Abstract

Em um esforço para contornar a resistência a rapamicina – um inibidor de mTOR – que procurou para novas rapamicina a jusante-alvos que podem ser jogadores-chave na resposta das células cancerosas à terapia. Verificou-se que a rapamicina, a concentrações de nM, aumento da fosforilação do factor eucariótico de iniciação (EIF) 2α em células de rapamicina-sensíveis e dependentes de estrogénio MCF-7, mas teve apenas um efeito mínimo sobre eIF2α fosforilação na MDA triplo negativo rapamicina-insensível células -MB-231. A adição de salubrinal – um inibidor de eIF2α desfosforilação – a diminuição da expressão de um marcador de superfície associada com a capacidade de auto-renovação, a senescência e aumentou a morte de células clonogénicas, induzida, sugerindo que a fosforilação excessiva de eIF2α é prejudicial para a sobrevivência das células. O tratamento de células com o aumento induzido por radiação melhorada salubrinal na fosforilação eIF2α e morte clonogénica e mostraram que as células irradiadas são mais sensíveis a um aumento da fosforilação eIF2α do que os não-irradiadas. Semelhante a salubrinal – a variante eIF2α phosphomimetic – S51D – aumento da sensibilidade à radiação, e ambos aumento induzido por radiação revogada no gene de susceptibilidade tipo de cancro da mama 1, implicando, assim, reforçada fosforilação de eIF2α na modulação da reparação do ADN. Com efeito, salubrinal inibida final não homóloga juntando assim como reparação de recombinação homóloga de quebras de cadeia dupla, que foram induzidas por I-Scel em plasmídeos repórter da proteína verde fluorescente. Em adição ao seu efeito sobre a radiação, salubrinal reforçada fosforilação eIF2α e morte clonogénica em resposta ao inibidor de histona desacetilase – vorinostat. Finalmente, o inibidor competitivo catalítica de mTOR – Ku-0063794 – aumento da fosforilação de eIF2α demonstrar ainda mais o envolvimento da actividade da mTOR na modulação eIF2α fosforilação. Estas experiências sugerem que a fosforilação da eIF2α excessiva diminui a sobrevivência de células cancerosas; tornando eIF2α um alvo digno para o desenvolvimento de drogas, com o potencial de melhorar os efeitos citotóxicos de estabelecidas as terapias anti-neoplásicas e contornar a resistência à rapalogues e possivelmente a outras drogas que inibem componentes a montante da via mTOR

Citation.: Tuval-Kochen G, Paglin S, L Keshet, Lerenthal Y, Nakar C, Golani T, et al. (2013) eucariótica Fator de Iniciação 2α – um Effector Downstream de mamíferos alvo da rapamicina – Modula Reparo do DNA e cancro da resposta ao tratamento. PLoS ONE 8 (10): e77260. doi: 10.1371 /journal.pone.0077260

editor: Vladislav V. Glinskii, Universidade de Missouri-Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 29 Abril, 2013; Aceito: 30 de agosto de 2013; Publicação: 25 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tuval-Kochen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A pesquisa foi apoiado por uma doação generosa da propriedade de Miss HARAN ESTER de abençoada memória através Keren Izvonot, Israel, Ministério da saúde (SP) e pelo Fundo de Desenvolvimento de Infra-estrutura de Pesquisa médica – Sheba Medical Center (YL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A fosfatidilinositol 3-quinase – proteína quinase B – alvo da rapamicina em mamíferos (PI3K-Akt-mTOR) via regula o crescimento e proliferação celular. A desregulação da via subjaz transformações oncogênicos e sua modulação por meio de tratamentos anti-neoplásicos afeta seu resultado. inibidores da mTOR – rapamicina, e seus derivados – diminuir a proliferação de células de cancro e têm sido testados como agentes anti-cancro em ensaios clínicos [1-3]. A rapamicina foi utilizada para o revestimento de stents para prevenir a restenose angiográfica-[4], e ganhou a aprovação da FDA como um imunossupressor. Seus derivados – temsirolimous everolimous e ter sido aprovado para o tratamento de vários tipos de cancro [5,6]

Rapalogues se ligarem ao seu receptor intracelular de proteínas de ligação FK506 12 (FKBP12), formando um complexo que inibe complexo mTOR 1. (mTORC1) ligando domínio de ligação de rapamicina FKBP12 de mTOR [7]. Além disso, a incubação prolongada com rapalogues pode inibir a formação de complexo mTOR 2 (mTORC2) [8]. No entanto, o efeito de sobre rapalogues mTORC1 e é mTORC2 tipo específico de célula e pode depender da abundância relativa de moléculas que participam na composição de complexos macromoleculares de mTORC [8,9]. Consequentemente, o resultado inibidor de rapalogues no crescimento do tumor não é universal [7].

Por isso, em células cancerosas sensíveis à rapamicina, rapamicina que delimitam efectores a jusante que modulam o crescimento tumoral e a resposta ao tratamento anti-neoplásico é susceptível de conduzir a descoberta de novos compostos que inibem o crescimento do tumor e /ou aumentam a sua sensibilidade a terapias estabelecidas. Tais moléculas são esperados para contornar a resistência de células de cancro a drogas que têm como alvo os componentes a montante da via PI3K-Akt-mTOR, tendo apenas um efeito parcial nas suas actividades globais.

No presente estudo, relatamos que a inibição do mTOR leva ao aumento da fosforilação de eIF2α – uma subunidade do eIF2. Até à data, os relatórios contrastantes foram publicados sobre o envolvimento de mTOR em eIF2α fosforilação [10-16]. No entanto, o presente estudo demonstra que no cancro da mama MCF-7 de células dependentes de estrogénio sensível à rapamicina tão bem como em células triplos negativos rapamicina-insensível MDA-MB-231, a inibição da mTOR por rapamicina e pelo inibidor catalítico específico (Ku-0063794 ), respectivamente, conduz a um aumento da fosforilação de eIF2α. Quando ligado a GTP, eIF2 recrutas Met · tRNA

TEM ao ribossomo que então verifica o mRNA tampado. Após o reconhecimento do codão de iniciação e hidrólise de GTP, o eIF2 inactivas · PIB é libertado e reciclados para um eIF2 activa · GTP complexo através da interacção com o factor de troca do nucleótido guanina eIF2B [17]. Sob condições fisiológicas normais, eIF2α facilita a interacção de eIF2 com eIF2B [18]. No entanto, a fosforilação de eIF2α na sua Sor

51 gira eIF2 a partir de um substrato de eIF2B em seu inibidor competitivo, que conduz a uma redução no nível de eIF2 · GTP · Met · ARNt

MET complexo e à atenuação da global de proteínas tradução. Importante, porque o nível celular de eIF2 é em excesso de eIF2B, um ligeiro aumento da fosforilação eIF2α pode sequestrar uma grande fracção de eIF2B [17]. Em células de mamíferos eIF2α é fosforilada por quatro cinases diferentes que respondem diferentemente a vários sinais de stress [17], e a sua desfosforilação é conduzida pela subunidade catalítica de fosfatase fosfo-proteína 1 (PP1c) em complexo com subunidades reguladoras específicas e.g. o repressor constitutivo da eIF2α fosforilação (CREP) ou a parada do crescimento induzido pelo estresse e DNA danos inducible protein (GADD34) [19]. Salubrinal – um inibidor da eIF2α desfosforilação – interfere com a associação de �PP1c e suas subunidades reguladoras, levando assim a um aumento eIF2α fosforilação. A sua aplicação a vários sistemas celulares in vitro tem sido empregue para elucidar a relevância fisiológica de aumento da fosforilação eIF2α para a sobrevivência celular [20,21].

O resultado molecular e relevância fisiológica do aumento da fosforilação eIF2α tem sido extensivamente estudada durante retículo endoplasmático (ER), onde a sobrecarga é geralmente pensado para exercer um papel protector. Em resposta ao aumento da carga ER PKR-like localizada-ER eIF2α quinase (PERK) é ativado e um aumento transitório eIF2α fosforilação segue [22]. Isto leva a uma atenuação global tradução de proteínas que podem ir de mãos dadas com o aumento da tradução de mRNAs específicos que possuem tanto um elemento-ribossoma-entry-site interno [23] ou grelhas de leitura abertas curtas em seu “líder 5 [17]. A atenuação mundial de tradução da proteína diminui carga de ER, enquanto proteínas específicas cuja tradução é aumento da transcrição Activate de genes que modulam a resposta celular ao estresse. O alívio da eIF2α fosforilação é necessária de modo a permitir a tradução da nova transcriptoma [24]

Exposição de fibroblastos de rato embrionários (MEF) para agentes anti-cancro, tais como inibidores de – doxorrubicina ou histona desacetilase – também levaram para o aumento da fosforilação de eIF2α, embora um sustentada em vez de um transiente [25,26]. Nestes estudos MEF modificados transportando as mutações /um não-fosforilável eIF2α A mostraram maior sensibilidade aos fármacos do que os seus homólogos de S /S de tipo selvagem que conduzem à conclusão de que o aumento induzido por drogas em eIF2α fosforilação é protectora contra a morte celular. No entanto, enquanto a fosforilação fortemente regulada de eIF2α pode ser protetora, uma fosforilação eIF2α excessiva e sustentada pode ser tão prejudicial quanto a revogação total. Com efeito, constatou-se que, enquanto a fosforilação firmemente regulado de eIF2α é necessária para o desenvolvimento embrionário adequado, uma deficiência em eIF2α fosforilados sinalização, devido a homozigotia para eIF2α A /A, bem como a fosforilação excessivo resultante de um nocaute do CREP, uma mutação que conduz à inibição da desfosforilação eIF2α, estão associadas com anemia fetal e atraso de crescimento [22]. Além disso, mutação em PERK e inibição da eIF2α resultado da fosforilação em células beta morte e síndrome de Wolcott-Rallison, e fosforilação eIF2α semelhante excessiva em células TSC mutantes após a exposição a estressor ER inibe a expressão de transcriptoma induzida pelo estresse, levando à morte celular [24] .

Os nossos estudos implicam sustentada e fosforilação excessiva eIF2α na inibição da reparação do ADN, desenvolvimento de senescência e a diminuição da expressão de um marcador de superfície associada com a capacidade de auto-renovação, proporcionando assim uma base racional para a associação com o aumento da sensibilidade à anti- tratamentos neoplásicas, tais como inibidores da histona-desacetilase e radiação ionizante (HDACi). Os nossos resultados sugerem que o desenvolvimento de fármacos que aumentam a fosforilação eIF2α pode proporcionar meios adicionais para melhorar a sensibilidade a terapias estabelecidas anti-neoplásicos e /ou contornar a resistência a drogas que têm como alvo os componentes a montante da via PI3K-Akt-mTOR.

Materiais e Métodos

cultura celular

MCF-7 e MDA-MB-231 linhas de células de cancro da mama, da American Type Culture Collection (Manassas, VA), foram colocadas em placas a uma densidade de 4 · 10

3 por cm

2 e mantido como descrito anteriormente [27]. As células foram irradiadas 48 horas após a cultura em placas com uma Cs

137 irradiador (Gammacell 1000 Elite /3000 Elan) a uma taxa de dose de 475 cGy /minuto ou no irradiador de raios-X (Polaris SC-500 série II) a uma dose taxa de 100 cGy /minuto. A rapamicina, Vorinostat (laboratórios LC, Boston, MA), a Ku-0063794 (Selleck, Houston, TX) e salubrinal (Calbiochem-Merck4Biosciences, Alemanha) foram adicionados às culturas a partir de soluções de reserva em dimetilsulfóxido (DMSO). As culturas de controlo receberam quantidades iguais do veículo. concentração de DMSO no meio não excedeu 0,08%. Os fármacos foram adicionados à cultura, imediatamente após a radiação.

sobrevivência Colony ensaio

chapeamento para o ensaio colônia sobrevivência, contagem de colônias, e cálculo de frações remanescentes foi realizada em triplicado como descrito anteriormente [28]. Salvo indicação em contrário, as colónias foram fixadas, coradas e contadas 8-10 dias após o plaqueamento, quando 90-95% das colónias no controle possuem mais de 50 células. O efeito aditivo teórico, de tratamentos anti-neoplásicas combinados, em células-sobrevivência foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: 100 x SFa x SFB (SFA = fracção sobrevivente de células tratadas com o agente de ‘a’; SFB = fracção sobrevivente de células tratadas com o agente de ‘b’). Um determinado experimentalmente fracção sobrevivente que é menor do que a calculada indica que os dois agentes tem um aumentou em vez de um efeito inibitório aditivo sobre a sobrevivência celular. O pressuposto subjacente desta equação é que os agentes atuam de forma independente um do outro dentro da mesma população. A fracção celular em percentagem que não sobrevivem ao tratamento (SE)% é igual a: [1-fracção sobrevivente] x100 e o efeito inibidor aditivo teórico de agentes a e b no tamanho da fracção celular morto em por cento – (IFAB)% é igual a [29]: 100 x [1- (1-IA /100) x (1-Ib /100)] = 100 x (1-x SFa SFB).

análise de Western blot

Preparação de lisados ​​e análise das mudanças induzidas pelo tratamento em nível de proteína e fosforilação celulares foi feito como descrito anteriormente [27], com pequena modificação. O teor de proteína foi determinada com um reagente de ácido bicinconínico (Bio-Rad, Hercules, CA), e o carregamento igual foi verificado por medição da absorvância a 520 nm de Ponceau S (Sigma, St-Louis, MO), extraiu-se com PBS a partir de tiras individuais de uma corrida dupla. As manchas foram expostas a filmes de raios-x para quimioluminescência após o tratamento com reagente ECL West Pico (Thermo Scientific Rockford, IL). Os valores para a densidade de luz integrada de autorradiogramas foram obtidos com software Image J NIH e foram utilizados para a determinação das alterações induzidas pelo tratamento nos níveis de proteína e na proporção de eIF2α fosforilado (p-eIF2α) ao nível total da proteína. Coelhos anticorpos que reconhecem quer p-eIF2α ou ambos os eIF2α fosforilados e não-fosforilados foram de Cell Signaling Technologies (Boston, MA) e anticorpos para BRCA1 (D9 clone) e CD2 foram de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX)

Caracterização de expressão epitelial antigénio específico (SEC) por análise de FACS

Controlo e células tratadas salubrinal foram descoladas com solução de dissociação de células não enzimática (Sigma, Israel), incubadas com soro humano e de FcR reagente de bloqueio e, em seguida, com isotiocianato fluorescente (FITC) -anti-SEC ou com controlo de isotipo (Miltenyi Biotec, Alemanha). 7-aminoactinomycin D (7AAD, eBiosciences, San Diego, CA) serviu como corante de viabilidade. Detecção de coloração de células foi realizada pelo FACSCalibur utilizando o software Quest (BD Biosciences, San Jose, CA) como descrito por Keshet et ai. para a coloração de superfície MDR1 [30].

Coloração de ácido β-Galacotosidase

kit de coloração celular de Cell Signaling Technologies foi utilizado para a coloração celular e fotomicrografias de células coradas foram obtidos com Nikon Eclipse TS100 microscópio invertido e câmera Nikon DS.

Os ensaios para a reparação do ADN

end não-homóloga juntar (NHEJ) reparo foi testada em células HeLa e homóloga de reparação de recombinação (FCR) foi testada em células U2OS estavelmente transfectadas com pEJSSA e PDR-GFP respectivamente [31,32]. O HeLa [33,34] células foram uma oferta do Dr. Dahm-Daphi, Universidade de Hamburgo e as U2OS foram uma oferta do Dr. Scully, Harvard Medical School [32,34]. O ensaio foi realizado essencialmente como descrito por Moyal et ai. e Seluanov et ai. [34,35] excepto que as células foram tratadas com 4,5 uM salubrinal 6 horas antes da transfecção com plasmídeos que expressam I-Scel (ou vector vazio de controlo). Para a medição de NHEJ, as células foram co-transfectadas com I-Scel que expressa vector e pDsRed2-N1, na proporção de 10: 1. A transfecção foi realizada com o reagente de transfecção de ADN LT1 (Mirus Bio LLC.) De acordo com as instruções do fabricante. Paralelamente, tipo GFP selvagem e as células que expressam DsRed, bem como controles negativos foram usados ​​para calibração FACS (ajuste da tensão e compensação de cor). atividade NHEJ foi seguido no momento observou pós-transfecção com I-SCEI, monitorando a expressão da GFP em células que expressam DsRed. A detecção foi realizada por FACSCalibur em 50.000 acontecimentos por amostra. Para a determinação da actividade de RH a fracção de I-Scel células que expressam GFP dependente foi dividida pela eficiência de transfecção nestas células, como descrito por Moyal et ai. [34]. Sob as nossas condições experimentais, o efeito de salubrinal na intensidade média de fluorescência em células expressando GFP foi sempre inferior a 10%, indicando que o efeito notável de salubrinal sobre a reparação do ADN não resulta da inibição da tradução. Além disso, como mostrado na Tabela S1 no ficheiro S1, salubrinal não alterar a distribuição do ciclo celular de células U2OS que indicam que o efeito inibitório de salubrinal na actividade HRR após transfecção com o I-Scel resulta da inibição directa de reparação e não de um efeito sobre a fracção de células em fase S.

A transfecção de células com plasmídeos que codificam para eIF2α variantes

heIF2α S51A e heIF2α S51D em pcDNA3.CD2 [36,37] eram um presente de laboratório do Dr. Ron New York, NY. transfecção transiente foi realizada com JetPei (Polyplus, Nova Iorque, NY) de acordo com as instruções do fabricante. Quando a transfecção foi efectuada em pratos de cultura de 10 cm – 10 ug plasmídeos foram incubadas em 6 ml de meio de crescimento sem antibióticos durante 24 horas antes da adição de 4 ml de meio e prosseguindo com o protocolo experimental. Quando a transfecção foi efectuada em pratos de 6 poços, os valores observados de plasmídeos foram incubadas em 2 ml de meio de crescimento sem antibióticos durante 24 horas antes da adição de 0,5 ml de meio e prosseguindo com o protocolo experimental. A expressão da proteína repórter foi monitorizada em transferências de Western com anti-CD2.

A análise estatística

Student independente

t

teste ou uma amostra

t

teste após transformação logarítmica foi empregado para análise estatística.

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Foi previamente demonstrado que as células MCF-7 de cancro da mama dependentes de estrogénio são altamente sensíveis à rapamicina (IC

50 – ~ 10 nM). . Em contraste, o triplo negativo MDA-MB-231 não são sensíveis à droga (IC

50 -5900 nM) [38], devido ao nível relativamente elevado de ácido fosfatídico que compete com rapalogues para a ligação ao domínio FRB [9] . Os nossos resultados também mostram que, enquanto em células MCF-7 a rapamicina induz a morte clonogénica com um IC

50 de ~ 50 nM, nas concentrações de células MDA-MB-231 até 2 uM não afectam significativamente a sobrevivência das células (Tabela S2 S1 arquivo).

eIF2α é um alvo a jusante de rapamicina e irradiação

A concentrações nM rapamicina levou a um aumento da fosforilação de eIF2α que foi muito mais pronunciada em células MCF-7 do que em MDA-MB-231 (Figura 1 ab). A radiação ionizante, por outro lado, o aumento da fosforilação eIF2α em ambos MCF-7 e MDA-MB-231 (Figura 2 A-C) células. Em MDA-MB-231 células de aumento do nível de p-eIF2α bem como uma maior proporção de p-eIF2α para eIF2α foi mantida ao longo das 48 horas após a irradiação. Em algumas experiências uma redução no nível total de eIF2α em células irradiadas foi notado, no entanto esta diferença não foi estatisticamente significativa. Nas células MCF-7 do nível de p-eIF2α, bem como a do nível total de eIF2α diminuiu grandemente por 48 horas após a irradiação, mas a proporção elevada de p-eIF2α para eIF2α conseguida por 24 horas pós-irradiação foi mantido.

a. As células foram incubadas durante 24 horas com 50 nM de rapamicina, colhidas e processadas para determinação de alterações na fosforilação eIF2α b. Média ± SEM mudança vezes relativamente ao controlo de eIF2α (e), P-eIF2α (P) e a razão de p-eIF2α /eIF2α (P /E), em células tratadas com rapamicina. A análise representa 6 determinações separadas para as células MCF-7 e 3 para as células MDA-MB-231. * Indica mudança significativa em relação ao controle –

p Art 0,05.

a. MCF-7 e b. As células MDA-MB-231 foram irradiadas com a dose de radiação indicados e processados ​​para análise de eIF2α fosforilação no pós-irradiação de tempo indicado. c. Média ± SEM de mudança de vezes relativamente ao controlo de eIF2alpha (e), P-eIF2α (P) e a razão de p-eIF2α /eIF2α (P /L) irradiado na MCF-7 e células MDA-MB-231. Análise para MCF-7 em 24 horas pós-irradiação com 1,5 e 9,5 Gy representa 2 e 3 determinações separadas, respectivamente, e às 48 horas 3 determinações separadas para cada dose. Análise para células MDA-MB-231 em 24 horas representa 3 determinações para cada dose e em 48 horas 5 Determinação de 1,5 Gy e 6 para 9,5 Gy. * Indica mudança significativa em relação ao controle –

p Art 0,05

O aumento da fosforilação de eIF2α é prejudicial à sobrevivência celular

Para determinar a relevância do aumento da fosforilação eIF2α à sobrevivência celular que trataram células MDA-MB-231 com salubrinal -. Um inibidor eIF2α de desfosforilação. Salubrinal conduziu a um aumento dependente da dose de eIF2α fosforilação que foi associado com o aumento da morte clonogénica (Figura 3 a, b; Tabela 1). Combinando o tratamento de salubrinal – a uma concentração que não afecta a sobrevivência celular (4,5 ^ M) – e a radiação levou ao aumento da fosforilação de eIF2α que foi associada com um aumento de morte clonogénica (Figura 3 c, d; Tabela 2; Tabela S3 em S1 Ficheiro) . Interessantemente, em células que receberam o tratamento combinado de 4,5 uM e 1,5 Gy salubrinal, fosforilação de eIF2α foi semelhante ao obtido em células tratadas com salubrinal sozinho, sugerindo que as células irradiadas são mais susceptíveis a um aumento da fosforilação eIF2α do que as células não irradiadas. maior sensibilidade à radiação também foi observado em células MCF-7 tratadas salubrinal (Tabela S4 em S1 Arquivo).

a. As células foram processadas para análise de eIF2α fosforilação de 48 horas pós-adição de salubrinal (Sal). b. Média ± SEM mudança vezes relativamente ao controlo de eIF2α (e), P-eIF2α (P) e a razão de p-eIF2α /eIF2α (P /L) em (SAL) salubrinal células tratadas. O experimento foi reproduzido 3 vezes para 4,5 mM e duas vezes para 16? M. * Indica mudança significativa relativamente ao controlo – P . 0,05

c. As células foram irradiadas com a dose de radiação observado antes da adição de 4,5 uM Salubrinal (Sal). d. Alteração média vezes em relação ao controle de eIF2α (e), p-eIF2α (p) e a relação p eIF2α /eIF2α (p /e) .A experiência foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes (Os valores para E, P e P /E a partir de ambas as experiências são apresentadas na Tabela S3 no ficheiro S1).

Salubrinal (M)

IF (%)

00 ± 0.64.50 ± 5938 ± 216.5100Table 1. Salubrinal induz dose-dependente morte clonogênica.

MDA-MB-231 foram banhado e processados ​​para ensaio clonogênica. Os números são SE (%) ± SEM de amostras em triplicado. O efeito de morte celular em salubrinal aos 9 e 16,5 uM foi significativa (

P

0,05). CSV Baixar CSV Gy

-Sal IF (%)

+ Sal IF (%)

Aditivo Calculado

00 ± 10 ± 313 ± 0,38 ± 2.631.517 ± 0,630 ± 1.6172.548 ± 166 ± 2. 2.648Table Salubrinal aumenta a morte de células clonogénicas, em células irradiadas.

células MDA-MB-231 foram plaqueadas para o ensaio de sobrevivência clonogénica. Salubrinal (Sal) (4,5 uM) foi adicionado às células imediatamente após irradiação. Os números são médias SE (%) ± SEM de amostras em triplicado de uma experiência representativa que foi reproduzido duas vezes com resultados semelhantes. efeito aditivo teórico de salubrinal e radiação sobre o tamanho da fracção celular morto é apresentado sob «aditivo calculado». O efeito de salubrinal no aumento da morte clonogénica dentro de 1,5 Gy e 2,5 Gy de radiação grupos foi significativa (

P

0,05). CSV Transferir CSV

Semelhante ao efeito de salubrinal transfecção, transiente com a variante phosphomimetic eIF2α S51D diminuição – de uma maneira plasmídeo-dependente da dose – clonogénico de sobrevivência em relação ao observado em células transfectadas com a variante não-S51A fosforilável. Em concentrações elevadas de plasmídeos (Figura 4-A) a sobrevivência de células que expressam a variante phosphomimetic foi menor do que a de células que expressam a variante não fosforilável. No entanto, a uma concentração inferior plasmídeo eIF2α S51D não afecta a sobrevivência em relação ao eIF2α S51A (figura 4 b), mas conduziu a um aumento da morte clonogénica em células irradiadas (Figura 4 c, Quadro 3). Nas nossas condições experimentais aumento induzido por radiação na fosforilação de eIF2α endógena foi semelhante em eIF2α S51A e eIF2α S51D células que expressam (Figura S1), indicando que semelhante ao salubrinal o efeito prejudicial causado pela expressão dos resultados eIF2α S51D de um aumento do nível celular de inibido eIF2α ie eIF2α S51D e proteína endógena fosforilada.

a. As células transfectadas com 2? G /2 mL eIF2α S51A (SA) ou com eIF2α S51D (SD) foram processados ​​para análise de 17 dias pós-chapeamento. A esta concentração SD diminuiu a sobrevivência clonogênica. b, c. As células transfectadas com 1.5μg /2ml SA ou com SD. As células em b não foram irradiadas enquanto que as células em C foram irradiados com 1,5 Gy 24 horas pós-transfecção. As células em b e c foram processadas para análise de 10 dias pós-irradiação. A esta concentração, SD, por si só não afecta a sobrevivência clonogénica mas fez aumentar a sensibilidade à radiação. O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes.

SA IF (%)

SA + 1,5 Gy IF (%)

SD IF (%)

SD + 1,5 Gy IF (%)

0 ± 348 ± 0,50 ± 462 ± 1.5Table 3. O phosphomimetic eIF2α variante aumenta a morte clonogénica em células irradiadas.

As células foram transfectadas com 1.5μg /2ml eIF2α S51A ou eIF2α S51D. Irradiação com 1,5 Gy ocorreu 24 horas depois. As colónias foram processados ​​para análise de 10 dias pós-irradiação. Os números são os meios se (%) a partir de amostras em triplicado ± SEM. O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes. As diferenças entre os grupos controle e irradiados, bem como entre os dois grupos de variantes irradiados foram significativas

p Art 0,05. SA – non-fosforilável eIF2α, S51A, SD – phosphomimetic eIF2α S51D. CSV Baixar CSV

Salubrinal afeta a expressão da ESA superfície

Tem sido relatado que as células-tronco do câncer de mama tumorigênicos são enriquecidos com uma sub-população de células que expressam CD

44 + /CD

24 – /baixo /SEC

+ na sua superfície [39], e que uma sub-população que expressa uma combinação similar de marcadores de superfície celular foi identificada em linhas de células de cancro da mama (por exemplo, MDA-MB-231), e tem sido demonstrado que possuem elevada capacidade de auto-renovação e iniciação do tumor [40]. Uma vez que mais de 90% das células MDA-MB-231 são CD

44 + /CD

24- /baixa, a triagem para a expressão da superfície celular SEC nestas células pode servir como um indicador para alterações no tamanho da fracção celular com capacidade de auto renovação [40]. Como observado na Figura 5, o tratamento das células com expressão diminuída de salubrinal ESA na superfície das células, o que sugere que o efeito deletério da fosforilação eIF2α excessivo pode diminuir a sua capacidade de auto-renovação.

As células foram incubadas com 24 salubrinal mM durante 96 horas antes da colheita, coloração celular com FITC-anti-ESA ou com controles do mesmo isotipo foi detectado com FACSCalibur. O experimento foi reproduzido duas vezes com resultados semelhantes. 7AAD – corante de viabilidade, FITC -. Anti-ESA

Salubrinal induz senescência em células de câncer de mama

As colónias de células irradiadas e salubrinal tratados contêm alargada e senescentes células que procuram. Contamos estas células em colónias formadas após exposição a 1 Gy, a 4,5 uM salubrinal para a combinação de radiação e salubrinal e em controlos não tratados. Curiosamente, apesar do tratamento combinado de 4,5 uM e 1 salubrinal Gy não conduziu a morte aumentada clonogénicas (Tabela 2) que esteve na origem de reforçada aparecimento de células à procura senescentes (Figura 6). Coloração de ácido β-Galacotosidase mostrou que estas células grandes expressar a enzima indicando que, de facto aumenta salubrinal senescência em células irradiadas (Figura 6).

As células foram colocadas para o ensaio de sobrevivência das colónias. Salubrinal (4,5 uM) ou o veículo foi adicionada imediatamente após a radiação com uma Gy. Ácida actividade β-galactosidase ê reflectido na mancha azul. Os números são média de senescentes procurando células /colónia ± SD em placas em triplicado e diferenças entre os tratamentos combinados e cada um dos únicos tratamentos, bem como entre cada tratamento e controle foram estatisticamente significativas

p Art 0,05. Bar, 100? M.

O aumento da fosforilação eIF2α modula DNA reparação

A radiação levou ao aumento do nível de BRCA1, uma proteína que participa no reparo do DNA seguinte danos da radiação [41]. O aumento em BRCA1 foi anulada por salubrinal e pela expressão transitória da phosphomimetic eIF2α S51D sugerindo que a fosforilação eIF2α excessiva modula a reparação de danos de DNA (Figura 7). Com efeito as experiências com células HeLa e as células U2OS expressando plasmídeos repórter NHEJ e HRR mostraram, respectivamente, que inibiu a reparação de DSB-salubrinal-I induzida por ambos os mecanismos Scel (Figura 8).

Painel superior: Controle e células irradiadas (1,5 Gy) foram tratados com 4,5 mM salubrinal ou o veículo. As células foram colhidas 48 horas após a irradiação e processados ​​para análise de Western blot de alterações no nível de BRCA1.

painéis inferiores: As células transfectadas com 10 ug /ml de o S51A e S51D eIF2α variantes ou com reagentes de transfecção sozinho (SHAM). As células foram irradiadas com 9,5 Gy 24 horas pós-transfecção e processados ​​para análise de BRCA1 24 horas pós-radiação. CD2 foi expresso em células transf ectadas que indicam uma transfecção bem sucedida. Sal – 4,5 mM salubrinal.

a. Medição da actividade de NHEJ foi realizada 24 horas após a transfecção com I-Scel. O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes ou seja, a actividade de reparação de 4% para o controle e 3% para as células tratadas salubrinal. b. Medição da actividade de RH foi realizado 36 horas após a transfecção com I-Scel. O experimento foi reproduzida uma vez com resultados semelhantes i.e. actividade de 2,35% para o controlo e actividade de 1,6% para células tratadas salubrinal às 24 horas pós-transfecção com I-Scel. Sal -. 4,5 mM salubrinal

Aumento e fosforilação sustentado afeta resposta das células de câncer de mama para Vorinostat

Semelhante à radiação, o HDACi – O vorinostat também leva ao aumento da eIF2α fosforilação. Este aumento foi considerado como um meio de protecção contra o dano celular [26]. No entanto, combinando concentrações baixas de salubrinal e Vorinostat, em concentrações que individualmente dificilmente afectam eIF2α fosforilação, resultou no aumento da fosforilação da eIF2α, que mais uma vez estava associado com o aumento da morte clonogénica (Figura 9, Tabela 4, Tabela S5 S1 no ficheiro).

a. As células foram colhidas 48 horas após a aplicação do veículo (D), 4,5 uM salubrinal (S), 0,75 ^ M Vorinostat (V) ou ambos (V + D) e processados ​​para análise de Western blot de eIF2α fosforilação. b. A alteração média vezes relativamente ao controlo de eIF2α (e), peIF2α (P) e a razão de peIF2α /eIF2α (P /E). b.