Abstract

Fundo

Alpha B-cristalina (CRYAB) é uma proteína que funciona como “chaperones moleculares” na preservação da arquitetura intracelular e membrana celular. Além disso, é altamente CRYAB anti-apoptótica. expressão CRYAB anormal é um biomarcador de prognóstico para o câncer oral, enquanto suas variações genômicas e da associação com a carcinogênese nunca foram estudados.

Metodologia /Encontrar

Portanto, a hipótese de que

CRYAB

polimorfismos de nucleotídeo único pode ser associado com o risco de câncer oral. Neste estudo de base hospitalar, a associação de

CRYAB

A-1215G (rs2228387), C-802G (rs14133) e intron2 (rs2070894) polimorfismos com câncer bucal em uma população de Taiwan foi investigada. No total, 496 pacientes com câncer oral e 992 controles saudáveis ​​pareados por idade e gênero foram genotipados e analisados. A distribuição de frequência significativamente diferente foi encontrado em

CRYAB

genótipos C-802G, mas não em A-1215G e genótipos intron2, entre os grupos e controle do câncer bucal. O

CRYAB

C-802G G alelo conferido um aumento do risco de câncer oral (

P

= 1,49 × 10

-5). Pacientes portadores de CG /GG em

CRYAB

C-802G foram de menor sobrevida em 5 anos e maior taxa de recorrência do que os de CC (

P Art 0,05).

conclusão /Significado

Nossos resultados fornecem a primeira evidência de que o alelo G do

CRYAB

C-802G está correlacionada com o risco de câncer oral e esse polimorfismo pode ser um marcador útil para a recorrência do câncer oral e de sobrevivência previsão para referência clínica

Citation:. Bau DT, Tsai CW, Lin CC, Tsai RY, Tsai MH (2011) Associação de

Alpha B-cristalina

genótipos com cancro oral Susceptibilidade, Sobrevivência, e recorrência em Taiwan. PLoS ONE 6 (9): e16374. doi: 10.1371 /journal.pone.0016374

editor: Songtao Shi, University of Southern California, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de setembro de 2010; Aceite: 18 de dezembro de 2010; Publicação: 07 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Bau et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas de investigação do Conselho Nacional de Ciência (NSC 98-2320-B-039-010-MY3) (https://nscnt12.nsc.gov.tw/RS09/Modules/Personal/Personal_Researcher_index.aspx). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer oral, que é uma das principais causas de morte e desfiguramento em todo o mundo [1] – [4], foi classificado no 4

th câncer na população de Taiwan masculino [5]. Existe uma necessidade urgente de desenvolver marcadores pré-operatória de rotina para poupar pacientes com mau prognóstico após a cirurgia ou outro tratamento e, por outro lado, identificar pacientes em risco de recidiva precoce e justificar esvaziamento profilático e adjuvante radioquimioterapia concomitante, bem como aqueles que poderiam beneficiar a partir de vários tratamentos independentemente da sua dimensão tumoral eo estádio. Aqueles que são identificados com maior risco de recorrência do câncer oral e /ou metástase deve ser detectada mais cedo e seguiu-se com mais frequência para desfrutar de uma vida mais longa com o desenvolvimento de marcadores úteis para a previsão do prognóstico.

Alpha B-cristalina (CRYAB ) é um membro da família de proteínas de choque térmico pequeno (sHSPs) e uma chaperona molecular expresso em vários tecidos [6], [7]. Evidência recente estabeleceu que CRYAB apresenta não apenas no olho, mas também no coração, pele, cérebro, medula espinal, e os tecidos do pulmão [6], [8]. Nos mamíferos, há três classes de cristalinos: alfa, beta e gama, cada uma contribuindo igualmente para a massa total da lente. A partir dos estudos de proteómica ou o nível de proteína, que foi recentemente reconhecido que CRYAB pode ter um papel no desenvolvimento do cancro. Em 2005, é relatado que

CRYAB

foi regulada a nível mRNA a partir de pacientes com câncer bucal em comparação com a mucosa oral normal [9]. No entanto, em contraste com a grande expressão na mucosa oral normal, os pacientes com negativa ou inferior CRYAB detectado em seus locais de tumor tinham melhores taxas de sobrevida livre de doença do que aqueles pacientes cujos tumores manchado fortemente. Pelo contrário, foi relatado que a partir de um rastreio proteómica em Taiwan, CRYAB foi significativamente regulada para cima no tecido primária de doentes de cancro oral [10]. Em 2010, foram relatados resultados semelhantes num modelo de cancro oral de ratos por meio do tratamento concomitante de 8 semanas com 4-NQO (200 ug /mL) e a arecolina (500 ug /ml) [11]. Apesar das divergências levantadas entre os diferentes ética e populações investigadas, o status genômico de

CRYAB Comprar e a ligação entre o seu genótipo e evolução clínica são em grande parte desconhecido.

A fim de compreender o papel da genômica

CRYAB

no câncer oral, nós escolhemos três polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) de

CRYAB

, a-1215G (rs2228387), C-802G (rs14133), intrão 2 (rs2070894), e investigou sua distribuição genotípica em uma grande população câncer bucal de Taiwan. Além disso, os dois resultados clínicos contribuir para a maior taxa de morte de câncer bucal, metástase e recorrência, foram analisados ​​de suas associações com o

CRYAB

genótipos.

Resultados

A características clínicas dos pacientes e controles de câncer oral são apresentados na Tabela 1. não houve diferença significativa entre os dois grupos na sua idade e sexo, enquanto os pacientes são muito mais elevados expostos aos fatores de risco ambientais para o câncer bucal em Taiwan, fumo, álcool hábitos de beber e quid betel de mascar (Tabela 1). As frequências dos genótipos e alelos para o

CRYAB

A-1215G, C-802G e intron 2 para os participantes são apresentados na Tabela 2. A distribuição genotípica de vários polimorfismos genéticos de

CRYAB

C-802G é significativamente diferente entre os grupos e controlo do cancro orais (

P Art 0,05), enquanto aqueles para a-1215G ou intron 2 não foram significativas (

P Art 0,05) ( Mesa 2). Além disso, as distribuições de alelos do

CRYAB

C-802G (

P

= 1,49 * 10

-5, OR = 1,51, 95% CI = 1,25-1,83), e não aqueles de A-1215G (

P

= 0,8593, OR = 0,91, IC 95% = 0,31-2,62) ou intron2 (

P

= 0,1366, OR = 1,16, 95% CI = 0.95- 1,41), se encontra a ser associado com a susceptibilidade para o cancro oral (Tabela 2). Para resumir, o alelo G e GG ou CG genótipo do

CRYAB

C-802G estão associados com o risco de câncer oral e pode ser biomarcadores para a detecção do câncer oral. analisa a restrição representante baseado em PCR para o

CRYAB

polimorfismos C-802G são mostrados na Figura 1.

M: 100 bp DNA tamanho do marcador, G /G: enzima homozigoto indigesta, C /G: heterozigoto, e C /C:. enzima homozigoto digerível

Para avaliar o valor prognóstico da

CRYAB

genótipos, as relações entre a sobrevida livre de doença , recorrência, metástase e

CRYAB

genótipos C-802G foram analisados. Primeiro, os pacientes com câncer bucal carregando a

CRYAB

C-802G CG teve uma tendência significativa de sobrevida livre de doença diminuiu, e os pacientes portadores

CRYAB

C-802G GG tinha a doença- mais curto período de sobrevida livre (Figura 2). O curta livre de doença podem refletem principalmente recorrência local. Mais do que 80% (30 de 37) dos pacientes portadores

CRYAB

C-802G GG teve recidiva nodal sem um estágio avançado N (N0-1) no primeiro diagnóstico. Curiosamente, os pacientes teriam recorrência frequente e altas taxas de tumor primário segundo dentro dos cinco anos seguintes. Em segundo lugar, em comparação com aqueles com o genótipo CC, os pacientes portadores

CRYAB

C-802G CG ou genótipo GG teve uma maior taxa de recorrência dentro dos cinco anos seguintes (

P

= 0,228, OR = 2,08 , IC 95% = 1,11-3,92), mas não uma taxa de metástases superior (Tabela 3).

a análise estatística foi realizada pelo teste de log-rank.

discussão

o estudo teve como objetivo investigar a associação de

CRYAB

genótipos e variações clinicopathopogical em Taiwan pacientes com câncer oral. Foi recentemente reconhecido que a proteína CRYAB pode desempenhar um papel no desenvolvimento do cancro oral. Na literatura anterior, foi relatado que CRYAB foi significativamente sobre-expressa no tecido primária de doentes de cancro orais em Taiwan [10]. Em 2010, em língua ratinhos Cancro realizada por tratamento concomitante de 8 semanas com 4-NQO (200 ug /mL) e a arecolina (500 ug /mL) e retirar-se nas 20 semanas seguintes, as células dos locais do tumor tinha maior expressão de CRYAB do que as células de contrapartida dos ratinhos tratados com placebo [11]. No entanto, também houve algumas descobertas que desafiam esta associação up-regulação [9], [12]. Isto pode ser devido a que diferentes populações de diferentes éticas, fundo genético, culturas, e exposição ambiente foram investigados. A partir dos pontos de vista de estudos baseados em linha de células, demonstrou-se que a sobre-expressão de CRYAB em células humanas imortalizadas transformadas mamárias epiteliais neoplásicas e demonstrou características de crescimento luminal e estas alterações foram inibidas quando a expressão CRYAB foi silenciada utilizando ARN de interferência [13]. A sobre-expressão de CRYAB em células epiteliais mamárias humanas também formado carcinomas da mama invasivos em ratinhos nus, o factor de crescimento da epiderme induzida e crescimento independente de ancoragem, o aumento da migração celular e invasão, e activada a proteína cinase de /cinase regulada por sinal extracelular activada por mitogénio (MEK /ERK ) via, o que sugere que poderia ser considerado CRYAB uma oncoproteína [14]. No entanto, ainda não existe qualquer estudo realizado a partir do nível do DNA para investigar o importante papel da

CRYAB

na carcinogênese.

Com base na evidência expressão diferencial anterior, nós fortemente interessados ​​e escolheu o três SNPs de

CRYAB

, dois na região promotora (a-1215G e C-802G) e um no intron 2 (intron2), para investigar suas associações com o risco de câncer oral e prognóstico. Descobrimos que

CRYAB

C-802G polimorfismo, não A-1215G ou intron2, foi associado com aumento do risco de câncer oral (Tabela 2), ea taxa de recorrência local (Tabela 3). Além disso, os pacientes com câncer bucal que transportam GG ou CG no local polimórfico tiveram menor taxa de sobrevivência de 5 anos do que aqueles que transportam CC homóloga (Figura 2). Curiosamente, os pacientes portadores GG em

CRYAB

C-802G foram registrados ter recorrência muito mais frequente e segundo as taxas primárias. Isso pode indicar que

CRYAB

C-802G pode ser um predicador em direção a progressão do cancro oral. Possivelmente, o polimorfismo genético afeta diretamente os padrões diferenciais da proteína CRYAB, na expressão e /ou níveis funcionais e, indiretamente, os desequilíbrios das funções normais de outros genes e proteínas relacionadas à CRYAB, que podem resultar na carcinogênese oral. Ao mesmo tempo, a alteração da expressão da proteína CRYAB na matriz extracelular pode fazer com que as mudanças subtis do microambiente perto do tumor primário por via oral, para a recorrência, mas não para a metástase. Isso pode ser justificado pelo papel da CRYAB na sinalização da tirosina quinase, que poderiam facilmente ser alterados em células cancerosas. A expressão reduzida de CRYAB foi primeiramente relatado para ser associado com um prognóstico negativo em 2003 [15].

Aproximadamente 10% dos cabeça-fase precoce e pacientes com carcinoma de células escamosas do pescoço desenvolver recidiva loco-regional e 15% a 25 % desenvolvem tumores primários no prazo de 5 anos após o diagnóstico inicial [16], [17]. Como abordagens diagnósticas e terapêuticas continuará a desenvolver, a capacidade de prever com precisão segundo tumor primário /recorrência em pacientes com câncer bucal em estágio inicial iria facilitar a fiscalização intensiva ou intervenções orientadas para os pacientes de alto risco e, assim, reduzir a mortalidade e morbidade. Neste estudo, os pacientes portadores

CRYAB

-802G C CG ou genótipo GG foram encontrados para ter uma maior taxa de recorrência dentro dos cinco anos seguintes, mas não uma taxa de metástases superior (Tabela 3).

a ocorrência de segundo tumor primário pode ser devido às alterações sutis do microambiente que foram acumulados para atingir o limiar de desenvolvimento de neoplasias nos pacientes de genótipos de risco, como GG em

CRYAB

C-802G. O estudo funcional deste SNP e como a proteína CRYAB interage com proteínas da matriz extracelular na carcinogênese oral também precisam de mais investigações. No futuro, a evidência coletiva de coortes maiores e diferentes que utilizam este SNP pode ajudar a encenação oral do cancer, previsão direção resultado, e uma estratégia mais eficiente e integradora.

É primeiramente que o SNP na região promotora do

CRYAB,

C-802G, está associada a susceptibilidade oral do cancer, recorrência e sobrevida livre de doença em 5 anos, mas não metástase. Desde pobre controle local-regional e fácil de recorrência são as principais causas de falhas de tratamento na terapia do câncer oral, os resultados deste estudo podem fornecer informações de orientação mais preditiva, não só para a prevenção, mas o cuidado, terapia e acompanhamento desses pacientes em maior risco de recorrência do câncer e menor taxa de sobrevida em 5 anos.

Materiais e Métodos

população do estudo e da amostra coleção

Quatrocentos e noventa e seis câncer pacientes com diagnóstico de via oral câncer foram recrutados nos ambulatórios de cirurgia geral entre 2005-2008 no Hospital China Medical University, Taichung, Taiwan, República da China. As características clínicas dos pacientes incluem detalhes histológicos foram todos classificados e definida por cirurgiões experientes. Todos os pacientes voluntariamente participaram, completaram um questionário auto-administrado e forneceram amostras de sangue periférico. número dobro de voluntários saudáveis ​​não-cancerosas como controles foram selecionados por correspondência para a idade, sexo e algumas indulgências após amostragem aleatória inicial da Saúde Exame Coorte do hospital. Os critérios de exclusão do grupo controle incluiu malignidade anterior, metástase de câncer de outros ou de origem desconhecida, e quaisquer doenças familiares ou genéticas. Ambos os grupos de terminar um pequeno questionário que incluiu algumas indulgências e que foram gravadas. Nosso estudo foi aprovado pelo Conselho de Administração do Hospital Médico Universitário China Análise institucional e consentimento escrito informado foi obtido de todos os participantes.

testes de genotipagem

O DNA genômico de câncer e de controlo da sanidade temas orais foram preparado a partir de leucócitos de sangue periférico usando um QIAamp sangue Mini Kit (Blossom, Taipei, Taiwan) e processados ​​de acordo com estudos anteriores [18] – [24]. Resumidamente, foram utilizados os seguintes iniciadores para

CRYAB

A-1215G (rs2228387): 5′-ACCTGTTGGAGTCTGATCTT-3 ‘e 5′-ATGCACCTCAATCACATCTC-3’; para

CRYAB

C-802G (rs14133): 5′-TTGACCATCACTGCTCTCTT-3 ‘e 5′-TTGGCAATGTGACACATACC-3’; para

CRYAB

intrão 2 (rs2070894): 5′-GTCTAGAAGACTAAGTTAGG-3 ‘e 5′-AGAGAAGTCACAACTCAAGT-3’; Foram realizadas as seguintes condições de ciclo: um ciclo a 94 ° C durante 5 min; 35 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 30 s; e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram estudados após a digestão com

Fau I

,

Fat I

, e

DPN I

, as enzimas de restrição para a A-1215G (corte de 212 pb Um tipo em 67 + 145 pb tipo G), C-802G (corte de 363 pb tipo G em 85 + 278 pb tipo C), e intron 2 (Montagem do tipo T 363 pb em 74 + 339 pb tipo C), respectivamente.

análise estatística

Em nosso estudo,

o

omente aqueles combina com todos os SNPs de dados (caso /controle = 496/992) foram selecionados para análise final. Para garantir que os controles utilizados foram representativos da população geral e de excluir a possibilidade de erro genotipagem, o desvio das freqüências genotípicas de

CRYAB

SNPs nos indivíduos controle das esperadas sob o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi avaliada pelo teste de goodness-of-fit. O teste de Pearson dois lados do qui-quadrado ou teste exato de Fisher (quando o número esperado em qualquer célula foi inferior a cinco) foi utilizado para comparar a distribuição dos

genótipos CRYAB

entre casos e controles.

O desfecho primário foi sobrevida livre de doença. Os endpoints incluídos recorrência do câncer local e metástases. informações de acompanhamento estava disponível para todos os pacientes no ponto de tempo de 5 anos. tempo de sobrevida livre de doença foi calculado a partir da data do tratamento até que o tempo de recorrência, definido como recorrência da doença no mesmo local ou a detecção de metástases, incluindo recorrência nos linfonodos cervicais. Os genótipos foram codificados assumindo uma dose-efeito alelo (CC wild-type = 0, CG portador heterozigoto do alelo mutado = 1, GG portador homozigótico do alelo mutado = 2). curvas de sobrevida livre de doença foram gerados pelo método de Kaplan-Meier e verificado pelo teste de log-rank. O nível de significância foi fixado em

P

. 0,05