Sumário
MUC1 está associado com a transformação celular e a tumorigenicidade e é considerado como um antigénio associado a um tumor importante (AT) para terapia do cancro. Nós relatado anteriormente que o anticorpo monoclonal anti-MUC1 C595 (mAb C595) e docetaxel (DTX) aumentou a eficácia da DTX sozinho e causou células epiteliais humanas cultivadas do cancro do ovário (EOC) para sofrer apoptose. Para estudar os mecanismos deste apoptose mediada por combinação, foi investigada a eficácia desta terapia de combinação
in vivo
em um modelo de rato EOC intraperitoneal (i.p.). células OVCAR-3 foram implantados intraperitonealmente em ratinhos nus atímicos fêmeas e deixou-se crescer de tumor e ascites. Os ratinhos foram então tratados com o MAb único C595, DTX, teste de combinação (mAb C595 e DTX), controlo de combinação (IgG de MAb negativo
3 e DTX) ou controlo de veículo i.p. durante 3 semanas. Os ratinhos tratados foram mortos 4 semanas após o tratamento. volume de ascite, o peso do tumor, os níveis de CA125 a partir de ascites e a sobrevivência dos animais foram avaliados. A expressão da proteína MUC1, CD31, Ki-67, de TUNEL e proteínas apoptóticas em xenoenxertos de tumor foi avaliada por imuno-histoquímica. MAb C595 i.p. inibido sozinho o crescimento do tumor e produção de ascite de um modo dependente da dose, mas não, obviamente, impedir o desenvolvimento do tumor. No entanto, o teste combinada reduziu significativamente o volume, o crescimento ascite tumor e das metástases, os níveis de CA125 em ascite e melhorou a sobrevivência de ratos tratados em comparação com os ratos tratados com agente único, controle de combinação ou ratos tratados com veículo de controlo (
P Art 0,05). Os dados estava em uma boa concordância com que a partir de células cultivadas
in vitro
. Os mecanismos por detrás dos efeitos observados poderia ser através de segmentação antigénios MUC1, a inibição da angiogénese tumoral, e a indução de apoptose. Nossos resultados sugerem que esta abordagem combinação pode efetivamente reduzir a carga tumoral e ascite, prolongar a sobrevivência dos animais através da indução de apoptose tumor e necrose, e pode fornecer uma terapia potencial para EOC metastático avançado
Citation:. Wang L, Chen H, Pourgholami MH, Beretov J, Hao J, Chao H, et al. (2011) Anti-MUC1 Monoclonal Antibody (C595) e Docetaxel reduzir significativamente a carga tumoral e ascite, e prolongar a sobrevivência em um
in vivo
Modelo cancro do ovário. PLoS ONE 6 (9): e24405. doi: 10.1371 /journal.pone.0024405
editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de maio de 2011; Aceito: 09 de agosto de 2011; Publicação: 09 de setembro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado por um Collaborative Grant Internacional do Conselho de Henan Saúde, China (LW, HMC e HTC), um Instituto do Câncer NSW Career Development Fellowship (YL) e St George Hospital Trust Fund Ovarian Cancer Research (YL e JK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
epitelial do ovário (EOC) é a neoplasia maligna ginecológica mais letal ea quinta causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer em mulheres nos Estados Unidos, resultando em um número estimado de 21,880 novos casos e 13.850 mortes em 2009 [1 ]. Os doentes com doença avançada têm uma taxa de resposta de mais de 80% após a cirurgia e quimioterapia adjuvante com platina-taxano, com um intervalo livre de progressão mediano de 18 meses [2]. Infelizmente, o câncer se repitam na maioria desses pacientes, ea taxa de sobrevida em 5 anos global para pacientes com doença em estágio avançado é de apenas 23-30% [3]. quimioterapia do cancro convencional muitas vezes resulta em efeitos secundários graves relacionados com os modos não-específicos de acção. Estudos que avaliaram vários agentes citotóxicos em EOC recorrente ter encontrado taxas de resposta de 10-28%, com um aumento progressivo de acompanhamento do número de tumores resistentes aos medicamentos [4]. Assim, novas estratégias terapêuticas são urgentemente necessárias para melhorar o resultado para esta doença mortal. Uma abordagem promissora, que pode melhorar o prognóstico do paciente é a utilização de anticorpos monoclonais (MAbs) combinados com a quimioterapia tradicional.
MUC1 é uma grande glicoproteína transmembranar peso molecular que é sobre-expressa em muitos carcinomas [5], [6], incluindo EOC [7] – [9], e medeia eventos de transdução de sinal que estimulam a motilidade, invasão e metástases de células cancerosas [10]. MUC-1 é sobre-expresso em 90% da superfície das células EOC [7], [8]. O aumento dos níveis de expressão de MUC-1 por células cancerosas podem mascarar os domínios extra-celulares de vigilância imunológica, que confere uma vantagem de sobrevivência sobre as células malignas e desempenhando um papel importante na capacidade dos tumores para invadir e metástase [11]. Assim, MUC1 associada ao tumor é um alvo molecular promissor para uma nova terapia para pacientes EOC.
C595 é uma IgG
3, murino MAb levantada contra o núcleo de proteína MUC1 (Mucina1 epiteliais urinárias) humanos [ ,,,0],12]. mapeamento de epítopo C595 mostrou que reconhece um motivo tetrapéptido (PAPR) dentro do núcleo proteico de mucina MUC1 que contém um grande domínio de múltiplos de uma sequência altamente conservada de repetição de 20-amino-ácido (PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA) [12], [13]. MAb C595 foi marcada com radioisótopo emissor de γ (
111In) para testar a sua capacidade para a localização e identificação de câncer em 19 pacientes com suspeita clínica de malignidade ovariana, e alcançou precisões finais de 79% e 64% em comparação com ressonância magnética imagiologia e ultra-som em relação à histologia do tumor final [14]. Após a marcação com α-emissor (
213Bi),
213Bi-C595 α-conjugado (AC) tem sido usado para alvejar próstata único [15], [16] e células ovarianas pancreáticas [17]
em vitro
e regridem xenoenxertos subcutâneos pancreáticas
in vivo
[18]. Estes resultados suportam a hipótese de que o AcM C595 é útil por si só ou em combinação com outras terapias para melhorar o tratamento do EOC avançada.
Embora o paclitaxel é usado em terapia de primeira linha, o seu análogo docetaxel (DTX) tem vantagens, incluindo mais lento efluxo celular e maior solubilidade, permitindo concentrações intracelulares superiores [19]. Em ensaios clínicos, o DTX resultou em taxas de resposta equivalentes e tem demonstrado actividade contra o carcinoma de paclitaxel-refractário [20], [21]. DTX demonstrou actividade significativa em ambos os estudos pré-clínicos e clínicos para o tratamento de numerosas doenças malignas sólidas incluindo EOC [22] – [25]. É plausível que DTX pode tornar-se parte da terapia de primeira linha para EOC. DTX combinado com um composto de platina (tal como carboplatina) tornou-se a quimioterapia sistémica de escolha para EOC primário, com elevada eficácia. No entanto, a toxicidade relacionada com a dose e eventual desenvolvimento de resistência são questões importantes que requerem atenção em um ambiente oncologia ginecológica. Em última análise, a maioria destes pacientes morrerão da doença metastática. Mantendo baixos níveis de droga na circulação sistêmica através da entrega localizada pode, consequentemente, diminuir os efeitos secundários tóxicos, e aumentar as concentrações de droga locais no peritônio, onde tumores ovarianos e ascite residem. Isto pode ser conseguido através de injecção i.p. administração. O National Cancer Institute recomendou que i.p. quimioterapia ser considerado para o tratamento do cancro avançado do ovário [26]. A terapia combinada especificamente empregar estratégias tais como um agente quimioterapêutico além de um anticorpo através i.p. a administração pode reduzir eficazmente a toxicidade limitante da dose e melhorar a eficácia do tratamento
Num estudo recente, demonstrou-se que o MAb C595 sozinho pode matar células EOC de uma forma dependente da dose.; este assassinato também foi dependente de níveis de expressão de MUC1. Baixas doses de mAb C595 combinado com DTX aumento da sensibilidade EOC ao medicamento de quimioterapia e reduziu a dose necessária [27]. Neste estudo, a hipótese de que este tratamento combinado pode efetivamente trabalhar em um
in vivo
modelo animal EOC. Descobrimos que MAb C595 poderia inibir i.p. o crescimento do tumor e a produção de ascites no modelo de xenoenxerto de OVCAR-3 do rato e melhorar a eficácia terapêutica de DTX de um modo dependente da concentração, e que, após administração i.p. injecção, este tratamento de combinação (de teste) (mAb C595 e DTX) poderia reduzir significativamente a carga do tumor e ascites e, por conseguinte, prolongar a sobrevivência dos animais tratados. Nossos resultados sugerem que esta nova combinação tem a promessa como uma terapia potencial para o tratamento de EOC metastático avançado.
Materiais e Métodos
Droga
DTX foi adquirido de Sigma-Aldrich , Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Austrália. A droga foi diluída em primeiro [hydroperoxymethyl celulose (HPMC), preparado como 0,5% em PBS] e armazenadas a 4 ° C para utilização.
Anticorpos
AcM C595 foi gentilmente fornecida pela Universidade de Nottingham ( Nottingham, Reino Unido). IgG de ratinho anti-humano de controlo
3 isotipo de MAb foi comprado de Zymed Laboratories Inc. (South San Francisco, CA, EUA). MAbs de coelho anti-humano Ki-67, caspase-3 (activa), e PARP-1 (p85 clivada) foram fornecidos por Epitomics (Burlingame, CA, EUA). Rato anti-ratinho CD31 MAb foi adquirido da BD Pharmingen (Bedford, MA, EUA). Suína anti-cabra, -mouse, -rabbit IgG /biotinilado, IgG de coelho anti-rato /biotinilado, estreptavidina /peroxidase de rábano (HRP) e IgG de ratinho
um MAb de controlo negativo foram adquiridos da Dakopatts (Glostrup, Dinamarca).
linha celular e modelo animal
Para todos os experimentos, foram utilizados atímicos BALB /c nu camundongos nu feminino 6~8 semanas de idade /nu (Recursos animais Centre, Perth, Austrália Ocidental). Os ratos foram alojados e mantidos em armários de fluxo laminar sob condições específicas isentos de agentes patogénicos em instalações aprovadas pela Universidade de Nova Gales do Sul (UNSW) Animal Care e do Comitê de Ética (ACEC). Este estudo foi aprovado pelo ACEC, UNSW (ID: 08 /110A). Os animais foram mantidos, pelo menos, uma semana antes do procedimento experimental.
A linha celular OVCAR-3 EOC primário foi obtido a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA), e a sub-linha de OVCAR-3 foi seleccionado e estabelecido com êxito em um ip modelo de xenoenxerto utilizando ratinhos nus no nosso laboratório [28]. Esta seleção pode aumentar a tumorigenicidade das células OVCAR-3
in vivo
. células Resumidamente, OVCAR-3 viável (5 × 10
6/500 ul em DPBS) foram injectados i.p. utilizando uma seringa de 1 mL com uma agulha de calibre 26 e deixada a crescer. a progressão do tumor foi documentada uma vez por semana durante 10 semanas por medidas de circunferência abdominal para aumento abdominal usando uma régua macia. No momento do sacrifício, os tumores foram removidos de ponderação e de prosseguir para o teste histológico
Protocolos de tratamento
estudos de toxicidade em ratinhos nus sem tumores:. Os estudos de toxicidade foram realizados para determinar a dose de tolerância máxima (MTD) em camundongos para single MAb C595, rato IgG
3 MAb controle negativo, DTX, teste de combinação (MAB C595 e DTX) e controle de combinação (negativo mAb IgG
3 e DTX). A relação dose-tolerância foi examinada em ratinhos nus (sem tumores) para uma única injecção i.p. administração de mAb C595, DTX e tratamento combinado (teste) em comparação com o tratamento de controle de combinação. Grupos de cinco ratinhos receberam uma concentração total injectada de 1, 5, 10, 15, 20 mg /kg de mAb C595, ou 3, 5, 7, 10, 15 mg /kg de DTX como também combinado AcM C595 (1 /3 de DMT, isto é, 5 mg /kg) ou 5 mg /kg de IgG de MAb
3 com 3, 5, 7, 10 mg /kg de DTX durante 3 semanas. As doses seleccionadas foram de mAbs com base na MTD de única de Mab C595 e DTX. mouse pesos foram comparados com aqueles no dia 0 (primeiro dia de administração do tratamento) para determinar a mudança de peso percentual. A toxicidade limitante da dose foi definida como pontos finais: perda de 15% do peso corporal ou comportamento afligido (isto é, perda de apetite e actividade, curvado postura). O MTD foi definida como a dose mais elevada a que um terço da coorte atingiu pontos finais toxicidade limitante da dose [29]. Após 10 semanas, os ratinhos saudáveis foram sujeitos a eutanásia. As seguintes experiências foram baseadas na DMT a partir dos estudos de toxicidade
Os estudos de eficácia em OVCAR-3: EOC modelo animal. Após o desenvolvimento da ascite, a cavidade peritoneal foi lavada com 2 mL de solução salina normal estéril. O conteúdo peritoneal foram misturados, gerindo com cuidado e, em seguida, completamente aspirado [28]. Os ratinhos foram então distribuídos aleatoriamente em qualquer grupo de tratamento mAb C595 ou DTX sozinho único ou o teste de combinação (mAb C595 e DTX) e controlo de combinação (mAb IgG
3 e DTX) grupo (n = 10 por grupo). diferentes tratamentos foram iniciados imediatamente após a aspiração do líquido de ascite.
a). Para o tratamento única mAb C595, dose baixa (LD) (5 mg /kg) ou uma dose elevada (HD) (15 mg /kg), o MAb suspenso em 1 ml de solução salina, e o mesmo volume de solução salina com 15 mg /kg de rato MAb IgG
3 (controle) foram administrados uma vez /semana durante 3 semanas.
b). Para o tratamento DTX único, LD (5 mg /kg) ou HD (10 mg /kg) DTX suspenso em 1 mL de HPMC (preparada tal como 0,5% em PBS) como veículo e o mesmo volume de HPMC como um controlo.
c). Para o teste de combinação (mAb C595 e DTX) e grupos de controlo de combinação (mAb IgG
3 e DTX), foi usado o seguinte. Combinação teste incluiu uma dose única de Mab C595 (1/3 dose de DMT, isto é, 5 mg /kg suspensos em 0,5 ml de solução salina) combinada com uma dose única de DTX (10 mg /kg DTX suspenso em 0,5 mL de HPMC). Combinação de controlo incluiu uma dose única de Mab de IgG
3 (5 mg /kg suspensa em 0,5 mL de soro fisiológico) combinada com uma dose única de DTX (10 mg /kg DTX suspenso em 0,5 mL de HPMC). O tratamento combinado (teste e controle) foi administrado sequencialmente a partir de MAb C595 ou IgG MAb
3 a DTX.
I.p.
Todos os tratamentos foram realizados e duração pretendida do tratamento foi de 4 semanas com base nos nossos estudos anteriores. Após os tratamentos, se a circunferência abdominal de um animal atingiu 9,5 cm ou se eles foram deverá tornar-se moribundos dentro de um curto espaço de tempo, os animais foram sacrificados. tempo de sobrevivência de cada animal foi calculada como o número de dias decorridos entre o início do tratamento e a eutanásia. No final dos experimentos, os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical sob anestesia urethrane.
Amostra coleção
Antes da eutanásia, uma amostra de sangue foi coletado por punção cardíaca sob anestesia. No final das experiências, 2 ml de solução salina fisiológica foram injectados i.p. e a cavidade peritoneal foi completamente lavado e aspirado para a detecção de CA125. volumes de ascite na cavidade peritoneal foram registados. As ascites de lavagem do fluido, os tumores dissecados a partir da cavidade peritoneal, e o plasma, foram armazenados a -80 ° C para análise subsequente. volume real acumulado de ascite recolhidos após cada aspiração foi calculado subtraindo-se a 2 mL do volume total coletado.
níveis de CA125 em ascite fluido
níveis de marcadores tumorais (CA125 Ku /l) em células fluido ascite -livre da única MAb C595, DTX e tratamentos combinados (teste e controle) foram determinadas por um ensaio ELISA, seguindo as instruções no St George Hospital Bioquímica Laboratories. A concentração de CA125 nos ascite foi normalizado para o volume real de ascite recolhidos.
Mouse tecidos e histologia
Os tecidos tumorais de MAb, DTX, de segredo ou veículos animais individuais tratados com controle foram quer imediatamente congeladas rapidamente para cortes congelados ou fixados em formol a 10% por 24 horas, embutido no bloco de parafina para a H e coloração e imuno-histoquímica. Cinco micrômetros de cortes congelados de amostras de tumores frescos foram utilizados para CD31 imunocoloração. Para os estudos de toxicidade, órgãos relevantes do rato, tais como rim, fígado, coração e medula óssea foram recolhidas e enviadas para exame patológico fixado em formol (IDEXX Laboratories, Sydney, Austrália).
toxicidade hematológica e exame da função renal
Para determinar a toxicidade hematológica, 200 uL de sangue em cada ratinho foi recolhido em K3 EDTA e tubos MiniCollect gel Z soro (Greiner Bio-One, Alemanha) através da veia safena e Microvette (Sarstedt, Alemanha) antes do tratamento e em 2 e 3 semanas após a injeção única ou a combinação. Foram realizadas análises hematológicas de glóbulos brancos (WBC), linfócitos, células vermelhas do sangue (RBC), e contagem de plaquetas. O sangue foi obtido no final das experiências para a análise bioquímica do soro de funções renais.
A imuno-histoquímica
imunoperoxidase procedimentos padrão foram usados para visualizar MUC1, Ki-67, caspase-3 (activo) e A PARP-1 (p85 clivada). Resumidamente, secções de parafina foram deparaffinised em xileno, seguido por uma série gradual de álcoois (100%, 95%, e 75%) e re-hidratadas em água seguido de Tris-tamponada.
salino (TBS) ( pH 7,5). As lâminas foram em seguida imersos em água fervente 0,01 M de tampão de citrato (pH 6,0) durante 15 min para aumentar a recuperação de antigénios, tratada com peróxido de hidrogénio a 3% e depois incubadas com os AcM primárias: MUC1 (1:500 diluição), Ki-67 (1:50 diluição), caspase-3 (activo) (1:100 diluição) e PARP-1 (p85 clivada) (1:100 diluição), respectivamente, durante a noite (O /N) a 4 ° C. Após a lavagem com TBS, as lâminas foram incubadas com anti-cabra suína, de rato, de coelho biotinilado segundo anticorpo IgG (1:150 diluição) durante 45 min à temperatura ambiente (TA), e em seguida com avidina /peroxidase de rábano solução (HRP) (1 :300 diluição) durante 30 min à TA. As secções foram finalmente desenvolvido com 3,3-diaminobenzidina (DAB) de solução de substrato (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Austrália), então contrastadas com hematoxilina; células positivas apareceu castanho. As lâminas de controlo foram tratados de forma idêntica, e coradas com o mAb de isotipo ou omissão do anticorpo primário como um controlo negativo. Os controlos positivos foram escolhidos dependendo diferentes AcM, tecido de carcinoma do cólon para MUC1, tecido lingual para a linha de células de Ki-67 e tratada DTX-OVCAR-3 para a caspase-3 (activo) e PARP-1 (p85 clivada).
para a coloração de CD31, as secções congeladas foram descongeladas, e fixadas em acetona fria durante 10 min à TA seco ao ar. Depois de uma secagem rápida do ar e a lavagem com TBS, as secções foram incubadas com anti-ratinho de rato CD31 mAb (diluição 1:100) o /n a 4 ° C. Após a lavagem com TBS, as secções foram incubadas com anticorpo de coelho anti-IgG de rato biotinilado (diluição 1:200) durante 45 min, e em seguida com conjugado de estreptavidina /HRP (1:200 diluição) durante mais 30 min. As secções foram desenvolvidas com a solução de DAB (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Austrália) e contrastadas com hematoxilina. lâminas de controlo foram tratados de forma idêntica, e coradas com o MAb isotipo ou omissão do anticorpo primário como um controlo negativo.
TUNEL para células em apoptose
in vivo
a apoptose foi avaliada em tecidos de xenoenxerto de tumor utilizando o método TUNEL com o TdT-fragEL no kit de detecção de apoptose in situ (Calbiochem, San Diego, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A especificidade da reactividade TUNEL foi confirmada com negativa apropriada (TdT omitido da mistura de marcação) e positiva (tratados HL-60 lâminas fornecido pela empresa) controles. As lâminas foram examinadas usando um microscópio óptico Leica (Nussloch, Alemanha).
Avaliação da imunocoloração
intensidade de coloração (0-3) foi avaliada através de microscopia de luz (microscópio Leica, Alemanha), a × 40 objectivo como – (negativo), + (fraca), ++ (moderada) e +++ (forte). Avaliação da coloração de tecidos foi feito, de forma independente, por dois observadores experientes (LW e HMC). Todas as amostras foram pontuadas cego e uma média de notas foi feita. Se os resultados discordantes foram obtidas, as diferenças foram resolvidas por avaliação e consulta conjunta com um terceiro observador, com experiência em patologia imuno-histoquímica.
A análise estatística
Todos os dados numéricos foram expressos como a média dos valores obtidos , e foi calculado o desvio padrão (SD). Os dados dos grupos tratados e controle foram comparadas pelo teste t de Student bicaudal. Todos os
P valores
eram de 2 lados. Uma maneira ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Dunnett foi realizada para determinar diferenças significativas em ratos médios alterações de peso em estudos toxicológicos. A sobrevivência foi calculada como o número de dias decorridos entre o início do tratamento e a eutanásia, e os ratinhos que sobreviveram% foi o número de animais que permanecem em cada grupo (× 10) no final de cada semana após o início do tratamento.
P Art 0,05 foi considerado significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de 4,00 GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA, EUA).
Resultados
Avaliação toxicológica de um único MAb C595, DTX e combinação tratamentos
administração de uma dose única de Mab C595 em 1, 5, 10, 15 mg /kg e DTX em 3, 5, 7, 10 mg /kg para os primeiros 3 semanas não atingiram pontos finais de toxicidade aos 70 dias pós-tratamento (Fig. 1A e B). Uma administração única de controle de MAb de IgG
3 a 15 e 20 mg /kg para as primeiras 3 semanas não atingir pontos finais toxicidade aos 70 dias pós-tratamento (dados não mostrados). Ratos tratados com 20 mg /kg MAb C595 /semana ou 15 mg /kg DTX /semana começou a perder peso e foram submetidos a eutanásia 4 semanas após o tratamento por causa dos sinais de sofrimento; exame histopatológico indicado nefropatia leve nestes grupos. Os resultados sugerem que a MTD para dose única mAb C595 situa-se entre 15 e 20 mg /kg, enquanto que a MTD para uma única administração de DTX situa-se entre 10 e 15 mg /kg.
alterações de peso percentual média em comparação com o Dia 0 (ou seja, o dia de administração única ou a combinação). A. Relação dose de tolerância em ratos por uma única MAb C595. ▪: AcM C595 (1 mg /kg); ▴: AcM C595 (5 mg /kg); ▾: AcM C595 (10 mg /kg); ♦: AcM C595 (15 mg /kg); •: AcM C595 (20 mg /kg). Para a diferença significativa entre 20 mg /kg de grupo tratado com o MAb C595 e outros grupos tratados com o MAb C595 (5-15 mg /kg) (
P
0,05). Relação dose de tolerância B. em camundongos por única DTX. ▪: DTX (3 mg /kg); ▴: DTX (5 mg /kg); ▾: DTX (7 mg /kg); ♦: DTX (10 mg /kg); •: DTX (15 mg /kg). Para a diferença significativa entre 15 mg /kg do grupo tratado com DTX e outros grupos tratados com DTX (5-15 mg /kg) (
P
0,05). Relação dose-tolerância em murganhos por C. teste de combinação [AcM C595 (5 mg /kg) + DTX (3-10 mg /kg)]. ▪: AcM C595 + DTX (3 mg /kg); ▴: AcM C595 + DTX (5 mg /kg); ▾: AcM C595 + DTX (7 mg /kg); ♦: AcM C595 + DTX (10 mg /kg). D. relação dose-tolerância em ratinhos de controlo por combinação [MAb de IgG
3 de controlo (5 mg /kg) + DTX (3-10 mg /kg)]. ▪: MAb de IgG
3 + DTX (3 mg /kg); ▴: MAb de IgG
3 + DTX (5 mg /kg); ▾: MAb de IgG
3 + DTX (7 mg /kg); ♦: MAb de IgG
3 + DTX (10 mg /kg). Pontos, média (n = 5 em cada grupo); barra, SD.
Para os tratamentos de combinação, utilizou-se 1/3 de MTD AcM C595 (isto é, 5 mg /kg) como um teste e 5 mg /kg de mAb IgG3 negativo como um controlo combinado com uma gama de DTX (1~10 mg /kg) para avaliar ainda mais a toxicidade dos tratamentos de combinação. Nenhuma toxicidade foi encontrado nos tratamentos de combinação (Fig. 1C e D). Não havia sinais macroscópicos de toxicidade crónica para os principais órgãos para quaisquer camundongos. contagem de leucócitos estavam deprimidos no sangue periférico nos ratinhos tratados às 2 semanas após a injecção, com a recuperação ocorre por 4 semanas e hematologia normal foi visto em 70 dias. Estes resultados sugerem que os tratamentos de combinação com MAb C595 e DTX ou com controle mAb IgG
3 e DTX pode ser usado com segurança em modelos animais para estudar a eficácia.
Efeito da única MAb C595 e DTX na inibição do crescimento tumoral e produção de ascite
Temos primeiro comparou a atividade antitumoral do único MAb C595, MAb IgG
3 controle, DTX único e de controle do veículo (HPMC), após o desenvolvimento de ascite e aspiração inicial de 3 semanas. volume cumulativo do fluido ascítico produzido por animal é apresentada na Fig. 2A. murganhos tratados com veículo continuou a produzir ascites a uma taxa mais frequente e teve de ser aspirada repetidamente durante o curso do tratamento (28 dias), enquanto os ratinhos tratados com C595 MAb produzido menos ascite relacionada com a dose do MAb C595 (4 ± 1 mL para HD e 5 ± 1 mL de LD, respectivamente) comparativamente com ratinhos mAb de controlo de IgG3 (7 ± 2 mL) (Fig. 2a). ratinhos tratados DTX desenvolvido ascite lentamente em comparação com o controlo de HPMC (6 ± 1 mL) e a produção de ascite foi relacionada com a dose de DTX (2 ± 1 mL para HD e 4 ± 1 mL de LD, respectivamente) (Fig. 2A ). O HD de DTX (10 mg /kg) reduziu significativamente o desenvolvimento da ascite (p . 0,05, Fig 2A). Para além da produção de ascites, que também avaliada a alteração de peso total de tumor em cada grupo no final das experiências (4 semanas após o tratamento). A alteração de peso do tumor é consistente com a mudança da produção de ascite (Fig. 2B). Um único MAb C595 inibiu apenas parcialmente o crescimento de OVCAR-3 tumores, como evidenciado pelo peso do tumor de 380 ± 80 mg em LD (5 mg /kg) e de 260 ± 76 mg em HD (150 mg /kg) versus 560 ± 77 mg em ratinhos que receberam o controlo negativo IgG3 mAb (15 mg /kg) (P 0,05), respectivamente, enquanto única DTX, obviamente, inibiu o crescimento de OVCAR-3 tumores, como evidenciado pelo peso do tumor de 230 ± 66 mg em LD (5 mg /kg ) e 75 ± 14 mg em HD (10 mg /kg) versus 540 ± 96 mg nos ratos que receberam o mesmo volume de HPMC (P 0,05), respectivamente (Figura 2B).. Estes resultados sugerem que tanto o MAb C595 e DTX pode induzir a regressão do crescimento tumoral OVCAR-3 em uma forma dependente da dose e que a actividade anti-tumoral de DTX é mais eficaz do que a do AcM C595.
Após a eutanásia, na cavidade peritoneal de cada rato foi lavada com 2 ml de solução salina normal, e depois de aspiração, foi registado o volume de ascite presente. os volumes cumulativos A. de ascites recolhidos de cada animal a partir do início da terapêutica [AcM C595 (H e L), o MAb de IgG
3, DTX (H e L) são mostrados. A diferença óbvia foi observada entre DTX (H) Grupo de grupo tenha sido tratada com e outros tratados com (
P Art 0,05). pesos B. Tumor (mg) no final das experiências após única mAb C595, o MAb de IgG
3, DTX ou veículo tratamentos com diferentes doses. O tumor era pesa obviamente menor nos grupos tratados com o MAb-e DTX-tratados em comparação com MAbIgG
3-tratada e HPMC-tratados grupos de controlo (
P
0,05). C. Efeito de mAb C595 único, o MAb de IgG
3, DTX ou veículo na supressão do aumento do marcador tumoral CA125 (CA125 kU /L) no fluido de ascite (lavagem peritoneal) no final das experiências. O nível de CA125 era obviamente inferior em AcM C595 (H) e tenha sido tratada com os grupos tratados em comparação com o DTX MAbIgG
3-tratada e HPMC-tratados grupos de controlo (
P
0,05). H: dose elevada; L: baixa dose. gráficos representativos são mostrados.
Efeito da combinação de MAb C595 e DTX no crescimento do tumor, a produção de ascite e sobrevivência
Em seguida, comparou a actividade anti-tumor da combinação de 1/3 de MTD O mAb C595 (5 mg /kg) ou o controlo MAb de IgG
3 (5 mg /kg) com uma dose de DTX (10 mg /kg) após o desenvolvimento de ascite e aspiração inicial durante 3 semanas. O teste de combinação (5 mg /kg de mAb C595 e 10 mg /kg DTX) pode inibir significativamente o desenvolvimento de ascite em comparação com o controle de combinação (5 mg /kg de mAb IgG3 e 10 mg /kg DTX) e controlo de veículo (Fig. 3A) . O padrão de produção de ascites no grupo de controlo combinação é semelhante ao observado para uma única de 10 mg /kg de tratamento DTX como descrito acima. volume cumulativo do fluido ascítico produzido por animal são apresentados para o teste de combinação de (0,4 ± 0,2 ml), controlo de combinação (2 ± 1 mL) e controlo de veículo (7 ± 2 mL) na fig. 3B (P 0,05). Quatro semanas após o tratamento, o tratamento de teste combinação inibiu significativamente o crescimento de OVCAR-3 tumores, como evidenciado pelo peso do tumor de 15 ± 11 mg versus 65 ± 16 mg no grupo de controlo de combinação e 560 ± 100 mg no grupo de controlo de veículo (P 0,05), respectivamente (Fig 4A e B).. A sobrevivência dos animais foi muito melhor no grupo de teste combinação do que os grupos de controle de combinação e veículo de controlo (p 0,05). (Fig. 4C)
A. No final das experiências, sem sinais óbvios de formação de ascite são vistas em combinação teste (5 mg /kg de mAb C595 + 10 mg /kg DTX) ratinhos tenha sido tratada com (a); sinais de formação de ascite foi encontrado na combinação de controlo (5 mg /kg de mAb C595 + 10 mg /kg DTX) ratinhos tenha sido tratada com (b); sinais óbvios de formação de ascite foi encontrado no veículo (solução salina + 02/01 02/01 HPMC) ratinhos tenha sido tratada com (C). B. Os volumes ascite cumulativos de teste de combinação, controle de combinação ou ratos tratados com o veículo são mostrados (
P Art 0,05). C. Efeito da combinação teste, controlo ou veículo combinação na supressão do aumento no nível de marcador tumoral (CA 125 kU /L) no fluido de ascite (lavagem peritoneal) no final das experiências (
P
0,05 ). imagem representativa e gráficos são mostrados.
A. muda o peso do tumor no final de experiências após o teste de combinação, de controle ou combinação de veículos tratamentos com diferentes doses (
P Art 0,05). B. O volume do tumor em ratinhos tratados com a combinação de ensaio foi significativamente menor do que nos ratinhos tratados com controlo de veículo (
P
0,01). C. Para todos os animais, a duração prevista do tratamento foi de 4 semanas. Os ratinhos (10 por grupo) foram sacrificados se, devido a problemas de saúde, eles eram esperados para se tornar moribundo dentro de um curto espaço de tempo. A sobrevivência foi calculada como o número de dias decorridos entre o início do tratamento e a eutanásia, e os ratinhos que sobreviveram% foi o número de animais que permanecem em cada grupo (× 10) no final de cada semana após o início do tratamento. A taxa de sobrevivência dos animais do grupo de teste de combinação foi muito melhor do que no grupo de controlo grupo de combinação ou veículo (
P
0,05). Imagens representativas e gráfico são mostrados.
tratamento único ou a combinação afeta os níveis de CA125 marcadores tumorais
No final de experimentos, alteração nos níveis médios CA125 para single MAb C595 em LD não foi significativamente diferente em comparação com MAb IgG
3 controle, ao passo que a alteração dos níveis de CA125 médios para única CA125 em HD ou DTX single foi, obviamente, diferente em comparação com MAb IgG
3 ou HPMC controle, respectivamente (
P
. 0,05) (Figura 2C). É evidente que o grupo de teste tinha níveis de CA125 combinação inibiu significativamente em comparação com o grupo de controlo combinado (
P
0,05) ou grupo de controlo do veículo (
P
0,01) (Fig. 3C). No eutanásia, os valores do veículo de CA125 eram 68.000 ± 12.000 kU /L, em comparação com o teste controlo de combinação e combinação de 14030 ± 5022 kU /L e 28306 ± 11403 kU /L, respectivamente. A redução nos níveis de CA125 fluido ascite livre de células é consistente com a redução no volume de ascite e peso do tumor.
Alterações histológicas em xenoenxertos de tumores após tratamento combinado
Para comparar a histologia de cada grupo, eu colhi tumores de camundongos tratados com combinação, o mAb C595 de tratamento de controlo e tratados com veículo de controlo no final das experiências e secções de parafina coradas com H e. Imagens representativas são mostrados na Fig. 6B.