do loci alvo constituído através da realização de profundas seqüenciamento de amostras de DNA de indivíduos normais. Usamos um sequenciador Ion Torrent PGM [10] para este trabalho. Single-pass sequenciamento foi realizado, e o número de leituras variou de 44.400 a 373.000, com média de 162.000. Utilizou-se três tipos de amostras de ADN: As amostras de ADN 19 de plasma com quantidades comparáveis ​​com as amostras dos pacientes, 16 de leucócitos (glóbulos brancos, WBC) amostras de DNA com valores que foram de 10 ou 50 vezes o tamanho da amostra de um paciente, e 13 de ADN de WBC as amostras com quantidades que eram um décimo do tamanho de amostra de um paciente. Nós dividido em quatro erros de substituição padrões, o que corresponde à conversão de A, C, G ou T. Assim, havia 507 possíveis tipos de substituições (169 posições de bases x 3 padrões) na região alvo. A RER substituição é graficamente demonstrado na figura 1b, excluindo a conversão de G para A na posição 2361, devido a um SNP frequente. Os RER de substituição não são uniformes, nem são independentes um do outro, e elevados RER estão associados com as posições de bases específicas. Além disso, um padrão de substituição é dominante em cada posição de base. Um RER inserção /deleção é graficamente mostrado na Figura 1c. Nós não distinguir entre erros de deleção e de inserção, como inserções são frequentemente reconhecidas como deleções e vice-versa, o software de alinhamento de sequências. A RER inserção /deleção é geralmente maior do que o RER substituição. Uma tendência semelhante à de substituição é observada, em que a alta inserção /deleção RER estão associados com as posições de bases específicas. A Figura 1D apresenta a distribuição dos RER. Houve diferenças substanciais entre a substituição e RERs inserção /deleção. Em 410 fora dos 506 possíveis tipos de substituição (81,0%), o RER era inferior a 0,01%. Em contraste, para fora dos 169 tipos de inserções /exclusão, o RER foi menor do que 0,01% em apenas 79 (46,7%). Estes resultados concordaram com as observações previamente relatados a partir da plataforma PGM [15]. Os dados ilustrados nas Figuras 1B e 1C são fornecidos nas Tabelas S2 e S3, respectivamente.

Devido à alta de inserção /deleção erros de leitura, utilizamos um método específico para detectar os exon 19 mutações de deleção. Preparamos oito template exão 19 sequências com deleções representativos e rastreadas as sequências de deleção, combinando-os com as sequências molde. Este método foi bastante eficaz para a triagem de erros de leitura; há sequências com erros de exclusão leia foram encontrados entre as 48 amostras testadas.

Os modelos estatísticos de taxas de erro de leitura e critérios para a detecção de anomalias

Em seguida, examinou modelos estatísticos de erro de leitura. Em um modelo de distribuição de Poisson, a média e variância do número de casos se espera que sejam o mesmo e são determinadas pelo parâmetro de intensidade

lambda. Aqui, em vez de usar o RER, a incidência erro de leitura foi apresentado como a incidência de 100.000 leituras, e sua média e variância em cada posição de base foram calculados. As relações entre a média e variância são mostrados na Figura 2a e a Figura S1 S1 do ficheiro para a substituição e de inserção /deleção erros de leitura, respectivamente. Em ambos os casos, a variância torna-se maior do que a média de uma proporção considerável dos casos. Nestes casos, a aplicação da distribuição de Poisson conduziria a um aumento do número de falsos positivos. Este fenómeno, designado “superdispersão”, é comum em estudos biológicos, e em tais casos, uma distribuição binomial negativo é aplicado [16]. Superdispersão é devido às flutuações do parâmetro de intensidade, e é racional assumir que o parâmetro de intensidade segue uma distribuição gama. Sob este cenário, o número de incidência teoricamente segue uma distribuição binomial negativa. Na Figura 2b, o aumento do limiar para a substituição de um de Poisson para uma distribuição binomial negativo é representada em função da razão de variância /média do erro de leitura para os tipos de substituição cuja variância /rácio médio variou de 1 a 2. Quando a relação excedido cerca de 1,2-1,4, houve aumentos substanciais no limiar. Assim, construímos o nosso modelo estatístico de cada substituição sob os seguintes critérios.

a, Relação entre a média e variância do erro de substituição apresentado como o número por 100.000 leituras. eixo horizontal, médio; eixo vertical, variância. A linha vermelha indica onde a média e variância são iguais. b, diferença entre os limiares calculados de acordo com uma distribuição binomial negativa e uma distribuição de Poisson. O limite é o número mínimo de alterações de bases em 100.000 leituras satisfazer o nível de significância estatística (p-0,01). eixo horizontal, variância rácio /média da substituição erro de leitura; eixo vertical, diferença entre os limiares. Os tipos de substituições cuja variância /rácio médio variou de 1 a 2, são representados graficamente. c, Precisão de quantificação. Cada ponto de dados representa a média de três ensaios. eixo horizontal, fração de alelos mutantes em produtos artificiais; eixo vertical, fração de alelos mutantes estimados a partir de sequenciamento de profundidade. d, reprodutibilidade de quantificação. eixo horizontal, a taxa de mudança de base no primeiro julgamento; eixo vertical, a taxa de mudança de base no segundo julgamento.

1. Quando o erro médio de leitura em 100.000 leituras era inferior a 1, com uma distribuição de Poisson a λ conjunto 1 foi aplicada (169 tipos de substituições).

2. Quando a média foi maior do que 1 e a razão de variância /média do erro de leitura era inferior a 1,2, uma distribuição de Poisson foi aplicado (15 tipos de substituições).

3. Quando a média foi maior do que 1 e a razão de variância /média do erro de leitura foi maior do que 1,2, uma distribuição binomial negativo foi aplicada (323 tipos de substituições).

O exão 19 exclusão e L858R pertencia à primeira categoria, enquanto os locais de mutação L861Q e T790M pertenciam à segunda e terceira categorias, respectivamente. Os limites de detecção para o exão 19 e a eliminação L858R, L861Q, e mutações por substituição de T790M em um nível de significância de P = 2×10

-5 eram menos do que 0,01% e menos de 0,01%, 0,01% e 0,05%, respectivamente . Na análise a seguir, usamos p = 2×10

-5 como o limiar de significância para cada única detecção, sem considerar a correção multiplicidade, esperando um falso positivo em 50.000 amostras.

O esboço do método é 1) amplificação do

EGFR

fragmentos com primers específicos de exão de DNA plasma; 2) de profundidade sequenciação do

EGFR

fragmentos com PGM ( 100.000 lê /fragmento), combinando os produtos de PCR; 3) coincidindo com as sequências de saída com

EGFR

sequências molde; 4) a detecção de deleções e substituições, e conversão de número de eventos em que, em 100.000 lê; e 5) a avaliação das mudanças de base com os critérios de detecção de anomalia. Na detecção de anomalias, as alterações de bases são julgados como mutações, quando o número de eventos em 100.000 lê é igual a ou excede o valor limiar (exão 19 deleção, 7; L858R, 7; L861Q, 12; T790M, 60). Uma representação esquemática é mostrado na Figura S2 em S1 Arquivo.

Quantitativity e reprodutibilidade

Primeiro, examinamos a capacidade de quantificação do método. Nós preparamos amostras de teste, incluindo várias fracções de produtos de PCR de mutantes

EGFR

fragmentos. Houve uma muito boa linearidade (

r

= 0,998) entre os valores inoculados dos produtos de PCR e as proporções observadas mutante do normal alelo deduzidas a partir de sequenciamento de profundidade (Figura 2c). Em seguida, examinou a reprodutibilidade do método usando amostras de plasma de doentes com cancro de pulmão cujo lesões primárias foram confirmados para realizar mutações de activação. As fracções dos alelos mutantes medidos em dois ensaios estão representados na Figura 2D. Uma elevada concordância (

R

= 0,989) foi observada, excepto nas amostras que continham pequenas quantidades dos alelos mutantes, o que corresponde a uma fracção de cerca de 0,3% dos alelos presentes ou menos. Nestes casos, a fase inicial da amplificação por PCR foi provável que seja bem sucedido devido ao baixo número de modelos de mutantes, estimado em 15 cópias ou menos. Assim, o limite de quantificação foi de cerca de 0,3%.

Validação com amostras de pacientes com câncer de pulmão

Nós ainda avaliada nosso método utilizando amostras de biópsia de câncer de pulmão, a amostragem de DNA no plasma e da lesão primária, simultaneamente, como parte de um estudo prospectivo. Os resultados para as amostras de 22 pacientes mostrou 86% de concordância (95% de intervalo de confiança, 66-95), 78% (44-93) de sensibilidade, e 92% (66-98) especificidade, definindo a biopsia de tecido como o padrão. Estes resultados são promissores no que diz respeito ao desenvolvimento de uma ferramenta de diagnóstico para complementar a biópsia do cancro do pulmão.

Em seguida, analisamos um total de 155 amostras: 144 amostras de plasma, oito de líquido cefalorraquidiano, e cada um a partir da urina, derrame pleural, e lavagem alveolar bronquial. Como para as amostras de plasma, duas ou mais amostras foram obtidas de 32 pacientes em diferentes pontos de tempo dos cursos da doença. Todos os dados obtidos são mostrados na Tabela S4. Os dados clínicos dos pacientes, incluindo estágio, histologia, tratamento e status da resistência ao EGFR-TKI também são listados nesta tabela. Entre os 33 pacientes associados com a lesão primária contendo a deleção do exão 19, esta mutação foi encontrada em pelo menos uma das amostras de plasma de 24 pacientes (72,7%). Dos 23 pacientes para os quais as lesões primárias exibiram o L858R L861Q ou substituições, estas mutações foram encontradas em, pelo menos, uma das amostras de plasma de 18 pacientes (78,2%). Uma mutação dupla (detecção simultânea do exão 19 exclusão e L858R) foi observada em 12 amostras de plasma, embora mutações duplas não são freqüentes em amostras de biópsia. Discrepâncias entre os tipos de mutação de ativação identificados em amostras de biópsia e de DNA no plasma foram observados em cinco amostras de plasma. T790M foi encontrado em 13 dos 57 amostras de plasma (22,8%) de pacientes com resistência EGFR-TKI, e em 7 de 87 amostras de plasma (8,0%), sem resistência EGFR-TKI.

Mudanças temporais de

EGFR

níveis de mutação durante o curso da doença

Um número considerável de amostras foram coletadas a partir do mesmo paciente em momentos diferentes no curso da doença. Variações temporais de

EGFR

níveis de mutação no ADN de plasma de pacientes com três ou mais amostras são esquematicamente mostradas na Figura 3. Devido ao período de amostragem relativamente curto, as amostras foram obtidas a partir de apenas uma parte do curso da doença na maioria dos casos . Estamos focados em duas transições: a transição devido ao EGFR-TKI o início do tratamento e que depois de adquirir resistência EGFR-TKI. Dados antes do início do tratamento foi obtida em seis casos. Um decréscimo significativo na activação de níveis de mutação com o tratamento foi observada em todos os casos (p = 1,7×10

-4). Apuramento das ctDNA pelo início do tratamento é um fenômeno geral.

Cada ponto representa um ponto de tempo de amostragem. O diagrama não é uma representação precisa da escala de tempo, e apenas a ordem de pontos é uma informação válida. Números representam

EGFR

mutações em 10.000 sequência lê: preto, exão 19 exclusão; azul, L858R; vermelho, T790M. Somente figuras que excedam os limites são mostrados. “Tipo de mutação” indica que nas amostras de biópsia.

Os dados foram obtidos ambos antes e depois de adquirir resistência EGFR-TKI em sete casos. Após a aquisição de resistência, o nível de activação de mutação foi aumentada em cinco pacientes (218, 226, 259, 61, 66), diminuindo em um paciente (44), e aumentou com o atraso no outro paciente (178). Aumento da activação de mutações pode estar correlacionada com a progressão da doença. Apesar da clara correlação entre T790M eo status EGFR-TKI resistência no estudo de validação acima, dinâmica de T790M durante o curso da doença não era tão clara como a de activação de mutações; T790M muitas vezes apareceu antes de adquirir resistência.

Três pacientes são descritos em mais detalhes. Paciente 226 foi tratado com gefitinib como quimioterapia de primeira linha. O tratamento com gefitinib foi interrompido várias vezes devido a efeitos adversos. Uma resposta radiológica (resposta parcial, RP) foi observada a partir de mês de 1 a meses 9, e a progressão da doença foi observado no mês 10. Antes do tratamento com gefitinib, a fracção do alelo mutante foi muito alta ( 50%), mas depois apenas uma semana deste tratamento, a fracção do alelo mutante diminuiu para 0,3%, antes de quaisquer alterações radiográficas (Figura S3A no ficheiro S1). T790M apareceu em 10 meses, quando a progressão da doença começou. Paciente 243 também exibiram uma diminuição enviesada na fracção alelo mutante no início do tratamento com gefitinib (Figura S3B no ficheiro S1). Esta paciente foi tratada com a cirurgia e quimioterapia adjuvante (CDDP mais VNR) anteriormente, e, em seguida, submetido a gefitinib. Paciente 41 apresentado com a progressão da meningite neoplásica, e foi submetido a terapia combinada erlotinib-pemetrexed. tratamentos anteriores foram CDDP mais gemicitabine, gefitinib e erlotinib. Uma resposta radiológica menor foi observado a partir de 1-4 meses, e a progressão da doença ocorreu posteriormente. Houve uma diminuição enviesada na fracção alelo mutante no início da terapia, e o aumento após a progressão da doença foi apenas ligeira (Figura S3C no ficheiro S1). Deve notar-se que o respose de ctDNA a EGFR-TKI início do tratamento foi rápida em todos os três casos (paciente 229, uma semana; 243, 41; duas semanas, um mês).

detecção de mutação em toda a região-alvo

Nós exploramos a possibilidade de identificar mutações de substituição em todo o alvo

EGFR e região correspondente a 503 tipos de substituições, excluindo L858R, L861Q , e T790M. Porque o nível de significância foi estabelecido em p = 2×10

-5 para cada detecção, eram esperados falsos positivos para aparecer uma vez em 100 amostras. Na realidade, uma média de três substituições foram encontrados por amostra. A distribuição do número de substituições por amostra é mostrado na Figura 4a. Com base na experiência adquirida com as amostras de biópsia, a maioria dessas substituições eram susceptíveis de ser falsos positivos. Uma fracção considerável dos diferentes tipos de substituições apresentados sem falsos positivos (56,2%, Figura 4B), e os modelos estatísticos eram de uso prático com estes tipos de substituições. Para outros, a estimativa de parâmetros a partir dos dados de 48 indivíduos normais não foi suficientemente conservador para a exclusão de falsos positivos.

a, Distribuição do número de diferentes tipos de substituições julgado como mutações por amostra. eixo horizontal, o número dos tipos de substituições; eixo vertical, o número de amostras. b, A distribuição do número de amostras com um tipo de substituição julgado como uma mutação. eixo horizontal, o número de amostras com um tipo de substituição julgado como uma mutação; eixo vertical, o número dos tipos de substituições.

Discussão

detecção da mutação rara de loci alvo através da profunda sequenciamento do DNA livre de células de plasma tem uma sensibilidade comparável a radiante. A especificidade também é aceitável porque o

EGFR

tipos de mutação em amostras de biópsia e plasma exibiram uma alta concordância. Assim, a detecção de mutação rara, com a sequenciação profunda chegou agora a um nível suficiente para proceder à confirmação através de um estudo prospectivo. O método pode ser aplicado a um número limitado de loci alvo em qualquer posição da base; usando o método par-fim ou a sequenciação a partir da direcção oposta iria aumentar a precisão de posições de taxa de erro elevada, aumentando a sensibilidade e especificidade para níveis aceitáveis.

No entanto, é difícil estender a detecção de mutações de uma região maior. A incidência de falsos positivos não é aceitável para as aplicações de diagnóstico. estimativa de parâmetros com o aumento do número de amostras normais e /ou mais métodos de estimação conservadores, como inferência Bayesiana, pode diminuir falsos positivos. Nós usamos DNA livre de mutação de indivíduos normais para o levantamento de erro de leitura, mas a detecção de mutações foi realizada com DNA plasma de pacientes com câncer de pulmão. Uma possível causa dos limiares inadequadas pode ser a diferença na qualidade do DNA. A recente descoberta de mutações artifactual introduzidas durante os processos experimentais [17] sugere a possibilidade de causas desconhecidas de artefactos ainda usando amostras de plasma.

Nosso procedimento é otimizado para os nossos objetivos e ambiente social, mas há espaço para melhoria técnica. Em adição ao método de gama emparelhado [9], os métodos para produzir sequências livres de erros, através da sequenciação repetida de modelos a partir de uma única molécula [18,19] pode ser aplicado para melhorar a precisão. Nós empregamos pequenas quantidades de DNA no plasma para a amplificação PCR devido aos padrões éticos de nosso hospital e os hospitais regionais relevantes. No entanto, num ambiente social diferente, utilizando uma maior quantidade de ADN no plasma pode melhorar a reprodutibilidade da detecção de mutações de baixo nível.

Para além de ser aplicado para o diagnóstico não invasivo de

EGFR

mutações, como se mostra nas análises temporais acima, este método também é informativa para elucidar a dinâmica de alelos mutantes durante o curso da doença. Em particular, deve notar-se que uma diminuição enviesada na fracção alelo mutante precedida alterações radiológicas, que provavelmente serão úteis para a previsão da eficácia da droga.

As biópsias de casos avançados e biópsias repetidas são tecnicamente exigente, e substituição por um método não-invasivo seria benéfica. Neste contexto, o acompanhamento T790M com o nosso método teria benefícios substanciais para a gestão paciente. Por exemplo, a detecção da mutação T790M em amostras de sangue seria útil para a selecção de doentes para o tratamento com a nova EGFR-TKI para os cancros do pulmão que são resistentes a tratamento com gefitinib e erlotinib [20].

Recentes estudos sugerem duas outras possibilidades de análise ctDNA. Dawson et ai. seguido a dinâmica de ctDNA em pacientes com câncer de mama metastático com mutações em

TP53

e /ou

PIK3CA

, e encontrou seu mérito para monitorar a progressão da doença [21]. Uso de mutações podem permitir a sua aplicação a uma grande variedade de tumores. Pelo contrário, o foco de pesquisa é mais específico, isto é, detecção de mutação para a tomada de decisão terapêutica, embora o nosso método também pode ser aplicado para o seu fim. Murtaza et ai. realizada sequenciação exome utilizando ADN do plasma de pacientes com cancro [22], Análise dos genomas do cancro em qualquer fase do curso da doença pode revelar alterações genéticas que conduzem à progressão da doença ou resistência a drogas. Análise de ctDNA terá um valor profundo em aspectos científicos e de diagnóstico de pesquisa do câncer.

Materiais e Métodos

As características dos pacientes

Os pacientes com mutações ativadoras do EGFR em tecidos tumorais foram recrutados em Osaka Medical Center para o cancro e as doenças cardiovasculares. amostras de líquido pleural, líquido cefalorraquidiano e /ou urina foram coletadas de alguns pacientes. Em todos os pacientes, a activação

EGFR

mutações foram encontradas em amostras de biopsia utilizando o método de fixação de PNA-LNA de PCR [23]. A resposta à terapia e a progressão da doença foi avaliada, principalmente, a partir de dados radiológicos com base nos critérios RECIST [24].

extracção de ADN a partir de amostras de líquido

O plasma foi preparado por centrifugação de 4-5 ml de sangue tratado com EDTA em 800

g

durante 10 min à temperatura ambiente. O plasma foi transferido para um tubo fresco e re-centrifugado a 15.100

g

durante 10 min à temperatura ambiente. Após centrifugação, o plasma superior foi transferida para um tubo fresco. As amostras de fluido e de urina pleurais foram centrifugadas a 800

g

durante 10 min à temperatura ambiente, e os sobrenadantes foram transferidos para tubos frescos. amostras de líquido centrifugado foram congeladas a -80 ° C até à extracção de ADN. líquido cefalorraquidiano foi congelado sem centrifugação. O DNA foi extraído 1,5-2,0 ml de uma amostra de líquido (ou 5 ml de urina) utilizando o QIAamp kit de ácido nucleico (Qiagen, Hilden, Alemanha) de circulação de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de ADN foi determinada medindo o número de cópias da Linha-1 [25] ou utilizando o Kit de Ensaio Qubit ADNcs (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).

Amplicon construção da biblioteca e sequenciação profunda

construção da biblioteca Sequencing.

Para amplificar regiões alvo do

EGFR

gene, pares de primers de PCR foram concebidos com Primer3 (https://frodo.wi.mit.edu/). pares de primers têm índices 5-nt (para discriminar indivíduos) e sequências de adaptador para semicondutores-sequenciação. Posições de regiões de PCR-alvo e sequências iniciadoras estão mostradas na Tabela S5. A amplificação por PCR foi conduzida em ADN contendo um plasma de 50 ul de mistura de reacção obtida a partir de 300 ul de plasma (10 ng ou mais), 20 pmol de cada um dos iniciadores e 1 unidade de polimerase KOD ADN -Plus- (Toyobo, Osaka, Japão). Para analisar o erro de leitura, utilizou-se DNA genómico a partir de plasma ou leucócitos de indivíduos saudáveis ​​como um modelo de PCR. O perfil de ciclos foi como se segue: 2 min a 94 ° C para desnaturação inicial, seguido por 40 ciclos de 15 seg a 94 ° C para desnaturação, 30 segundos a 55 ° C para emparelhamento, e 50 segundos a 68 ° C para extensão.

Informações de Suporte

arquivo S1. Figura S2. Figura S3.