Abstract

Fundo

A inflamação crônica associada à colite ulcerativa predispõe os indivíduos a um maior risco de câncer de cólon. O objectivo destes estudos foi identificar microRNAs que são aberrante regulados durante a inflamação e podem participar na transformação de células epiteliais do cólon no ambiente inflamatório.

Metodologia /Principais Achados

Temos utilizar PCR quantitativa arrays para comparar a expressão microRNA (miRNA) em tumores e controlar células epiteliais do cólon isolados a partir de dois pontos distais dos camundongos cronicamente inflamadas e APC

Min /+ camundongos. estatísticas grau de ordem foi utilizada para identificar os miRNAs diferencialmente regulados em tumores que surgiram devido à inflamação crônica e /ou com a linha germinal mutação APC. Foram identificados oito miRNAs de alta prioridade: miR-215, miR-137, miR-708, miR-31 e miR-135b foram diferencialmente expressos em tumores APC e miR-215, miR-133a, miR-467d, miR-218, miR-708, miR-31, e miR-135b em tumores associados com colite. Quatro destes (miR-215, miR-708, miR-31 e miR-135b) eram comuns a ambos os tipos de tumores, e desregulação desses miRNAs foi confirmada em um conjunto de amostras independentes. predição alvo e análise de caminho sugere que estes microARNs, no agregado, regulam vias relacionadas com MAPK, PI3K, WNT, e TGF-β, todos os quais são conhecidos por estarem envolvidos na transformação de sinalização.

Conclusões /Significado

Nós concluímos que estes quatro miRNAs são desregulada em algum momento muito cedo na transformação de células epiteliais do cólon. Esta resposta não é dependente do mecanismo de início de transformação (inflamação contra mutação de linha germinal), sugerindo que os miARNs que identificamos são susceptíveis de regular a vias de sinalização importantes que são centrais para eventos precoces na transformação de células epiteliais do cólon.

Citation: Necela BM, Carr JM, Asmann YW, Thompson EA (2011) a expressão diferencial de microRNAs em tumores de cronicamente inflamado ou genético (APC

Min /+) Todos os modelos de cancro do cólon. PLoS ONE 6 (4): e18501. doi: 10.1371 /journal.pone.0018501

editor: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de Câncer, o Brasil

Recebido: 31 de janeiro de 2011; Aceite: 1 de março de 2011; Publicação: 12 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Necela et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão de Desenvolvimento CCFA carreira para BMN. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNAs (miARNs) são uma classe de pequenos RNAs não codificantes de 19 a 22 nucleótidos implicados numa série de processos celulares importantes, tais como o desenvolvimento, diferenciação, proliferação, progressão do ciclo celular, apoptose, inflamação e respostas de stress [ ,,,0],1] – [8]. MicroRNAs são geralmente acredita-se que funcionam através da ligação da 3’UTR do ARNm alvo e seja inibindo a tradução ou, em alguns casos que induzem degradação de ARNm [3], [9]. Bioinformatic estudos sugerem que miARN pode regular um terço do transcriptoma [10], [11]. Dada a sua propensão para regular numerosos processos e genes alvo, não é de surpreender que a expressão aberrante de pequenos RNAs tem sido associada a numerosas condições patológicas tais como a asma, a diabetes, o rim, neurodegenerativas, e doença cardiovascular. Em particular, o diferencial de expressão miRNA tem sido implicado em muitos cancros, incluindo mama, tireóide, pulmão, pâncreas e câncer de cólon.

Até o momento, mais de uma dúzia de estudos têm relatado uma associação de expressão miRNA aberrante no câncer de cólon [ ,,,0],12] – [31]. Expressão de miARNs em tumores do cólon pode ser influenciado por inúmeras variáveis ​​clinicopatológicas tais como grau do tumor e a localização, o estado de mutação (p53, APC, MSI) [32] – [36], e o conteúdo celular (isto é,>

células inflamatórias ), bem como variáveis ​​analíticas tais método de extracção de pré-analítica e, de fixação, e a escolha da plataforma analítica (sequência, qPCR, ou microarray). Como resultado dessas variáveis, não há consenso sobre quais miRNAs são diferencialmente expressos em tumores de cólon. No entanto, alguns microRNAs têm consistentemente emergiu como sendo desregulado no câncer de cólon. Entre estes, o miR-31 é regulada positivamente de forma consistente [12] – [17], [20], [22], [23], [25] e aglomerados microRNA miR-143 /-145 [18], [21] – [ ,,,0],23], [37] – [40] e miR-194 /-215 [18], [21] – [23], [37], [38], [41] reprimidos no câncer de cólon. MicroRNA -31 tem sido associada a migração celular e invasão de células cancerígenas do cólon [42], [43]. MicroRNAs -192 e -215 inibir a proliferação celular e induzem a paragem do ciclo celular de uma forma dependente de p53 [37], [44], [45]. Da mesma forma, o miR-143 e miR-145 inibe o crescimento de células, com esta acção, em parte, atribuído a através da inibição de genes alvo, tais como DNMT3A, IRS-1, Sim1, STAT1, e FLI1 [21], [46] – [ ,,,0],50].

Uma variável clínica que não foi adequadamente abordado é o estado inflamatório do tumor de cólon. A ligação directa entre inflamação e câncer tem sido firmemente estabelecida, com NFkB emergindo como um jogador-chave [51], [52]. A inflamação é acreditado não só para alterar e promover o microambiente do tumor, mas em si, pode conduzir directamente a tumorigénese. Os pacientes com colite ulcerosa, uma doença crônica, recidivante inflamação no cólon, têm maior risco de desenvolver câncer de cólon. Uma recente meta-análise revelou probabilidades de cancro do cólon em colite ulcerosa de 2% após 10 anos, 8% após 20 anos, e 18% após 30 anos de doença [53]. Um possível mecanismo pelo qual vias inflamatórias podem influenciar transformação é através da desregulamentação dos miRNAs. Evidências crescentes sugerem que miARNs são capazes de regular os processos inflamatórios e são desreguladas em várias doenças inflamatórias [54]. Recentemente, a desregulação da microARNs tem sido observada em pacientes com colite ulcerativa [55], [56]. No entanto, pouco se sabe sobre a conseqüência funcional da desregulação dos miRNAs durante a colite crônica nas células epiteliais, e menos ainda na tumorigênese. Embora limitados, estes estudos fornecem ao precident que a desregulação de um subconjunto de microARNs durante colite crónica pode estar associada com a transformação neoplásica metaplásico e metaplásicas. Para este fim, pode ser microARNs biomarcadores úteis para ajudar a prever o risco de malignidade em pacientes com doença activa de longa data.

Os estudos descritos abaixo foram realizadas para começar a testar a hipótese de que um subconjunto de microARNs é desregulado no epitélio intestinal durante a colite e contribuir para a carcinogênese. Medimos miARNs por PCR de baixa densidade matrizes quantitativo TaqMan utilizando ARN extraído de células epiteliais do cólon de ratos induzidos com sulfato de dextrano aguda colite (AC), colite crónica (CC), os tumores do cólon associada com colite (CAC), e tumores do cólon em APC

Min /+ camundongos. Identificamos expressão diferencial de miRNAs comuns e único para cada condição de doença. Em particular, demonstra-se que um subconjunto de miARNs é desregulada em ambos os tumores, tanto de origem inflamatória e genética. Estes miRNAs têm o potencial de controlar ambas as redes de transcrição anti-oncogênicos e pró-oncogênicos, influenciando assim o desfecho tumorigénico.

Resultados

a comparação dos modelos analíticos utilizando colite aguda (AC) amostras

Quantificação da expressão de miARN em amostras de tecido é complicada pelo facto de que um não tem meios directos óbvias para identificar controlos endógenos adequados que podem ser usados ​​para normalizar os dados de expressão e correcção para as diferenças na quantidade de ARN analisadas ou a eficiência de miARN extracção ou ADNc conversão em amostras provenientes de diferentes tecidos. Este potencial problema é particularmente agudo nos estudos como os que serão descritos a seguir em que se comprometem a comparar miRNA abundância em tecidos derivados de camundongos de diferentes idades, dietas, estado inflamatório, e carga tumoral. Nós, portanto, levada a cabo uma experiência piloto para comparar diferentes ferramentas analíticas e modelos estatísticos para identificar miRNAs diferencialmente regulados em células epiteliais do cólon. Para este fim, extraída miARNs de preparações de células epiteliais a partir de dois pontos distais de controlo C57BL /6J e os ratos que tinham sido expostas a 3,5% DSS na água potável durante quatro dias. Histologicamente, os dois pontos de controlo e os ratos tratados com DSS eram indistinguíveis, com nenhuma evidência da ruptura da barreira, a perda de cripta, ou invasão por células imunes. Embora estes tecidos formalmente representam um estado pré-inflamada, as amostras serão designados AC (colite aguda) na discussão acompanhamento, enquanto que os controles serão identificados como Con.

Nós usamos matrizes AB TaqMan para medir a abundância de 384 miRNAs em amostras AC e Con, expressa limiares críticos (TC) para cada detector de miRNA. Três abordagens analíticas foram comparados. A mais simples delas era estatísticas ordem de classificação. Cada miRNA dentro de uma determinada amostra foi classificado em vigor leitura analógica de miRNA abundância (valor Ct). Detectores que foram marcados como “indetectável” foram atribuídos valores Ct de 40 anos, e todos os miRNAs com Ct = 40 foram atribuídos a mesma posição dentro de uma amostra. Um teste t (assumindo variância desigual) foi então realizada para comparar as atribuições de ordem de classificação da miRNAs nos dois grupos de amostras diferentes, de modo a identificar os miRNAs cuja média de ordem de classificação da expressão mudou significativamente como resultado do tratamento. A segunda abordagem analítica envolvida uma normalização média simples das amostras, seguido por um teste t (assumindo variância desigual) para comparar os valores de Ct entre Con e amostras AC. A expressão diferencial é expressa como ΔCt (abreviado DCt), que representa (meanCtMed_Norm_AC) – (meanCtMed_Norm_Con). O terceiro método utilizado o pacote Integromics Statminer, que utiliza uma implementação baseada Bayesiana empírica-Limma para calcular um hyperparamter que por sua vez é usado para modular a variância e aumentar os graus de liberdade entre as amostras. O pacote Statminer também calcula a variação entre os controles endógenos definidos pelo usuário e identifica aqueles com a menor variância em todas as amostras. O pacote Statminer permite múltiplos controles endógenos para ser utilizado para normalizar o conjunto de dados. No nosso caso os controles endógenos menos variantes foram sno135 e miR-25, e estes foram utilizados para normalizar os dados. A expressão diferencial é expressa como ΔΔCt (DDCT abreviado), o que representa (meanΔCtLimma_SM_Tumor) – (meanΔCtLimma_SM_Con) Assim, comparou um modelo relativamente simples em que nenhuma tentativa foi feita para normalizar os dados (estatísticas de ordem posição, Rnk_Diff abreviado), uma normalização média simples modelo (Med_Norm), e um modelo mais complicado empírica Bayesian que usou vários controles endógenos para normalizar os dados (Limma_SM).

a comparação das mudanças na ordem de classificação dos miRNAs individuais (graduação diferença AC-Con) e a mudança log2 vezes a partir de dados normalizados mediana [mediana Normalizada DCt (AC-Con)] é mostrada na Figura 1A, enquanto que uma comparação semelhante de mudança dobra log2 após Limma normalização para sno135 e miR-25 [DDCT (AC-Con)] é mostrado na Figura 1B. As distribuições são, obviamente, quase idênticas, tal como indicado por Spearman Rank coeficientes de correlação de 0,8324 e 0,8328 para as Figuras 1A e B, respectivamente. Esta semelhança resultados de identidade perto dos dados de expressão calculados a partir de dados normalizados e Limma normalizados mediana (Figura 1C, Spearman coeficiente de correlação = 0,9996). A observação de que dois protocolos de normalização muito diferentes produziram resultados essencialmente idênticos, provavelmente indica que há muito pouca variação, seja analítica ou biológico, entre as nossas amostras.

Alterações na ordem de classificação, definidos classificação como média em amostras AC menos significa classificação em amostras Con, são plotados contra os valores DCT (média Ct_AC menos significam Ct_Con) no Painel a ou DDCT (média DCt_AC menos significa DCt_Con) no Painel B. Limma valores DDCT normalizados para miRNAs individuais são plotados contra os valores DCT normalizados médios no Grupo C . miRNAs diferencialmente expressos foram filtrados em P 0,01 e classificação mudança da ordem ≥10 ou alteração dobra log2 ≥1.0. Sobreposição entre miRNAs diferencialmente expressos identificados pelas estatísticas de ordem rank (Rnk_Diff), t-teste usando dados normalizados mediana (Med_Norm) ou a implementação Statminer de Limma (Limma_SM) é mostrado no painel de D.

Usando estas três abordagens foram identificadas 193 miARNs que foram marcados como significativamente diferentes (p≤0.01) em uma ou mais das análises (listados na Tabela S1). Nós imposta filtros adicionais de ≥ grau de diferença (± 10) e p≤0.01 para identificar 73 miRNAs diferencialmente expressos por estatísticas de ordem de classificação. Quando filtrada sobre change≥ log2 dobra (± 1,0) e p≤0.01 identificamos 130 miARNs que foram diferencialmente expressos na análise normalizada mediana e 134 miARNs que foram diferencialmente expressos por análise Limma. Um diagrama de Venn de sobreposição entre estas miARNs é mostrado na Figura 1D. Um pouco para nossa surpresa, havia apenas 51 miRNAs que satisfizeram todas as condições para todos os modelos. Uma diferença três rank correlação dimensional comparando, DCt (normalização mediana), e DDCT (Limma normalização) revelou um coeficiente de correlação de três dimensões de 1,00 para estas 51 amostras (dados não mostrados). Estes miRNAs representam alvos alta probabilidade de que são susceptíveis de desempenhar algum papel nos primeiros estágios da inflamação. (Estes miARNs são identificados em negrito na Tabela S1). Ambos normalização mediana e Limma proporcionou um número significativo de valores extremos, enquanto que a análise estatística ordem de classificação exibiu sobreposição quase completa com, pelo menos, um dos outros modelos (Fig. 1D).

a nossa conclusão desta comparação inicial de três métodos de normalização diferentes é que todos eles dão resultados muito semelhantes, em termos de abundância relativa miRNA, em um conjunto de dados com pouca variação analítica ou biológica dentro do grupo controle e experimental. Os modelos estatísticos diferentes dão significativamente diferentes valores de p, que é provavelmente devido, em grande parte, ao pequeno número de amostras que foram incluídos nesta análise, bem como o uso de variância moderado (Limma) versus variância unmoderated (t-teste). No geral, as estatísticas de ordem posto funciona pelo menos tão bem como qualquer um dos modelos normalizados, tende a ser mais conservador em termos de número de miRNAs diferencialmente reguladas, e tem as vantagens adicionais que não requer nenhum conhecimento de controles endógenos apropriados e não faz suposições sobre quantidades iguais de RNA ou igual eficiência do miRNA extração ou conversão de cDNA de amostra para amostra. Nós, portanto, eleito para prosseguir com nossas análises usando estatísticas de ordem de classificação para identificar miRNAs diferencialmente expressos. No entanto, as mudanças na ordem de classificação não são informativas em termos de absoluto (ou, mais precisamente analógico) abundância miRNA, portanto, invocados Limma para calcular a abundância normalizado, expresso em DDCT, o que corresponde a -log2 mudança vezes normalizados para sno135b /miR-25 .

Identificação de miRNAs diferencialmente expressos em modelos experimentais de cancro do cólon associada a colite e polipose adenomatosa familiar coli

Nós usamos matrizes AB TaqMan miRNA para medir a abundância de 384 miRNAs em tumores isolado de distal dois pontos de APC

Min /+ camundongos (tumores APC) e tumores que se formaram nas dois pontos distais dos camundongos cronicamente inflamadas (tumores CAC). A APC

Min /+ camundongos foram retirados criadores, 120d de idade, e mantido em ração de alta criador de gordura. tumores CAC foram isoladas a partir de ratinhos que tinham sido submetidos a 12 ciclos de baixo nível, a inflamação induzida por DSS, tal como descrito em Materiais e Métodos. Como amostras de controlo, foram isoladas células epiteliais do epitélio adjacente, sem envolvimento da APC

Min /+ (controle APC) ou camundongos cronicamente inflamadas (controle CC). estatísticas grau de ordem foi utilizada para identificar candidato miRNAs diferencialmente expressos em APC e tumores CAC. (Valores Ct bruto para estas amostras são apresentados na Tabela S2.)

Os valores do Ct de todos os miARNs em tumores individuais e as amostras de controlo foram determinados e força classificados como descrito acima e o t-teste foi utilizado para identificar miARNs cuja média classificação foi significativamente diferente nos controles e tumores. As ordens de classificação média para miARNs individuais de controlo da APC e tumores APC são apresentadas na Figura 2A. Houve, em geral, uma boa correspondência entre ordem de classificação da miRNA abundância no controle APC e amostras de tumor APC (coeficiente de correlação Spearman Rank Ordenar = 0,973, p = 2.0E

-07), no entanto 10 miRNAs (mostrado como símbolos vermelhos ) caiu fora dos intervalos de previsão de 95% (como linhas paralelas na Fig. 2A).

a média de classificação ordens de miRNA abundância (com base em valores Ct) foram determinados para os tumores dos dois pontos distais ou cólon distal adjacente uninvolved células epiteliais (painel A). SigmaStat foi usada para calcular os intervalos de confiança de 95% para estes dados (linhas sólidas) paralelas e os detectores de miARN que caíram fora destes intervalos são preenchidos no vermelho. Da mesma forma, em comparação ordem de classificação de expressão dos miRNAs de tumores que se formaram nas dois pontos distais dos camundongos cronicamente inflamadas (CAC) e em preparações não envolvidas, cronicamente inflamadas distais do cólon epiteliais celulares (controles CC), como mostra a detectores Painel B. microRNA que caiu fora dos intervalos de confiança de 95% são preenchidos em vermelho.

Figura 2B compara ordens de classificação da abundância de miRNAs medidos em amostras CCcontrol e CACtumors. Tal como acontece com as amostras da APC, houve uma alta geral de correspondência entre a abundância ordem de classificação dos miRNAs nestas amostras (coeficiente de correlação Spearman Rank Ordenar = 0,970, p 2.0E

-07). No entanto, 10 miRNAs (símbolos vermelhos) caiu fora dos intervalos de 95% de previsão (Fig. 2B), indicando que as fileiras destes miRNAs foram diferentes nos controles e tumores, consistente com uma alta probabilidade de que estes miRNAs foram diferencialmente expressos. É nossa experiência que muito grandes alterações no miRNA abundância (como evidenciado neste caso por grandes diferenças de ordem classificação) são ocasionalmente associados à cinética atípicas de amplificação dos miRNAs em pequena quantidade. Por conseguinte, inspeccionadas visualmente as curvas de amplificação qPCR para cada um dos miARNs em cada amostra e eliminado aqueles para os quais a cinética de amplificação de log-linear (1ct /ciclo) não obtiveram. Este passo curadoria reduziu o número de alta probabilidade miARNs diferencialmente expressos em tumores APC para 5 e o número de tais tumores em miARNs CAC a 7. Como mostrado na Tabela 1, dois miARNs foram reprimidos em tumores APC (de miR-215 e miR-137 ), em comparação com o controlo epitélio adjacente, ao passo que foram induzidos 3 miARNs (miR-708, miR-31, o miR-135b). Somente 1 miRNA foi reprimido em tumores CAC comparação para controlar cronicamente epitélio inflamado (miR-215), enquanto que 6 miRNAs foram induzidos em tumores CAC (miR-133a, miR-467d, miR-218, miR-31, miR-135b). Três miRNAs foram induzidos em ambos APC e amostras CAC (miR-31, miR-135b, e miR-708) e 1 miRNA foi reprimido em ambas APC e amostras CAC (miR-215). Além disso, 1 miARN foi reprimida exclusivamente nos tumores APC (miR-137), e 3 foram induzidas miARNs exclusivamente nos tumores CAC (miR-133a, miR-467d, e miR-218). Os 8 miRNAs diferencialmente expressos na Tabela 1 foram, portanto, selecionada para validação.

Embora as estatísticas de ordem classificação é uma ferramenta útil para miRNAs de nomeação que são diferencialmente expressos, uma abordagem mais quantitativa é necessária para determinar a magnitude a resposta em qualquer comparação dada. Para este fim foi utilizada a implementação Statminer de Limma para realizar a normalização e resumo dos dados de expressão de matriz TaqMan. Os dados são apresentados na Figura 3 como o log 2 transformação de mudança de dobragem para cada uma das 8 miARNs foco, onde a mudança da dobra = – [média (DCtTumor-DCtControl)]. Os valores P foram calculados para cada comparação usando o Limma aplicação Bayesiana empírica do teste t para comparar os valores normalizados (DCT) para os tumores e controlos. Como mostrado na Figura 3, todos os miARNs candidatos exibiram diferenças grandes, estatisticamente significativas na expressão em tumores APC (Fig. 3A) e CAC (Fig. 3B), em relação ao controlar amostras.

MicroRNA abundância nos quatro diferentes coortes amostra foi normalizada utilizando Statminer e sno135 /miR-25 como controles endógenos. controlos APC foram normalizados para tumores APC (Painel A) e os controlos Cc para tumores CAC (painel B). A abundância de cada um dos 8 candidato miRNAs é representado como mudança log2 vezes (média tumor Ct – média Ct de controlo) e p-valores foram calculados usando o Limma implementação Bayesiana empírica do t-teste moderada

Foram utilizados os primers de cDNA de conversão convencional e reagentes TaqMan qPCR para confirmar a expressão diferencial dos quatro miARNs que exibiram respostas de regulação comuns nas amostras de tumor APC CAC e utilizados na análise inicial qPCR multiplex. Como mostrado na Figura 4, a repressão do miR-215 foi confirmada em ambas as amostras de tumor e CAC APC, enquanto que a indução de miR-708, miR-31, e miR-135b também foi confirmada em ambos os tumores de origens. Nós preparamos um conjunto adicional de controles e tumores de ambos colite crônica e ratos APC e mediram a abundância de miR-215, miR-708, miR-31 e miR-135b. A Figura 5 mostra que, dentro do erro experimental, os resultados previstos a partir da ordem de classificação análises estatísticas foram validados em uma amostra coorte independente.

As amostras de ARN analisadas nas Figuras 2 e 3 foram convertidos em ADNc utilizando iniciadores hairpin indivíduo Taqman RT, ao contrário da mistura de iniciadores universais usados ​​para as matrizes de TaqMan. Assim, preparações de ADNc diferentes foram preparados e ensaiados para miARN abundância em amostras de APC (Painel A) e amostras de CAC (painel B). MicroRNA abundância foi normalizada com sno135 e p-valores calculados com o protocolo Statminer Limma. Os dados para cada miRNA foram calibrados para expressão (2e em DCT) na amostra de controlo relevantes. As barras representam a média e desvio padrão para cada miRNA, n = 4. * indica valor de p . 0,05

RNA foi preparado a partir de um conjunto independente de tumores APC (n = 9) e controles ( n = 9) (Painel A) ou de tumores CAC (n = 4) e controlos (n = 8) (Painel B). MicroRNA abundância foi medido pelo tronco específica Taqman microRNA PCR e normalizada com sno135. Os dados foram normalizados utilizando Statminer e calibrado para expressão de miARN individuais nas amostras de controlo. As barras representam média e desvio padrão. * Indica p-valor . 0,05

expressão Focagem miARN em cancros de cólon humano primários

O padrão de expressão dos 8 miARNs foco listados na Tabela 1 indica que alguns ou todos estes miARN pode desempenhar um papel potencial na etiologia dos adenomas da fase inicial em que se formam APC

Min /+ ratos e /ou ratinhos que foram submetidos a colite crónica experimental. Uma pesquisa da literatura indica que alguns destes concentram miARNs tenham sido previamente relatado para ser diferencialmente expresso em cancros do cólon humanos primários, como mostrado na Tabela 2. MicroRNAs miR-31 e miR-135b têm sido relatados para ser induzida no cancro do cólon, semelhante ao a resposta que temos observado em tumores em fase inicial em cronicamente inflamado ou APC

Min /+ camundongos. Do mesmo modo, observou-se a regulação negativa de miR-215 em ambos os tipos de tumores, e regulação negativa de miR-133a em CAC mas não tumores APC. Ambos os miRNAs são relatados para ser reprimidos em cancros do cólon humano [18], [21] – [23], [37]. Nossas análises indicam que estas espécies de miRNA são induzidos muito cedo na transformação e, provavelmente, afectar as vias que são centrais para processos que são independentes do mecanismo da iniciação sinalização.

Análise de alvos de miRNA potenciais e funções no início de tumores de estádio

Vários algoritmos diferentes têm sido desenvolvidos para prever alvos de miARN, com base em diferentes parâmetros para avaliar complementarmente de sequências de semente de miARN a sequências dentro de regiões não traduzidas a 3 ‘de ARNm [10], [57] – [59 ]. Embora essas análises estão longe de ser perfeito em termos de capacidade de previsão, eles continuam a ser as únicas ferramentas disponíveis para a previsão de alvos de miRNA, ea saída dessas análises é útil para predizer conexões hipotéticas entre miRNAs, caminhos de destino e funções biológicas. Uma vez que diferentes algoritmos muitas vezes produzir resultados diferentes, usamos PicTar, microcosmo, TargetScan e DianaT para gerar listas de alvos potenciais para cada um dos miRNAs diferencialmente expressos. Foram incluídos nestas listas únicas metas que foram conservadas no mouse e transcritos humanos, e as previsões individuais foram reunidas para formar uma lista mestra de alvos putativos para todos os quatro miRNAs. Esta lista foi então cotejadas com os dados de microarranjos de rato distal células isoladas do cólon epiteliais [60], e os alvos que não foram marcados como “presente” nestas células foram eliminados. As listas de curadoria foram então usados ​​para a previsão do percurso.

Estamos focados nas 4 miRNAs que foram diferencialmente expressos em lesões em fase inicial, tanto de origem genética e inflamatória (miR-215, miR-31, miR-708, miR -135b). Utilizando os filtros descritos acima, foram identificadas 527 mRNAs alvo potenciais que foram expressos em células epiteliais do cólon distai do rato. análise do gene ontologia (Tabela 3) identificou o cancro como a função biológica de ponta associada a este conjunto de genes, com 130 dos 527 alvos ligados ao câncer através de termos GO (faixa de valor-p 5.86E

-05 para 2.87E

-02). GO termos associados com Gene Expression emergiu como o topo Função Molecular e Celular, com 131 alvos ligados a esta categoria (valor-p gama 5.78E

-11 a 2.87E

-02). A função Tox superior era de sinalização TGF-β (p = 5.2E

-04, com 9/77 componentes de sinalização identificados como potenciais alvos). As funções Tox estatisticamente significativas remanescentes foram relacionadas com receptores nucleares que têm sido extensivamente estudados no contexto da fisiologia das células epiteliais do cólon e da patologia, incluindo TR /RXR, VDR /RXR, e FXR /RXR.

estas funções GO hipotéticos prever uma forte ligação entre os quatro miRNAs e transformação de células epiteliais do cólon diferencialmente expressos. Esta ligação hipotética é enfatizada pelos dados apresentados na Figura 6, em que os alvos miRNA putativos (mostrados em verde) são vertidos na baseadas no conhecimento mecanismos (Engenho) molecular do câncer via canonical (p = 1.14E

-06, 28 metas previstas /372 componentes da via). funções críticas de membrana sinalização relacionadas com Ras /MAPK, PI3K, e WNT /β-catenina representam ligações mecanicistas potenciais entre esses miRNAs e de transformação, enquanto que as funções nucleares ligadas à RB /E2F controlo surgem como potenciais mediadores de controle do ciclo celular. Finalmente, como indicado pela análise GO da função Tox, TGF-β /BMP sinalização /SMAD é nomeado como um elo potencial muito significativo entre estes quatro miRNAs e transformação de células epiteliais do cólon.

alvos de mRNA putativo para o 4 miRNAs focais foram compilados utilizando PicTar, microcosmo, TargetScan e bancos de dados DianaT. metas previstas foram sobrepostos em cinza nas Ingenuity Mecanismos Moleculares de cancro da via canonical.

Discussão

O nosso objectivo central foi comparar a expressão miRNA em tumores do cólon que surgem devido à inflamação crônica e mutações germinativas em sistemas modelo. Ficou claro desde o início que a normalização dos dados seria um problema, já que estávamos comparando muito diferentes estados de tecido (

por exemplo

, camundongos cronicamente inflamado em laboratório padrão comida para contra criadores de idade em dietas ricas em gordura.); e não há bem estabelecida critérios objectivos para a identificação de controles endógenos adequadas para a normalização de expressão miRNA sob tais condições (Para uma revisão desta questão, ver [61]). Nosso primeiro objetivo foi, portanto, a utilização de um conjunto de amostras independentes para comparar modelos diferentes para a normalização. Para este fim, preparadas e analisadas as células epiteliais do cólon distal de controle e tecidos inflamação aguda, utilizando um modelo de colite aguda DSS convencional. Foram examinados um precoce, pré-inflamado, estado, antes da perda da integridade detectável histológica do epitélio do cólon distai, achando para minimizar as alterações na expressão de miARN que podem estar associadas com a infiltração massiva de células do sistema imunológico. Usando três abordagens analíticas diferentes foram identificados 51 alvos de alta prioridade miARN que são susceptíveis de desempenhar um papel significativo no controlo da expressão de genes em células epiteliais nos primeiros estágios de inflamação induzida por DSS. Embora esses resultados representam, a nosso conhecimento, o primeiro relato detalhado do diferencial de expressão miRNA neste modelo colite, nós não analisados ​​ainda mais esses dados. Em vez disso, usou estes dados para validar a nossa escolha de estatísticas de ordem de classificação para identificar miRNAs diferencialmente expressos. Esta abordagem analítica não exijam a identificação dos controles internos adequados e é particularmente adequada para a análise de grupos relativamente pequenos de amostras, uma vez que não suposições são necessárias sobre o carregamento de ARN igual ou eficiência de extração de miRNAs ou conversão de cDNA a partir de diferentes tipos de tecidos [62 ]. Em geral, as diferenças de ordem de grau que observamos correlacionam-se bem com abundância miARN analógico, expressa como transformada discreta de cosseno os dados normalizados mediana ou DDCT na sno135 /miR-25 normalizada (Statminer) analisa. No entanto, os valores de p distribuídas pelos diferentes modelos estatísticos variou consideravelmente, pelo menos em parte, devido ao pequeno tamanho da amostra eo uso de moderado (Limma Bayesiana empírica) versus unmoderated (t-test) abordagens para estimar a variância. Dado que qualquer modelo estatístico é susceptível de quebrar com pequenos conjuntos de amostras, nós somos eleitos para usar os, a maioria abordagem conservadora mais simples: as estatísticas ordem de classificação. Usamos Statminer normalização (contra sno135 e miR-25) para extrair abundância relativa miRNA.

estatísticas ordem de classificação foi utilizada para identificar 8 miRNAs diferencialmente expressos em tumores que se formaram nos dois pontos distais dos APC

Min /+ ratos e camundongos cronicamente inflamadas. Deve notar-se que estes tumores são essencialmente os adenomas e, assim, representam uma das primeiras fases da transformação. Devemos também enfatizar que estes 8 miRNAs representam apenas as alterações mais importantes e, portanto, provavelmente o mais reprodutíveis, na expressão de miRNA nestas amostras.