Sumário

repetições em tandem são encontrados tanto em codificação e sequências de organismos superiores não-codificante. Estas sequências podem ser usadas em genética e diagnóstico do cancro para desvendar a base genética da formação e progressão tumoral. Neste estudo, uma possível relação entre distribuições SSR e o cancro do pulmão foi estudada por análise comparativa de EST-SSR em tecidos cancerosos e normais do pulmão. Embora a distribuição EST-SSR foi semelhante entre os tecidos tumorais, esta distribuição foi diferente entre os tecidos normais e tumorais. Trinucleótidos repetições em tandem foram altamente diferente; o número de trinucle�idos em ESTs de câncer de pulmão foi 3 vezes maior do que o tecido normal. correlação negativa significativa entre o tecido normal e canceroso mostrou que o tecido canceroso gera diferentes tipos de trinucleótidos. GGC e CGC foram os trinucle�idos expressas mais frequentes no tecido canceroso, mas estes SSRs não foram expressos em tecido normal. Semelhante ao nível EST, o padrão de aminoácidos EST-SSR derivados de expressão foi significativamente diferente entre os tecidos normais e cancerosos. Arg, Pro, Ser, Gly, Lys e foram os aminoácidos mais abundantes em tecidos cancerosos e, Leu, Cys, Phe, e Sua foram significativamente mais abundante em tecidos normais do que em tecidos cancerosos. Em seguida, foram analisadas as funções putativas de tripletos SSR contendo genes. Em tecido canceroso, EST-SSR produzir diferentes tipos de proteínas. proteínas de ligação de ADN da helicase Chromodomain eram um dos principais produtos de proteína de EST-SSR na biblioteca canceroso, enquanto estas proteínas não foram produzidos a partir de EST-SSR em tecido normal. Pela primeira vez, os resultados deste estudo confirmou que EST-SSRs em tecidos pulmonares normais são diferentes do que em tecidos saudáveis, e marcou ESTs com SSRs causar diferenças notáveis ​​nos padrões de aminoácidos e expressão da proteína no tecido canceroso. Sugerimos que EST-SSRs e EST-SSRs diferencialmente expressos no tecido canceroso podem ser marcadores candidatos adequados para o diagnóstico e prognóstico do cancro do pulmão

Citation:. Bakhtiarizadeh MR, Ebrahimi M, Ebrahimie E (2011) Descoberta da EST- SSRs no câncer de pulmão: ESTs marcados com SSRs levar a Diferencial Padrões de aminoácidos e expressão da proteína em cancerosos tecidos. PLoS ONE 6 (11): e27118. doi: 10.1371 /journal.pone.0027118

editor: Deodutta Roy, da Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de julho de 2011; Aceito: 11 de outubro de 2011; Publicação: 04 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Bakhtiarizadeh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo tem sido apoiada pela subvenção Universidade Shiraz de Esmaeil Ebrahimie e Bioinformática Research Group da Universidade de Qom. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

geração rápida de genómica e dados de genómica funcional forneceu novela, rápido, e ferramentas de baixo custo na dissecação funcional dos fenômenos vitais como identificação e previsão de câncer. marcadores de sequências expressas (ESTs) são sequenciados a partir de partes das regiões codificantes do genoma, sob certas condições biológicas [1]. Os ESTs podem ser desenvolvidos a partir de bibliotecas de ADNc para se obter informação expressão em contraste condições ambientais ou em estágios de desenvolvimento para proporcionar uma fonte barata de marcadores de DNA baseadas em genes [2]. Coleções de ESTs foram gerados em diferentes tecidos humanos, o que proporciona uma oportunidade única para a busca de motivos SSR e desenvolver os marcadores microssatélites correspondentes [3]. Nos últimos anos, o aumento do número de ESTs depositados em bancos de dados tem acelerado a investigação neste campo. Uma vasta quantidade de sequências EST depositados na Universidade de Harvard (O Projeto índice Gene, https://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/tgipage.html) e NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov /explosão) oferece a oportunidade de consideração precisa de diferentes eventos biológicos por análise EST-SSR, não só em nível de DNA, mas também em aminoácidos e nível de proteína funcional.

o comprimento de microssatélites ou SSRs varia de um a seis (ou mais) unidades de sequências repetidas-tandem. Estas sequências são ubiquamente distribuídos em genomas procarióticos e eucarióticos e pode ser encontrada em sequências tanto de codificação e não codificantes de organismos superiores [4], [5], [6], [7]. Em comparação com outros marcadores moleculares, SSRs são caracterizadas unicamente pela sua simplicidade, abundância, onipresença, variação, co-dominância, ea natureza multi-alelos entre os genomas [8]. Devido ao potencial de polimorfismos abundantes, SSRs tornaram-se uma fonte valiosa de marcadores genéticos e têm sido amplamente aplicada a diversas áreas de pesquisa genética, incluindo a variação do genoma, o estabelecimento de mapas genéticos, integração de mapas físicos e genéticos, determinação de relações evolutivas, e analisa comparativa genoma [8], [9], [10]

EST-SSR, que são uma combinação de EST e SSR, oferecem várias vantagens sobre os outros marcadores baseados em ADN genómico.; estas vantagens incluem a capacidade de detectar a variação na porção do genoma expresso e possuindo um maior nível de transferência para espécies do que os marcadores genómicos SSR estreitamente relacionados [11], [12]. Há alguma evidência de menor variação EST-SSR em comparação com os íntrons ou regiões intergênicas, mas até mesmo as estimativas mais baixas sugerem que pelo menos 25% da EST-SSRs são polimórficos [12]. No que respeita à existência de EST-SSR em regiões transcritas do genoma, essas sequências podem levar ao desenvolvimento de mapas baseados em genes para a identificação de genes candidatos funcionais e aumentar a eficácia de selecção assistida por marcadores.

Em contraste com suposição principal que sugere SSR não são elementos funcionais, novos estudos demonstraram que a distribuição genómico de SSR não é aleatória, presumivelmente devido aos seus efeitos sobre a organização da cromatina, regulação da actividade do gene, a recombinação, a replicação do ADN, do ciclo celular, e reparação de emparelhamentos incorrectos) [ ,,,0],13]. Subconjuntos de SSRs, ou seja, repetições dos trinucleotídeos, são de grande interesse por causa de seu papel em muitas doenças neurodegenerativas humanas e câncer [14], [15]. Na realidade, a expansão de repetições de tripletos é responsável pelas doenças genéticas acima referidos em que a taxa de mutação e, consequentemente, a indução da doença depende do número de unidades de repetição em tandem dentro do [14], [15]. Por exemplo, o papel da (CAG)

N expansões repetidas em atrofia muscular espinobulbar e (CTG)

N expansões repetidas na distrofia miotónica estão bem documentadas [16]. Originalmente, as expansões foram limitados a trinucleotídica repete, mas é agora claro que repete tetram�icos, pentaméricos e até mesmo dodecameric também pode expandir e levar à doença humana [17]. instabilidade microssatélite reflecte erros de replicação induzidas por uma função defeituosa dos genes de reparação de emparelhamentos incorrectos, o que resulta no aparecimento de novos alelos, não herdados em células tumorais. Como resultado, SSR co-expressa com ESTs podem ser correlacionadas com características clinicopatológicas de cancro, a sua formação e o desenvolvimento do tumor. SSRs foram usados ​​em genética do câncer e diagnóstico de câncer indireta para ajudar a desvendar a base genética da formação de tumores e progressão do câncer. instabilidade de microssatélites foi relatada em câncer colorretal [18], o cancro da mama [3], [19], câncer de ovário e outros cancros [20], [21], [22], [23], [24], [25 ], [26]. No entanto, até à data, não houve nenhum relatório sobre a aplicação da EST-SSRs no câncer de pulmão.

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres [27] e mulheres [28] Ao longo o mundo; ultrapassou o cancro da mama como a principal causa de morte por câncer em mulheres [27]. Pela primeira vez, relatamos comportamento diferencial de EST-SSR entre os tecidos pulmonares normais e cancerosos, em ADN de aminoácidos, e os níveis de proteína-anotada. No início, frequência de distribuição e tipo de EST-SSRs foram comparados em tecidos pulmonares normais e cancerosos. frequências de aminoácidos, em seguida, EST derivadas foram comparadas entre tecidos normais e cancerosos. Finalmente, as funções putativas de SSR contendo genes foram analisados ​​em tecidos normais e cancerosos. O resultado deste estudo podem ser usados ​​para o desenvolvimento de ferramenta de detecção baseada em ESS-SSR para câncer de pulmão em estudos futuros e abre um novo caminho na investigação de expressão diferencial de EST-SSRs como uma das possíveis causas de câncer de pulmão.

Métodos

Recuperação de bibliotecas de EST

EST bibliotecas de pulmão (1 de normal e 2 a partir de tecidos cancerosos) foram baixados da coleção EST (o Projeto Gene Index) da Universidade de Harvard (http : //compbio.dfci.harvard.edu/tgi/tgipage.html). A biblioteca EST a partir de tecido de pulmão normal (Cat No. LB36) contém 11652 ESTs. Foram utilizados dois bancos de EST de tumores pulmonares malignos:. uma biblioteca de carcinoma de grandes células indiferenciadas contendo 6556 ESTs (Cat No. # 5F8) e um carcinoma de células escamosas pouco diferenciado contendo 6662 ESTs (Cat No. LF43)

grandes carcinomas são um grupo de cânceres com células grandes, anormais para o futuro. Estes tumores geralmente começam ao longo das bordas exteriores dos pulmões. carcinoma de células escamosas, também chamado de carcinoma epidermóide, é o tipo mais comum de câncer de pulmão em homens. Começa frequentemente nos brônquios, e normalmente não se espalha tão rapidamente quanto outros tipos de câncer de pulmão (https://www.umm.edu/respiratory/lungcan.htm).

Comparação de EST-SSRs entre as bibliotecas normais e cancerosos

EST-SSR foram identificados pelo software SSR localizador como descrito anteriormente [29]. SSR Locator é uma ferramenta para a detecção e caracterização de micro e minissatélites em sequências de ADN. Além de encontrar as sequências repetitivas, o programa também pode projetar primers, simular reações de PCR, e fazer alinhamentos globais entre regiões homólogas obtidos a partir da simulação PCR.

Para avaliar o padrão de distribuição EST-SSR entre os tecidos normais e cancerosos, as sequências de EST de duas bibliotecas cancerosas foram reunidas em primeiro lugar. Em seguida, as sequências EST de bibliotecas normais e cancerosos foram verificados quanto a motivos SSR que variam em comprimento desde 2 a 6 nucleótidos com números de repetição dinucleótido ≥7, números de repetição trinucleótido ≥6, números de repetição tetranucleotídica ≥5, números de repetição pentanucleótidos ≥5, e hexanucleotide repetir os números ≥5.

Comparação de EST-SSRs entre as bibliotecas cancerosas

Duas bibliotecas de EST de tecidos cancerosos (Cat No. # 5F8 e Cat No. LF43) foram usados ​​para testar se o EST -SSR distribuição é semelhante entre os tecidos cancerosos. As sequências EST a partir das bibliotecas foram pesquisadas com cancerosas SSR localizador para SSRs motivos que variam entre 2 e 6 nucleótidos de comprimento. Os parâmetros número de repetições foram os seguintes: ≥7 para dinucle�idos, ≥6 para trinucle�idos, ≥5 para tetranucleótidos, ≥5 para pentanucleotides e ≥5 para hexanucleotides

Primer design para EST-SSRs

Para cada EST contendo microssatélites, primers foram projetados usando Primer3 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/) executando o software em um modo em lote com a ajuda do módulo de interface localizador de SSR. A função de desenho de primers foi usado para determinar se as sequências tinham sequências flanqueantes suficientes para a concepção de iniciadores. Os principais parâmetros para a concepção de iniciadores foram como se segue: PCR de tamanho do produto de 100-300 pb, o comprimento do iniciador com 18-25 pb 20 pb como o óptimo, temperatura óptima de recozimento 58-63 ° C com 60 ° C como o óptimo, e um mínimo conteúdo GC de 30%, com 50% sendo o ideal.

distribuições de aminoácidos de ESTs com repetições de trinucleotídeos

o tipo de aminoácidos e suas distribuições nos tecidos normais e cancerosos foram previstos para ESTs com repetições de trinucleotídeos usando software SSR Locator. Traduzindo os EST-SSRs para seus aminoácidos correspondentes fornece algumas pistas sobre as diferenças e semelhanças entre tecidos normais e cancerosos no nível de proteína.

A análise estatística

Para entender as semelhanças e diferenças entre canceroso e tecidos pulmonares normais na geração de EST-SSRs, o teste t pareado foi utilizado para comparar o número de SSRs expressos em cada classe de EST-SSRs (dinucleótidos trinucle�idos, tetranucleótidos, pentanucleotides e hexanucleotides) entre as bibliotecas normais e cancerosos . Diferentes seqüências de repetições em série em cada classe foram utilizados como grupos de emparelhamento.

Além disso, para avaliar a co-linearidade dos tecidos cancerosos e normal na geração diferente EST-SSRs, correlações de Pearson foram calculados utilizando software MINITAB14 (www .minitab.com).

Depois de predizer a composição de aminoácidos de ESTs que contêm repetições em série de trinucleotídeos, o número de loci de aminoácidos e número de repetições de aminoácidos foram comparadas entre pulmão canceroso e tecidos normais pelo teste t emparelhado . Diferentes tipos de aminoácidos foram assumidas como clusters de emparelhamento.

Além disso, os SSRs expressas em cada classe de EST-SSRs foram comparadas pelo teste t pareado entre as bibliotecas cancerosas para examinar sua distribuição nos tecidos cancerosos.

Anotação de SSR contendo sequências

Para lançar luz sobre as funções putativas de SSR contendo genes em tecidos cancerosos e normal, os arquivos Fasta de todos os EST-SSRs identificados em tecidos pulmonares cancerosas e normais foram submetido a software Blast2GO (https://www.blast2go.org/) e foram corridos contra o (nr) de banco de dados de proteínas não redundante de NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast); os acertos obtidos foram compilados [30]. EST-SSRs com uma melhor e-valor de 10

-6 ou menor foi atribuído uma identidade putativo.

Resultados

Frequência e distribuição dos EST-SSRs em tecidos normais e cancerosos

No total, 24870 ESTs foram analisados ​​por SSR localizador; 13218 ESTs pertencia ao tecido canceroso pulmonar, e 11652 ESTs pertencia ao tecido normal (Tabela 1). Analisando um grande número de ESTs em ambos os tecidos cancerosos e normal proporcionou uma oportunidade para monitorar com precisão o comportamento dos SSRs expressos em câncer de pulmão. Os comprimentos médios das sequências EST em tecidos cancerosos e normais foram 478 e 288 pb, respectivamente. Esta diferença de comprimento mostra claramente que, quando um tecido de pulmão começa a gerar um tumor, uma mudança de splicing alternativo ocorre em todo o genoma, produzindo assim ESTs mais longos e proteínas. Outros estudos de splicing alternativo utilizando as bibliotecas de EST acima referidas, podem desvendar a modulação splicing por todo o genoma do cancro do pulmão. Conforme apresentado na Tabela 1, no tecido canceroso, 238 SSR foram encontradas em 227 sequências de ESTs. Em contraste, 208 SSR foram identificados em 184 ESTs foram encontrados no tecido normal (Tabela 1).

No tecido normal, as porcentagens de dinucleótidos trinucle�idos, tetranucleótidos, pentanucleotides e hexanucleotides foram 58,65%, 11,05%, 22,59%, 7,21% e 0,48%, respectivamente (Figura 1). Em contraste, em tecidos cancerosos, 56,72%, 30,25%, 7,98%, 2,10% e 2,94% de SSR totais foram atribuídos a dinucleótidos trinucleótidos, tetranucleótidos, pentanucleotides, e hexanucleotides, respectivamente (Figura 1).

As percentagens de dinucleótidos trinucle�idos, tetranucleótidos, pentanucleotides e hexanucleotides foram comparados entre os tecidos cancerosos e normal. SSR repetições trinucleótido são abundantes nos ESTs de tecido canceroso pulmonar.

Com base na Figura 1, a maior diferença entre tecidos normais e cancerosos pertence trinucleótidos. Em outras palavras, trinucleótidos são mais abundantes na biblioteca canceroso do que a biblioteca normal (30,25% vs 11,05%, respectivamente). Esta constatação confirma os resultados anteriores sobre distúrbios neurodegenerativos e outros cancros em que repete trigêmeos são expandidas no tecido tumoral [14], [15]. De acordo com Bacolla et ai. (2008), não há uma correlação positiva entre a taxa de mutações defeituosos e a indução da doença com uma expansão de repetições de tripletos. Outra questão ainda permanece: há alguma diferença entre os tipos de SSRs expressos em cada classe de unidades de repetição

A análise comparativa dos tipos EST-SSR entre tecidos normais e cancerosos de pulmão

Para lançar luz sobre as modulações de sequência SSR expressas em cada classe de unidades de repetição durante o cancro do pulmão, as frequências das sequências dentro de cada classe de repetição da unidade (dinucleótidos trinucle�idos, tetranucleótidos, pentanucleotides, ou hexanucleotides) foram comparados entre tecidos normais e cancerosos (Figuras 2, 3, 4, Informações de Apoio S1).

AT /TA foi mais frequente no tecido canceroso do que no tecido normal. Além disso, a GC /GC foi detectado apenas no tecido canceroso.

Uma mudança na trinucleotide EST-SSRs ocorre quando o tecido se torna tumorigénico, com decréscimos sendo observado em ACC, CAC, e TTG tripleto em tandem repete e aumentos de GGC, CGC e AGA vez.

tetranucleótidos, como AAAC, ATCA, TTGT, GAAG, e ATA, foram diferencialmente expressos entre os tecidos normais e cancerosos.

Figura 5 destaca a elevada proporção de Arg, Pro, e os aminoácidos Ser no tecido pulmonar canceroso.

os tipos de sequências de dinucleótido em tecido canceroso e normal são apresentados na Figura 2. Cinco dinucleótidos , AC /GT, AG /CT, AT /TA, CA /TG, e GA /TC, foram identificados em ambas as bibliotecas, enquanto o GC /GC apenas foi detectado em tecido canceroso (Figuras 2, informação de apoio S1). Interessantemente, a distribuição das sequências dinucleotídicas não foi similar entre os tecidos. Mais de 40% dos dinucleótidos nos tecidos pulmonares cancerosas foram AT /TA-tipo. Em contraste, esta proporção diminuiu para 14,75% no tecido normal (Figuras 2, informação de apoio S1). Assim, sugerimos que a AT /TA e frequências GC /GC pode ser empregada para detectar câncer de pulmão.

Para trinucle�idos, 28 tipos de repetições triplete foram encontrados no tecido canceroso, enquanto apenas 19 sequência de tipos foram detectados no tecido normal (Informações de Apoio S1). A distribuição diferencial de trinucle�idos em bibliotecas normais e cancerosas era muito perceptível. Enquanto no tecido normal, repete tripletos foram distribuídos com frequências quase iguais, a distribuição de repetições de tripletos era completamente não-uniforme no tecido canceroso. E GGC CGC foram os mais frequentes repetições trinucleotídicas expresso em tecido canceroso (9,72% e 6,94%, respectivamente), enquanto que estes SSR não foram expressas no tecido normal. Em contraste, ACC, CAC, e TTG, que eram as repetições em tandem tripleto dominantes em tecido normal, foi responsável por 26% de todos os trinucleótidos expressos em tecido normal, rapidamente desaparecem quando o tecido pulmonar se torna tumorigénica (Figura 3). Assim, a monitorização do padrão de repetição de tripleto expressão pode ser considerada como uma forma apropriada para a previsão e detecção do cancro de pulmão.

A Figura 4 apresenta as diferenças tetranucleotídeo EST-SSR entre tecidos normais e cancerosos. AAAC foi altamente prevalente na biblioteca normal, enquanto ATCA foi altamente prevalente no tecido canceroso. No entanto, diferenças na expressão tetranucleotídeo SSR entre câncer e normal não eram tão claras quanto trinucleotídeos EST-SSRs.

Pentanucleotides e hexanucleotides EST-SSRs são mostrados na Informações de Apoio S1. Todos os cinco pentanucleotides em tecidos cancerosos tinham frequências semelhantes, enquanto ATTCC apresentou a maior frequência nos tecidos pulmonares normais (Informações de Apoio S1). Três hexanucleotides foram encontrados nos ESTs de câncer de pulmão, incluindo GCCCCA, CCTTGG e CAACAG, enquanto que apenas um hexanucleotide (ATTTTT) foi detectada em ESTs normais (Informações de Apoio S1)

.

O número de EST-SSRs em cada classe de unidades de repetição foi comparado entre os tecidos cancerosos e normais e é apresentada na Tabela 2. O tecido pulmonar canceroso estatisticamente tem um maior número de repetições em série de trinucleotídeos (P = 0,01). Esta descoberta confirma o papel provável de trinucleotide EST-SSRs na indução de cancro, o que tem sido relatado previamente em outros tipos de câncer [14], [15]. Como apresentado na Tabela 2, o conjunto (menor repete dinucleótidos e trinucleótidos) foram mais abundantes no tecido canceroso do que no tecido normal. Em contraste, as frequências de tetranucleótidos e pentanucleotides (repetirá tamanho maior em tandem) são mais elevados no tecido normal.

Correlação de SSRs expressas entre canceroso do pulmão e tecidos normais

A correlação de expresso sequências SSR entre tecidos normais e cancerosos em cada classe de repetições em tandem (dinucleótidos trinucleótidos, tetranucleótidos, ou pentanucleotides) é apresentada na Tabela 3. Curiosamente, uma correlação negativa entre as expressões de trinucleotídeos-tipos entre bibliotecas cancerous- e dos tecidos normais (Tabela 3), enquanto correlações de dinucleótidos ou tetranucleótidos entre bibliotecas normais e cancerosos foram positivas (Tabela 3). Na verdade, de acordo com a alteração do tecido normal de tumor, o perfil de trinucleótido EST-SSR expressão parece mudar. Expressas repetições em tandem trinucleotídeos pode ser o melhor candidato para a detecção e previsão de tecido canceroso do pulmão em estudos futuros.

Virtual PCR

Na biblioteca cancerosa reunidas, 156 EST-SSRs teve flanqueamento adequada regiões para desenho de primers. Consequentemente, 156 primers (69% da EST-SSRs) foram projetados para 227 EST-SSRs em tecidos cancerosos (Informações de Apoio S2). Quando PCR virtual foi executado com o software SSR Locator, 81 dos primers (52%) produziu fragmentos adequados.

Com base na região de flanqueamento adequada, foram identificados 113 primers para 184 EST-SSRs (61% da EST- SSRS) na biblioteca normal (Informações de Apoio S3), e 93 destes iniciadores (82% dos iniciadores) produziu fragmentos SSR durante a PCR virtual (Informações de Apoio S3). As sequências dos iniciadores são apresentadas em Informações de Apoio S2 e S3 e são úteis em estudos de laboratório em pulmão EST-SSRs.

anotação funcional da EST-SSRs

Para explorar as funções das sequências EST contendo SSR em tecidos normais e cancerosos, BLASTX foi usada para procurar EST-SSR no banco de dados de proteínas não redundante (NR) de NCBI. Um total de 117 de 227 EST-SSRs no tecido canceroso do pulmão e 55 de 187 (30%) sequências em tecidos pulmonares normais tinham sucessos significativos (Informações de Apoio S4 e S5 Informações de Apoio).

A comparativa funcional anotação da EST-SSRs entre tecidos pulmonares normais e cancerosos é apresentado em Informações de Apoio S6. Além disso, as proteínas anotados para trinucletotide EST-SSRs foram comparados entre tecidos normais e cancerosos de pulmão em Informações de Apoio S7.

Muitos dos anotados EST-SSRs em tecido canceroso foram relacionados com chromodomain DNA helicase proteínas de ligação, formin proteínas liga�o ao, e homólogos de proteínas Chromobox, e esses genes não expressam com SSRs na biblioteca normal (Informações de Apoio S6). proteínas de ligação Chromodomain helicase de ADN apenas produzir a partir trinucletotide EST-SSRs no tecido canceroso (Informações de Apoio S7). Em outras palavras, SSRs em tecido canceroso preferem participar e direcionar as proteínas do núcleo envolvidos na formação de heterocromatina, a ativação da transcrição, regulação da ligação e manutenção da integridade da heterocromatina.

Em particular, a interferência de SSRs com DNA helicase chromodomain proteínas de ligação podem resultar na geração de genes defeituosos no cancro do pulmão. Esta descoberta está de acordo com os resultados de Li et al. (2004) sobre os efeitos da distribuição de SSR na organização da cromatina e regulação da atividade do gene [13]

CCAAT /proteína de ligação potenciador α foi outro alvo interessante que foi afetada pela SSRs exclusivamente em tecido canceroso.; Esta proteína tem um papel bem documentadas na proliferação de células. proteínas de ligação CCAAT-intensificador (ou C /EBP) são uma família de factores de transcrição que interagem com a CCAAT (citidina-citidina-adenosina-adenosina-timidina) caixa de motivo, que está presente em vários promotores de genes. C /EBP são caracterizadas por um domínio altamente conservado zíper de base-leucina (bZIP) na extremidade C-terminal. Este domínio está envolvido na dimerização e ligação ao DNA, como são outros factores de transcrição de fecho de leucina. proteína C /EBP estão envolvidas em diferentes respostas celulares, tais como o controlo da proliferação celular, o crescimento e a diferenciação, o metabolismo, e imunologia [31], [32].

Os resultados acima abrir um novo caminho no pulmão estudos de câncer e sugerem que os SSRs tanto pode ser um marcador para e também uma causa de indução de câncer. Mais estudos no futuro são necessários neste campo.

Amino distribuição de ácidos de ESTs contendo trinucleotide conjunto repete

Em relação aos resultados acima mencionados sobre a importância do triplete repete na indução de cancro do pulmão, o tipos de aminoácidos previstos e as suas distribuições de ESTs com repetições trinucleotídicas foram analisados ​​em bibliotecas normais e cancerosos. Em consonância com o nível de EST (mRNA), o padrão de EST-SSR ao nível de aminoácidos expressão foi muito diferente.

O número de repetições de aminoácidos era de aproximadamente 3 vezes mais elevados no tecido canceroso do que no tecido normal (582 contra 178 repetições, respectivamente, p = 0,01, Tabela 4). Além disso, o tipo de aminoácidos expressas era notavelmente diferente entre cancerosas e tecidos normais (Tabela 4, Figura 5). Arg (14,60%), Pro (12,71%), Ser (12,19%), Leu (10,19%), e Ala (8,03%) foram os aminoácidos mais abundantes em tecidos de cancro do pulmão. Em contraste, Leu (18,53%), Ala (16,23%), Thr (8,42%), Gln (8,42%) foram os aminoácidos dominantes em tecido normal. Sem Thr ou His foi encontrado nas EST-SSRs de amostras cancerosas. Por outro lado, Lys, Met, e foram Tente não encontrados em tecidos normais. O resultado do estudo de aminoácidos de EST-SSR mostra claramente que a instabilidade de SSR induzida no tecido canceroso, não só afectar a produção de ARNm, mas também tem um efeito directo sobre a forte proteína produzida.

EST distribuições -SSR dentro tecidos cancerosos

Figura 6 apresenta a distribuição das diferentes classes de SSRs (dinucle�idos, trinucle�idos, tetranucleótidos, pentanucleotides e hexanucleotides) em ESTs entre 2 tecidos cancerosos diferentes. Além disso, os diferentes tipos de SSR em cada classe foram comparados pelo teste t pareado (Informações de Apoio S7). Como mostrado na Figura 6 e Informação de Apoio S8, não há diferença significativa entre as diferentes classes das 2 bibliotecas cancerosas, e EST-SSR têm padrões de expressão semelhantes entre os tecidos cancerosos.

As percentagens de dinucleótidos trinucleótidos, tetranucleótidos, pentanucleotides, e hexanucleotides foram comparadas entre tecidos cancerosos e normais. EST-SSRs atuais padrões de distribuição semelhantes entre tecidos cancerosos.

Discussão

câncer

pulmão é a principal causa de mortes por câncer em mulheres [27] e os homens [28] em todo o mundo . A maioria dos tumores de pulmão são malignos, e somente cerca de 2% das pessoas diagnosticadas com câncer de pulmão metastático estão vivos 5 anos após o diagnóstico [28]. O diagnóstico de câncer de pulmão em estágio inicial aumenta drasticamente as taxas de sobrevivência a 49% por cinco anos ou mais.

Uma das aplicações mais proeminentes de marcadores moleculares é a detecção de doenças em estágios iniciais. No entanto, nenhum fabricante de confiança foi introduzido para a predição de câncer de pulmão. Os microssatélites são o actual método de escolha porque SSR pode ser rastreada quer nas regiões não codificantes [33] com alta mutabilidade proteína ou codificação e pode desempenhar um papel significativo na evolução do genoma [17]. EST-SSRs, seguindo o comportamento de SSRs na parte de codificação do genoma, servem para monitorizar a modulação de microssatélites e também fornecer informações valiosas sobre os efeitos da SSRs na indução da doença e alteração funcional de genes durante a doença.

neste estudo, nós investigamos a distribuição SSR nos tecidos pulmonares tumorigênicos e normais para procurar novas pistas a nível molecular desse tipo de câncer. Para atingir este objectivo, as bibliotecas de tumores de câncer de pulmão foram comparados com tecido pulmonar normal em três etapas: modulação EST-SSR, composição de aminoácidos de traduzido EST-SSRs e anotação funcional dos produzidos EST-SSRs. Analisando um grande número de ESTs no pulmão canceroso e tecidos normais (24870) forneceu uma estimativa útil da modulação genoma e alteração no câncer de pulmão.

Ao nível dinucleotídeo, GC /GC apenas foi detectado no tecido canceroso. GGC e CGC foram os mais frequentemente expressa repetições dos trinucleotídeos em tecido canceroso, enquanto esses SSRs não foram expressos em tecido normal. Na verdade, ESTs pulmonares tumorigênicos eram ricas em conteúdo de GC em comparação com ESTs normais. Esta observação está de acordo com relatos prévios de outros tipos de câncer em humanos [2], os animais [34], e até mesmo nas plantas [35]. As funções possíveis de conteúdo GC e repetir de expansão em algumas doenças humanas foram previamente realçado [36].

Observou-se a maior diferença entre tecidos normais e cancerosos na expressão de trinucleótidos repetições em tandem dentro de todas as repetições estudados. O número de trinucle�idos em ESTs câncer de pulmão foi 3 vezes maior do que em ESTs normais (P = 0,05). Além disso, o teste de correlação de Pearson demonstrado que os tecidos cancerosos gerar diferentes tipos de trinucleótidos porque correlações negativas e significativa (p = 0,05, Tabela 3) foram encontrados entre o cancro e tecidos normais, em termos da expressão de tipos de trinucleótidos. A distribuição diferencial de trinucle�idos em bibliotecas normais e cancerosas era muito perceptível; enquanto repete tripletos foram distribuídos com frequências quase igual em tecido normal, a distribuição de repetições de tripletos era não uniforme no tecido canceroso.

De acordo com os resultados do presente estudo, a instabilidade microssatélite também foi encontrado em tumores amostras de pacientes turcos com cancro da mama [37]. instabilidade microssatélite pode reflectir erros de replicação que são induzidos pelos genes reparação de emparelhamentos defeituosos, resultando no aparecimento de novos alelos, não herdados em células tumorais, e representa uma via específica de desenvolvimento do tumor. Curiosamente, esta via de desenvolvimento está correlacionada com as características clinicopatológicas de cancro da mama [3].

As possíveis estruturas de SSR, especialmente repetições de tripletos, que estão envolvidos em doenças humanas foram [38], [39 estudaram extensivamente ], [40], [41], [42], [43]. Várias repetições demonstraram potencial considerável para formar estruturas alternativas, tais como (CTG)

n, (CAG)

n, (CCG)

n, (CGG)

n, (GAA)

n, (TTC)

n, (AGG)

n, (CCT)

n, (TGG)

n e (CCA)

s [44].