Abstract

Fundo

Nós determinamos a expressão da caixa forkhead Q1 (FoxQ1) , e-caderina (e-cad), mucina 1 (MUC1), vimentina (VIM) e proteína de ligação de cálcio S100 A4 (S100A4), todos de transição (EMT) proteínas indicadoras epiteliais-mesenquimais no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) amostras de tecido. Nós também investigou a relação entre estes cinco expressão de proteínas e outros fatores clínico-patológicos em NSCLC. Finalmente, avaliamos o valor potencial desses marcadores como indicadores prognósticos de sobrevida em pacientes de NSCLC.

Métodos

Quantitative PCR em tempo real e imunohistoquímica foram utilizados para caracterizar a expressão do mRNA FoxQ1 e proteína em NSCLC. A expressão de transcritos e traduzidos para os produtos de outras proteínas indicadoras quatro EMT foi avaliada por imuno-histoquímica em NSCLC as mesmas amostras clínicas.

Resultados

ARNm e proteína FoxQ1 foram supra-regulados em NSCLC em comparação com o normal tecidos (

P = 0,015

e

P Art 0,001, respectivamente). Expressão de FoxQ1 no adenocarcinoma foi maior do que em carcinoma de células escamosas (

P

= 0,005), e alta expressão de FoxQ1 correlacionada com a perda de expressão E-cad (

P

= 0,012), e positividade anômala de VIM (

P

= 0,024) e S100A4 (

P

= 0,004). análise adicional de sobrevivência mostrou que a alta expressão de FoxQ1 (

P

= 0,047) e E-cad (

P

= 0,021) foram fatores prognósticos independentes.

Conclusão

FoxQ1 talvez desempenha um papel específico na EMT de NSCLC, e poderia ser utilizado como um factor de prognóstico para NSCLC

citação:. Feng J, Zhang X, Zhu H, Wang X, Ni S, Huang J (2012) FoxQ1 superexpressão Influências mau prognóstico em não-pequenas células do câncer pulmonar, Associates com o fenômeno da EMT. PLoS ONE 7 (6): e39937. doi: 10.1371 /journal.pone.0039937

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Março, 2012; Aceito: 29 de maio de 2012; Publicado: 28 Junho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Feng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Desenvolvimento social e projectos de investigação aplicada (S2010041) do governo Nantong, China; Cooperação Internacional e Intercâmbio (2011) do Departamento de Saúde Jiangsu; e do Fundo de Doutorado (2010) do Hospital Afiliado da Universidade de Nantong, Nantong, China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é o tipo mais frequente de câncer, ea principal causa de morte por câncer em todo o mundo, com maior mortalidade do que mama, próstata e cancro colorectal combinado [1], [2]. Ao longo das últimas três décadas na China, a mortalidade por câncer de pulmão aumentou em 465%, com estas doenças malignas tornando-se a segunda principal causa de morte após o cancro do fígado [3]. Apesar do grande avanço no tratamento de cancros nos últimos anos, o prognóstico para pacientes com cancro do pulmão continua a ser pobres, com taxas de sobrevida de 5 anos menos de 15% [4], [5]. A maioria dos pacientes com cancro do pulmão têm um período avançado da doença no momento do diagnóstico, e cerca de 85% destes cancros são o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) [1], [6].

vários estudos recentes têm observado que a transição epitelial-mesenquimal (EMT) é um acontecimento crítico na invasão de tumores e metástases em cancros epiteliais derivadas de [7] – [10], incluindo NSCLC [11] – [14]. A consciência dos fenômenos EMT remonta tão cedo quanto 1908. Durante os anos 1990, EMT ganhou mais reconhecimento como um mecanismo possivelmente importante nas doenças crônicas, como fibrose do órgão e câncer [15]. EMT é caracterizado por a sub-regulação de marcadores de diferenciação epitelial de E-caderina (E-cad) [16] – [20] e mucina 1 (MUC1) [21], e a sobre-regulação de marcadores mesenquimais, tais como a vimentina (VIM) [17] – [20], [22], [23], fibronectina [17], [20], [24] e S100 proteína de ligação ao cálcio A4 (S100A4) [25] – [28]. Estudos anteriores descreveram um papel fundamental para a caixa forkhead Q1 (FoxQ1) na regulação da EMT e agressividade em câncer humano [29] – [32].

FOXQ1, anteriormente conhecido como HNF-3 /forkhead homólogo 1 (HFH1 ), pertencente a um membro da família do factor de transcrição forkhead [32] – [34], que são expressos em diferentes tecidos e desempenham um papel importante no desenvolvimento, metabolismo, cancro e envelhecimento [30], [34]. Como um dos primeiros genes forkhead estudados, FOXQ1 tem sido implicada para reprimir os genes específicos do músculo liso, tais como Sm22α e telokin em células A10 [35]. FOXQ1 foi demonstrado ser um mediador a jusante de Hoxa1 em células estaminais embrionárias [36]. FOXQ1 humano, localizado no cromossoma 6p23-25, foi isolada e caracterizada [33] e desempenha um papel essencial na etiologia do cancro humano [31], [32].

Um passo-Q de RT-PCR foi realizada para confirmar a expressão de ARNm FoxQ1 em tecidos humanos. Os resultados foram normalizados para o nível de ARNm de GAPDH. O nível de mRNA FoxQ1 em tecidos NSCLC foram maiores do que em tecidos peritumoural com significância estatística usando um teste t-pareado. **

P

0,05. As barras indicam erro padrão (EP)

(A) 1 e 2:. Pulmão padrão de tecido de carcinoma de células escamosas com H E coloração; 3 e 4: expressão elevada de FoxQ1; 5 e 6: perda de expressão E-cad; 7 e 8: forte coloração VIM-positivo. (B) 1 e 2: pulmão padrão de tecido adenocarcinoma com H E coloração; 3 e 4: coloração positiva para FoxQ1; 5 e 6: coloração negativa para MUC1; 7 e 8: expressão de S100A4-regulada. (C) 1 e 2: tecido adenocarcinoma pulmonar com H E coloração; 3 e 4: IHC negativo para FoxQ1; 5 e 6: forte reação imunológica do E-cad; 7 e 8: negativo para S100A4. (D) 1 e 2: tecido pulmonar carcinoma de células escamosas com H E coloração; 3 e 4: baixa expressão de FoxQ1; 5 e 6: expressão elevada da proteína MUC1; 7 e 8: fraca expressão de VIM. ampliação original é × 40 para 1, 3, 5 e 7; e × 400 para 2, 4, 6 e 8.

Curves (A) calculado para a expressão FoxQ1. Alta expressão no grupo FoxQ1 (linha vermelha) indicou significativamente menor do que a sobrevivência baixa e nenhuma expressão no grupo FoxQ1 (linha azul). (B) Curvas calculadas para a expressão E-cad. Expectativa de vida de pacientes com coloração E-cad positiva são muito mais curtos (linha vermelha) do que em pacientes com coloração E-cad negativo (linha azul).

Estudos recentes têm descrito que FOXQ1 foi encontrado para ser overexpressed em câncer colorretal [29], [31] e cancro da mama [31], [32], em que os pacientes têm resultados clínicos pobres [31], [32]. Embora a superexpressão de FOXQ1 em linhas celulares de cancro confirmaram que o gene pode desempenhar um papel no desenvolvimento de cancro do pulmão [29], [33], a correlação entre a expressão de fatores FOXQ1 e EMT para determinar o seu significado clínico em NSCLC não tenha sido previamente relatado.

Analisamos a expressão do gene FoxQ1 usando transcrição reversa reacções em cadeia da polimerase quantitativa (RT-PCRs) em pequenas amostras de tecido congeladas de fresco, com NSCLC. A expressão da proteína FoxQ1 e quatro proteínas indicadoras comum EMT (E-cad, MUC1, VIM e S100A4) foi avaliada por imuno-histoquímica utilizando as secções mesmo tissue microarray (TMA). Adicionalmente, foi investigada a relação entre a expressão dos cinco genes que codificam para estas proteínas e outros factores clinicopatológicas em NSCLC. Finalmente, avaliamos o valor potencial desses marcadores como indicadores prognósticos de sobrevida em pacientes com NSCLC.

Métodos

Pacientes e TMA de amostras de NSCLC

Depois de uma análise patológica completa segundo a 7ª edição do TNM no câncer de pulmão [37], um painel de embebidos em parafina tecidos NSCLC fixados em formol com tecidos tumorais adjacentes submetidos a tratamento cirúrgico correspondente foram obtidos no Hospital Afiliado da Universidade Nantong entre janeiro de 2005 e dezembro de 2006. os dados clínicos (incluindo sexo, idade, tipo histológico, grau, palco, tamanho do tumor, diferenciação de status dos linfonodos metástases) foram obtidos a partir dos prontuários de cada paciente.

Entre o material de arquivo, 103 blocos de tecido de pacientes com NSCLC com registros de sobrevivência de acompanhamento de 5 anos estavam disponíveis e utilizadas para a construção do TMA. Uma área representativa de cada tumor foi seleccionado e 2,0 mm de núcleos de tecido foram utilizadas para construir um TMA por Shanghai Outdo Biotech (China). A qualidade dos cortes TMA foi confirmada utilizando a coloração de hematoxilina-eosina (H E). A idade média do grupo foi de 62,5 anos (variação: 35-81 anos). A sobrevida foi calculado a partir da data da cirurgia até a data da morte ou último follow-up. Além disso, um painel de 20 tecidos congelados de fresco e NSCLC correspondente peritumour tecidos do mesmo hospital mencionados acima foram usadas neste estudo. Antes da terapia cirúrgica, nenhum dos pacientes tinham recebido quimioterapia neoadjuvante, radioterapia ou imunoterapia. Aprovação ética para realizar este estudo foi obtido a partir Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos local.

RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)

O RNA total foi extraído e purificado a partir de 40 amostras de tecido NSCLC recentemente congelados , incluindo tecidos 20 e 20 NSCLC tecidos não cancerosos correspondentes. Extracção de ARN total, de controlo de qualidade e de uma etapa qRT-PCR foram realizados como descrito anteriormente [38]. iniciadores oligonucleotídicos específicos do FOXQ1 (para a frente, 5′-ACG CTG GCG GAG GAG ATC AAC-3 ‘; reverso, 5′-AGG TTG TGG GAG CGC ACG TT-3′) foram concebidos para originar um produto de PCR de 92 pb. Os dados foram normalizados usando desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) como um gene de referência (iniciador de sentido directo, 5’-TCG GAG TCA ACG TTG GAT GTC GT-3 ‘; iniciador reverso, 5’-TGC CAT GGG TGG AAT CAT ATT GGA-3 ‘).

a imuno-histoquímica (IHC)

O IHC foi realizada como descrito anteriormente [39]. secções desparafinadas (4-mm de espessura) a partir dos blocos de matriz foram coradas separadamente em um Universal Sistema de Coloração Autostainer (LabVision, EUA) utilizando os seguintes anticorpos primários: de ratinho anti-FOXQ1 (1:300 diluição; Abcam, Reino Unido), de ratinho anti-E -cad (1:120; Invitrogen, EUA), anticorpo monoclonal anti-MUC1 (1:200; Novocastra, UK), monoclonal de ratinho anti-VIM (1: 100; Invitrogen, EUA), e anticorpo policlonal de coelho anti-S100A4 (1 :100; Newmarker, EUA). Os anticorpos secundários utilizados foram: Envision de cabra anti-rato HRP (DAKO, EUA), Envision de cabra anti-coelho HRP (Dako, EUA). A avaliação da imunomarcação destas secções foi feito cego para dois patologistas treinados que desconheciam o quadro clínico das amostras

As percentagens de células FoxQ1-positivos foram marcados e colocados em quatro categorias de acordo com a coloração:. 0 para 0%; 1 para 1-33%; 2 para 34-66%; e 3 para 67-100%. As intensidades de coloração FoxQ1 foram também classificados como: 0, 1, 2 ou 3. A soma das percentagens e as pontuações de intensidade foi utilizado como o marcador de coloração FoxQ1 final, que temos descrito anteriormente [39], e tem sido definida como se segue: 0-2, baixa expressão; e 06/03, de expressão elevada. No entanto, para a positividade dos fabricantes selecionados EMT (E-cad, MUC1, VIM e S100A4), não detectáveis ​​ou coloração positiva de 10% das células tumorais foi considerado como negativo, ao passo que a coloração positiva ≥10% de células tumorais foi considerado positivo [40]. Todas as amostras foram avaliadas em 4 × e 10 × ampliação.

Métodos estatísticos

O nível de mRNA FoxQ1 em tecidos NSCLC recentemente congelados e correspondentes tecidos não cancerosos foi normalizado para GAPDH e analisados ​​usando o Wilcoxon teste de classificação assinado para testes não paramétricos. Associações entre as variáveis ​​clínico-patológicas e expressão da proteína FoxQ1 foram examinadas por χ

2 testes. O qui-quadrado foram utilizados para confirmar a correlação entre a expressão de proteínas indicadoras FoxQ1 e EMT. As curvas de sobrevida foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. Fatores apresentados como sendo de significado prognóstico nos modelos univariados foram avaliadas utilizando um modelo de regressão multivariada de Cox. Um

P

-valor inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados foram analisados ​​em Stata 9.0 (Stata Corporation).

Resultados

mRNA FoxQ1 expressão em NSCLC e peritumoural tecidos

O RNA total foi extraído dos tecidos NSCLC recentemente congeladas e submetido a um passo qRT-PCR para investigar a expressão de ARNm FoxQ1. Investigou-se também a partir de amostras de tecidos tumorais emparelhadas adjacentes. Quando normalizada para a GAPDH, a média dos níveis de expressão de ARNm FoxQ1 em NSCLC e correspondente tecido não canceroso foram de 0,15 ± 0,02 e 0,04 ± 0,02 (

P

= 0,015), respectivamente. expressão FoxQ1 foi 3,75 vezes superior, em média, nas amostras cancerosas do que em tecidos não-malignas (Fig. 1).

resultados IHC para proteínas indicadoras FoxQ1 e EMT em tecidos NSCLC

imuno-histoquímica típica os padrões de coloração observada para os cinco genes que codificam para o FoxQ1 e as outras quatro proteínas indicador EMT em NSCLC são mostrados na Figura 2. a coloração positiva para FoxQ1 foi localizada principalmente às células tumorais e pneumócitos no citoplasma e membrana plasmática em diferentes níveis. Enquanto coloração nuclear positiva poderia ser visto, FoxQ1 imunomarcação não foi observada no estroma destes tecidos. expressão alta FoxQ1 foi detectada em 82/103 (50,49%) de tecidos NSCLC e foi em 38 (20,39%) dos correspondentes tecidos tumorais adjacentes. Os dados mostraram significância estatística usando χ

análise do teste 2 (χ

2 = 38,6450,

P Art 0,001). E era consistente com os níveis de mRNA FoxQ1 em CPNPC

Positive expressão de e-cad e MUC-1 foi localizada na membrana celular, e uma combinação da membrana plasmática e citoplasma em células de tumor de NSCLC, respectivamente. coloração imuno-histoquímica positiva para o VIM e S100A4 em células cancerosas foi observada no citoplasma, e uma combinação do núcleo e no citoplasma. Uma exceção foi os fibroblastos do estroma positivas.

Relação entre a expressão de proteínas FoxQ1 e os parâmetros clínico em NSCLC

As associações entre a expressão FoxQ1 e as características clinicopatológicas de NSCLC são apresentados na Tabela 1. FoxQ1 a expressão da proteína em adenocarcinoma foi maior do que em carcinoma de células escamosas com significância estatística (χ

2 = 10,7089,

P

= 0,005) por χ

2 análise de teste. Em contraste, não houve associação significativa foi observada com a idade do paciente, sexo, diâmetro do tumor, grau histológico do tumor, estado de metástase linfonodal, e estágio agrupamento com TNM.

Correlação entre a expressão de FoxQ1 e as proteínas indicadoras EMT

as relações entre a expressão de FoxQ1 e as quatro proteínas indicadoras EMT foram calculados e foram delineadas na Tabela 2. Verificou-se que epiteliais frequências da perda de proteína nos tecidos 103 NSCLC foram 66,02% para o e-cad e 18,45 % para MUC1. Anormais frequências de expressão de proteínas mesenquimais nas mesmas amostras foram 23,30% para VIM e 68,93% para S100A4. O resultado também mostrou que a alta expressão de FoxQ1 correlacionada com uma perda de expressão de E-cad (χ

2 = 6,308,

P

= 0,012), e positividade anômala de VIM (χ

2 = 1.396,

P

= 0,024) e S100A4 (χ

2 = 8,374,

P

= 0,004) em amostras de NSCLC clínicos.

a análise de sobrevida

Vários fatores preditivos conhecidas de mau resultado em NSCLC foram avaliados para validar a coorte de pacientes representadas por este TMA (Tabela 3). Alta expressão da proteína FoxQ1 (

P

= 0,023) e baixa expressão da proteína E-cad (

P

= 0,002) mostrou associação estatisticamente significativa com a sobrevida em cinco anos por meio de análise univariada de regressão de Cox. Além destes dois marcadores genéticos, outros fatores prognósticos clínicos NSCLC, como a diferenciação de tumor e TNM fase foram incluídas em um modelo de regressão multivariada de Cox. Nossos dados demonstram que a alta expressão FoxQ1 (

P

= 0,047) e uma perda de expressão de E-cad (

P

= 0,021) foram confirmados para ser prognosticadores independentes para baixa sobrevivência do NSCLC.

a sobrevivência foi traçada pelo método de Kaplan-Meier. Os resultados identificaram que os pacientes com uma expressão FoxQ1 alta ou perda de expressão de E-cad teve um tempo de sobrevivência significativamente menor, em comparação com aqueles com baixa ou conservados expressão, respectivamente (Fig. 3).

Discussão

neste estudo, usando uma TMA, enfatizamos o valor prognóstico da expressão FoxQ1 em NSCLC. Alta expressão de FoxQ1 foi detectável no TMAs de amostras tumorais e foi significativamente correlacionada com sobrevida global diminuiu. Além disso, os resultados demonstraram que a expressão FoxQ1 foi significativamente associado com EMT num subgrupo de pacientes. Através de análise multivariada, alta expressão de FoxQ1 e reduzida expressão de E-cad mostraram-se biomarcadores prognósticos independentes para a sobrevida global pobres. Tanto quanto sabemos, este é o primeiro relatório sobre o significado clínico-patológico de expressão FoxQ1 relacionadas com EMT em amostras de tecido NSCLC clínicos.

Recentemente, o acúmulo de evidências sugere que FoxQ1 humana desempenha um papel fundamental na regulação da EMT de cancro da mama [31], [32], e agressividade no câncer de cólon [29], [32]. Há provas consideráveis ​​de que a presença do fenômeno EMT indica curta sobrevida no câncer de pulmão [11] – [14]. Para identificar a relação entre FoxQ1 e EMT no carcinoma do pulmão, quatro biomarcadores indicador frequentes foram investigados no cancro do pulmão TMA usando IHC. Curiosamente, os nossos resultados mostraram que os níveis elevados de expressão para a proteína FoxQ1 correlacionada com a diminuição da expressão da proteína E-CAD, e aumentos na expressão da proteína do VIM e S100A4.

Alguns autores demonstraram que a E-cad está ligada com metástases de câncer de pulmão [12]. VIM não se acredita estar associada com a sobrevivência no cancro do pulmão [14], embora S100A4 tem sido correlacionada com o prognóstico de carcinoma do pulmão de células escamosas [41] em estudos de investigação clínica. Nós também determinou o efeito prognóstico da expressão do marcador EMT por análise uni e multivariada. Nossos resultados revelaram que o único marcador associado com o resultado era E-cad.

Estudos recentes confirmaram que FoxQ1 ser um indicador de prognóstico valioso para pior sobrevida no câncer de mama [31], [32]. No entanto, uma expressão elevada do gene FoxQ1 também foi observada no cancro do pulmão, cancro gástrico, e linhas celulares de cancro do cólon [29]. Assim, os nossos resultados atuais corroboram os achados anteriores sobre a expressão FoxQ1 em NSCLC, especialmente em adenocarcinoma de pulmão.

Embora os mecanismos exatos de efeitos tumorigênicos de FoxQ1 em NSCLC não foram completamente descritos na nossa investigação presente, a base molecular para a associação entre FoxQ1 e EMT são bem compreendidos no tumor. Os resultados obtidos a partir dos nossos dados estão em conformidade com os apresentados na literatura emergente, que tinha declarado que a repressão de FoxQ1 levou a um aumento da expressão de E-cad no carcinoma humano [31], [32]. Coletivamente, os resultados do nosso estudo corroborou que FoxQ1 poderia ser potencialmente utilizado como um marcador de EMT em NSCLC.

Em conclusão, mostramos que FoxQ1 foi altamente expressa em NSCLC e poderia ser usado como um prognosticador direta de um resultado negativo. Além disso, os nossos resultados suportam o facto de FoxQ1 tem um papel funcional no que respeita aos genes relacionados-EMT em NSCLC.