Abstract

Silybin ou silibinin, um flavonolignan isolado a partir de sementes de cardo de leite, é um dos suplementos dietéticos populares e tem sido extensivamente estudada por suas propriedades antioxidantes, hepatoprotetor e propriedades anti-câncer. Nós ter imaginado que a potência de silybin poderá ser reforçada através de adequada modificação /s na sua estrutura química. Por conseguinte, aqui, sintetizados e caracterizados uma série de derivados de silibina ou seja, 2,3-desidrosilibina (DHS), 7-

O

-methylsilybin (7OM), 7-O-galloylsilybin (7OG), 7,23 -disulphatesilybin (DSS), 7-

O

-palmitoylsilybin (7OP) e 23-

O

-palmitoylsilybin (23OP); e comparou a sua eficácia anti-câncer usando HTB9 câncer de bexiga humana, HCT116 câncer de cólon e células de carcinoma da próstata PC3. Em todas as linhas de células 3, DHS, 7OM e 7OG demonstraram melhores efeitos inibidores de crescimento e em comparação com silibina, enquanto outros derivados de silibina mostraram menor ou nenhuma eficácia. Em seguida, nós preparamos os isômeros ópticos (A e B) de silibina, DHS, 7OM e 7OG, e comparou a sua eficácia anti-câncer. Os isómeros destes três derivados de silibina mostraram também uma melhor eficácia em comparação com os respectivos isómeros silibina, mas em cada um, não houve clara silibina A versus actividade preferência isómero B. Outros estudos em células HTB descobriu que DHS, 7OM e 7OG exercer melhor a actividade apoptótica de silibinin. ensaios clonogénicos em células HTB9 ainda confirmado que ambas as misturas racémicas bem como isómeros ópticos puros do DHS, 7OM e 7OG foram mais eficazes do que a silibina. No geral, estes resultados sugerem claramente que a eficácia anti-cancro de silibina pode ser significativamente aumentada por meio de modificações estruturais, e identificar forte eficácia anti-cancro dos derivados de silibina, isto é, o DHS, 7OM, e 7OG, significando que a sua eficácia e toxicidade devem ser avaliadas em modelos de câncer pré-clínicos relevantes em roedores

Citation:. Agarwal C, Wadhwa R, profundo G, Biedermann D, Gažák R, Křen V, et al. (2013) Anti-Cancer eficácia dos derivados Silybin – A Relação Estrutura-Atividade. PLoS ONE 8 (3): e60074. doi: 10.1371 /journal.pone.0060074

editor: Stephen J. Polyak, da Universidade de Washington, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de dezembro de 2012; Aceito: 21 de fevereiro de 2013; Publicação: 28 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Agarwal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NCI SR1 concede CA102514 e CA112304, AMVIS CZ-US ME10027 projeto colaborativo do Ministério da Educação da República Checa (VK e RA), e RVO61388971 (Conceito Institucional do Instituto de Microbiologia, Praga). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Silybin ou silibinin (C

25H

22O

10, CAS No. 22888-70-6, Figura 1a) é um suplemento dietético popular, isolada das sementes da

Silybum marianum

(L.) Gaertn (família Asteraceae), conhecida como cardo de leite. extrato de cardo de leite indicado como silymarin tem uma longa história de uso na medicina popular e agora é frequentemente utilizada para a prevenção e /ou tratamento de doenças do fígado, incluindo hepatite viral, cirrose hepática associada com o abuso de álcool, dano hepático das drogas toxinas industriais [1] – [3]. Silybin também é considerado um antídoto eficaz contra o envenenamento por cogumelos do tampão de morte (

Amanita phalloides

) [2], [4]. Além disso, silibina, também exibe uma forte actividade antioxidante por meio de eliminação de radicais hidroxilo e inibição da peroxidação de lípidos, actuando como um antioxidante que quebra a cadeia [5], [6]. Nas últimas duas décadas, para além hepatoprotetor e efeitos antioxidantes, silibina demonstrou notáveis ​​anti-cancro, bem como a eficácia quimiopreventiva do cancro na pré-clínico modelos de cultura de células e animais de vários cancros epiteliais, incluindo a pele, da bexiga, do cólon, da próstata, do pulmão etc. [7], [8]. Com base nestes resultados promissores dos estudos pré-clínicos, silibina também foi testado em pacientes com cancro humano em fase piloto ensaios clínicos I-II, em que foi relatada a ser bem tolerados e mostraram plasma e tecido-alvo biodisponibilidade [7], [ ,,,0],9] – [11]. Vários testes toxicológicos tradicionais provaram a natureza não-tóxica de silibina, e relata-se que são seguros para consumo humano [10], [12]. Com base na sua comprovada, bem como a eficácia preventiva e terapêutica contra o cancro emergente, seria de grande importância e valor de translação se a eficácia de silibina pode ser ainda reforçada por meio adequado modificação química /s, na sua estrutura, como é óbvio que a silibina possui uma “estrutura de liderança” eficaz.

(a-h) estruturas químicas de silybin, silybin a, B silybin, 2,3-desidrosilibina, 7-

o

-methylsilybin, 7-

O

-galloylsilybin, silybin 7,23-dissulfato, 7-

O

-palmitoylsilybin e 23-

O

-palmitoylsilybin.

nos últimos anos, tem havido uma maior ênfase na compreensão da estrutura química detalhada de silybin, identificar e sintetizar os seus estereoisómeros, bem como avaliar a sua eficácia biológica [13] – [17]. Silibina é agora confirmada ser uma mistura 01:01 dos dois isómeros ópticos ou seja silibina A e B silibina (Figura 1B e 1C). Além disso, o papel detalhada de respectivos grupos hidroxilo e porções de silibina foi agora bem caracterizados, e que o conhecimento permitiu a identificação dos locais adequados para a concepção e síntese de derivados de silibina novos sem afectar a actividade biológica dos conjugados resultantes [18] , [19]. Estes estudos identificaram que as posições mais adequadas para modificações silibina são 7-OH e /ou 23-OH [18], [19]; e com base nestas observações críticas, vários derivados de silibina foram concebidos, sintetizados e caracterizados [20] – [23]. Por exemplo, temos sintetizados e caracterizados 7

-O viajantes – e 23

-O

acil-derivados de silibinin com diferentes comprimentos de cadeia acilo, e atividades de suas propriedades antioxidantes e anti-virais confirmaram [20]. Do mesmo modo, uma série de ésteres galloyl silibina também foram sintetizados, e 7

-O

-galloylsilybin foi identificado como sendo o composto mais eficaz em termos de eficácia anti-angiogénico [21]. Nós também têm relatado que a eficácia anti-angiogénica do isómero B de 7

-O

-galloylsilybin é significativamente mais elevado do que o isómero [21]. Da mesma forma, silibina produto de oxidação, 2,3-desidrosilibina, também tem sido sintetizado que mostrou melhor potencial antioxidante do que a silibina; o derivado de ácido carboxílico de 2,3-desidrosilibina, nomeadamente ácido 2,3-dehydrosilybinic, mostrou melhores actividades eliminadoras de anti-peroxidação lipídica e anti-radicais e apresenta uma melhor solubilidade em água [22], [24]. Preparamos também uma grande série de

O

-alquilo derivados (metilo e benzi) de silibina e 2,3-desidrosilibina, e tenham identificado alguns novos derivados com forte eficácia contra a atividade de efluxo de drogas glicoproteína-P mediada [23]. Tomados em conjunto, os estudos acima sugeriram claramente que a eficácia biológica de silibina pode ser significativamente aumentada por meio de modificações químicas apropriadas.

Com vista a que vários derivados de silibina mostraram uma melhor actividade que molécula-mãe em vários sistemas biológicos e que silybin si exerce forte eficácia anti-câncer, no presente estudo, que comparou a eficácia anti-câncer de vários derivados de silibina (existentes, bem como recém-projetado) em três linhas celulares de cancro humano diferentes, e identificou três derivados silybin com anti- atividade câncer melhor do que silybin.

Materiais e Métodos

Cultura de células, Tratamento e Reagentes

células HTB9 bexiga humana, células HCT116 câncer de cólon e células PC3 de carcinoma da próstata foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). células HTB9 e PC3 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 100 U /mL de penicilina G e 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora. As células HCT116 foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 100 U /mL de penicilina G e 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO a 5%

2 incubadora. Todos os materiais de cultura de células foram a partir da Invitrogen Corporation (Gaithersburg, MD). As células foram plaqueadas e tratadas a 40-50% de confluência com diferentes doses de silibina ou os seus derivados (5-60 pM) em meio dissolvidos inicialmente em DMSO para os períodos de tempo desejados sob condição de soro. Uma quantidade igual de DMSO (veículo) estava presente em cada tratamento, incluindo o controlo; concentração de DMSO não excedeu 0,1% (v /v) em qualquer tratamento. No final dos tratamentos desejados, várias análises foram realizadas como descrito mais tarde. O anticorpo primário para cPARP e anticorpo secundário conjugado de peroxidase anti-coelho foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Beverly, MA). Anticorpo para tubulina foi de Neomarkers (Fremont, CA). Hoechst 33342, violeta de cristal e iodeto de propídio (PI) foram da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). sistema de detecção de ECL e anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-rato foram de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). Todos os outros reagentes foram obtidos em sua comercialmente disponível mais alto grau de pureza.

Química

Silymarin como material básico para todos os produtos consecutivos foi obtido a partir de Liaoning Senrong Pharm. Co., LTD (província de Liaoning Panjin, China). Opticamente puro silibina A e B silibina foram obtidos como descrito anteriormente [25], [26]; nomeadamente, um novo método de separação preparativa por nós desenvolvido recentemente [25], [26], o qual é baseado na discriminação enzimática catalisada por lipase de ambos silibina estereoisómeros, permitiu a preparação de todos os derivados mencionados neste trabalho em forma opticamente pura na grande escala. Os métodos de síntese, os esquemas de síntese e os dados analíticos que confirmam a estrutura do anteriormente sintetizados e relatado silibina derivados (os quais foram avaliados quanto à sua actividade anti-cancro no presente estudo) encontram-se resumidos em Methods S1 e Figuras S1, S2, S3, S4, S5, e Tabelas S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, respectivamente. Resumidamente, 2,3-desidrosilibina (DHS) A e B foram preparados por uma oxidação catalisada por base de silibina respectiva A e B como descrito recentemente [22], [24]; 7-

O

-Methylsilybin (7OM) A e B foram preparados pela metilação catalisada por base de silibina respectiva A e B [23]; e 7-

O

-palmitoylsilybin (7OP), 23-

O

-palmitoylsilybin (23OP) e 7-

O

-galloylsilybin (7OG) de ambos silybin A e B foram sintetizados como descrito anteriormente por nós [20] – [23].

Preparação de 7,23-dissulfato silybin [silybin-7,23-di-il

bis

(sulfato de hidrogênio), DSS], e Caracterização por RMN espectros de Massa e

a uma solução agitada de silibina [silibina a, B ou silibina silibina natural, a B (01:01), 200 mg, 0,43 mmol] em DMF (2 mL), foi adicionado Py⋅SO

3 (200 mg, 1,26 mmol). A reacção foi parada após 1 h de stiring a 40 ° C através da adição de EtOH (0,5 mL). Depois de uma curta agitação, a mistura reaccional foi carregada na coluna de gel de sílica e cromatografou-se com o solvente de EtOH /MeOH /CH

2Cl

2 /água (2/1/9 /0,3) para produzir uma cor amarela clara óleo, o qual foi liofilizado para se obter o composto do título, quer como o diastereómero a pura ou B ou a mistura a B (CCA 160 mg, 60%) como um liofilizado amarelo pálido

o espectro de massa do sintetizados. composto foram medidos em uma dessorção a laser assistida por matriz /ionização reflectrão time-of-flight massa espectrômetro de MALDI-TOF Ultraflex (Bruker-Daltonics, Bremen, dE). espectros positivos foram calibrados externamente utilizando o monoisotópico [M + H] + ion da angiotensina I humano 1.296,69

m /z

, MRFA peptídeo 524,26

m /z Comprar e CCA matriz pico de 379,09

m /z

. Uma solução de 10 mg /mL de α-ciano-4-hidroxi-cinâmico ou ácido 2,5- ácido dihidrobenzóico em MeCN a 50% /ácido acético a 0,3% foi utilizada como uma matriz MALDI. A 1 mL de amostra dissolvida em água foi deixado a secar a temperatura ambiente e o excesso de previsto com uma 0,3 mL da solução de matriz sobre o alvo. Os espectros de positivos ou negativos por MALDI-TOF foram recolhidos em modo de reflectrão. EM (MALDI-TOF):

m /z

(%) = 643 (17, M

+ H +.), 561 (32), 547 (36), 545 (100), 481 (25), 465 (69).

Os espectros de RMN foram medidos em Bruker Avance III 400 (observação freqüência 400,13 MHz para

1H, 100,62 MHz para

13 C) em DMSO

d

6

(Sigma Aldrich) a 30 ° C. sinal de solvente residual foi utilizado como padrão interno ((δ

H 2.500, δ

C 39.60). Os desvios químicos e constantes de interação foram registrados a partir de espectros em que foram aplicadas funções de ponderação (exponencial com expoente negativo e função Gauss). Os desvios químicos são expressos em δ escala (ppm) e as constantes de interação em Hz. resolução digital permite expressar os desvios químicos de protões com três e carbonos com duas casas decimais, respectivamente, e constantes de interação próton-próton com uma casa decimal. Multiplicidade de sinais de carbono foi determinada a partir editado-próton espectros HSQC atribuição de sinal é baseado em experiências de RMN 2D -. COSY, HSQC, HMBC, que foram realizadas utilizando programas padrão (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, dE)

1H e

. 13C RMN Os espectros de ambos opticamente puro silybinA-7,23-diilo

bis (sulfato de hidrogénio) e silybinB-7,23-diilo

bis (sulfato de hidrogénio), que não têm sido relatados até agora, estão descritos nas Tabelas 1 e 2, respectivamente.

Ensaios de Crescimento de células

em cada caso, as células foram plaqueadas a cerca de 40-50% de confluência e tratadas com silibina ou os seus derivados ou isómeros puros de cada composto sob a condição de soro tal como descrito acima. Após 24 e 48 h de tratamentos, as células foram recolhidas através de uma breve tripsinização e lavadas com PBS. número total de células foi determinada por contagem de cada amostra em duplicado utilizando um hemocitómetro sob um microscópio invertido. Cada ponto de tempo do tratamento e tinha três placas independentes.

Ensaio de Apoptose

morte celular apoptótica quantitativa por silibina e seus derivados em células HTB9 foi medida por ensaio de Hoechst como descrito anteriormente [27]. Resumidamente, após tratamentos desejadas, as células foram recolhidas e depois coradas com corante de ligação de ADN Hoechst 33342 e PI. As células apoptóticas foram quantificados usando o microscópio de fluorescência (mais Axioskope 2-HBO 100, Zeiss, Jena, Alemanha) por contagem das células /campo microscópico (a 400 x) em seis campos por cada amostra (em triplicado). células em apoptose mostraram azul brilhante (início de apoptose) ou fluorescência laranja-vermelho (final de apoptose), que foi distinguida a partir de células necróticas mostrando fluorescência vermelha brilhante (PI-manchado).

Western Blot

Para western blotting, lisados ​​(80? g) foram desnaturadas em 2X tampão de amostra de SDS-PAGE e foram resolvidos em géis de 8% de Tris-glicina. As proteínas separadas foram transferidas para membrana de nitrocelulose seguidas por bloqueio com 5% de leite em pó não gordo (w /v) em solução salina tamponada com Tris (Tris-HCl a 10, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) para 1 h à temperatura ambiente. Após o bloqueio, as membranas foram sondadas com anticorpo primário durante 2 h à temperatura ambiente e em seguida durante a noite a 4 ° C seguido por anticorpo secundário conjugado com peroxidase apropriado durante 1 h a temperatura ambiente e visualizados por sistema de detecção ECL. Em cada um dos casos, as manchas foram submetidos a exposições múltiplas de um filme para ter certeza de que a densidade da banda está na gama linear. Para todos os resultados, auto-radiograma /bandas foram digitalizados com o Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems Inc., San Jose, CA). Para garantir um carregamento de proteína igual, cada membrana foi despida e re-sondadas com anticorpo α-tubulina.

Ensaio clonogénico

HTB9 células foram plaqueadas em placas de 6 poços e deixou-se fixar às placas durante 24 h. Em seguida, dependendo do protocolo de tratamento, as células foram tratadas com cada composto a cada 72 h ou tratados apenas durante 2 h a cada 24 h. No fim do período indicado, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, fixada com a mistura de metanol e ácido acético glacial (03:01) durante 10 minutos e em seguida corado com 1% violeta de cristal em metanol durante 15 minutos, seguido de lavagem com água desionizada. Colónias com mais de 50 células foram contadas.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando SigmaStat 2.03 software (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Os dados foram analisados ​​usando um ANOVA seguido de Tukey t-teste, e uma diferença estatisticamente significativa foi considerada em

p

≤0.05.

Resultados

Efeito da Silybin e sua derivados em células do cancro do crescimento

primeiro, foi comparado o efeito inibidor do crescimento de silibina e seus derivados (estruturas químicas mostrado na Figura 1) DHS, 7OM, 7OG, DSS, 7OP 23OP e em linhas celulares de cancro humano da bexiga , origem do cólon e da próstata, ou seja HTB9, HCT116 e PC3, respectivamente; nomeadamente, silibinin mostrou forte eficácia anti-câncer em modelos pré-câncer de bexiga, cólon e próstata [7], [8]. Como mostrado na Tabela 3, em células HTB9 em 30 e 60 uM de doses, o DHS, 7OM e 7OG foram mais eficazes do que a silibina após 24 e 48 h de tratamentos em termos de inibição do crescimento celular; No entanto, a concentrações equimolares, os efeitos inibidores do crescimento de outros derivados, ou seja, DSS, 7OP, e 23OP, foram inconsistentes, e iguais ou menores do que a silibina. Do mesmo modo, em células HCT116, DHS, 7OM e 7OG foram mais eficazes na inibição do crescimento celular comparada silibina e outros derivados de silibina (Tabela 3). Em células PC3, silibina derivado (30 e 60 uM doses) mostraram a inibição do crescimento igual ou melhor do que a silibina após 24 h de tratamento (Tabela 3). Mais uma vez, o DHS, 7OM 7OG e foram muito mais eficazes do que a silibina ou outros derivados após 24 e 48 h de tratamentos em termos de inibição do crescimento celular; No entanto, o efeito de outros derivados de silibina (DSS, 7OP, e 23OP) foi perdido em grande parte a 48 h de tempo de pontos (Tabela 3). Juntos, estes resultados demonstraram claramente que apenas o DHS, 7OM e 7OG derivados de silibina têm eficácia anti-cancro muito mais forte do que a estrutura-mãe, e portanto, só estas três derivados foram utilizadas em estudos posteriores.

Efeito de silybin e seus derivados sobre a apoptose em células de indução HTB9

em seguida, comparamos o efeito da silybin e seus três derivados mais ativos (DHS, 7OM e 7OG) a 30 doses? M na indução de morte celular por apoptose em células HTB9. Como mostrado no painel 2A de fundo da figura, ao fim de 24 h de tratamento, os seus derivados de silibina e aumentaram significativamente a morte celular apoptótica em células HTB9, e 7OG foi mais potente na indução de apoptose. No entanto, análises de Western blot para a apoptose marcador cPARP mostrou um forte aumento com apenas 7OG (painel Figura 2A-superior). A melhor eficácia de derivados de silibina foi mais claramente evidente depois de 48 horas de tratamento em que o DHS, 7OM e 7OG aumentou significativamente a população de células apoptóticas (painel A Figura 2B-inferior), bem como aumentou o nível de cPARP em células HTB9 (Figura 2B-superior painel). Estes resultados confirmam ainda mais a eficácia anti-câncer forte e melhor do DHS, 7OM e 7OG comparação com Silybin contra células HTB9.

(A-B) células HTB9 foram tratados com 30 doses M de silibina (SB), 2,3-desidrosilibina (DHS), 7-

O

-methylsilybin (7OM) e 7-

O

-galloylsilybin (7OG). Após 24 ou 48 horas de cada tratamento, as células foram recolhidas e população apoptótica foi determinada por ensaio de Hoechst como detalhado no ‘Materiais e Métodos’. Nos diagramas de barras, cada ponto de dados é representativo da média ± desvio padrão de 3 amostras. (A-B, inserção Western blot) As células também foram recolhidas seguinte silibina ou seus derivados de tratamento e analisadas quanto ao nível de proteína cPARP por Western blotting. Em cada caso, as membranas foram também retirados e re-sondadas com anticorpo α-tubulina para verificar a carga de proteína. * P≤0.001.

Efeito de isómeros ópticos puros de Silybin e seus derivados sobre Cancer Cell Crescimento

Como mencionado acima que silybin é uma mistura (1:01 ratio) da óptica isómeros silibina a e silibina B, próxima preparado grande quantidade destes dois isómeros silibina e utilizou-os para sintetizar grandes quantidades de seus derivados DHS (a e B), 7OM (a e B) e 7OG (a e B) como resumido na métodos acima. Estes isómeros ópticos puros de silibina e seus derivados foram então avaliados quanto aos seus efeitos inibidores do crescimento de células de cancro. Em todas as três linhas de células de cancro, nomeadamente HTB9, HCT116 e PC3, isómeros puros (30 e 60 uM doses) de DHS, 7OM e 7OG eram mais eficaz em relação ao respectivo isómero de silibina após 24 e 48 h de tratamentos (Tabela 4) . Quando se comparou o crescimento celular efeitos inibitórios do isómero A versus isómero seus respectivos derivados de B e, a não observação clara pode ser feito, no entanto, silibina isómero B e seus derivados pareceu mais eficaz do que o isómero A e seus derivados (Tabela 4).

em seguida, compararam-se os efeitos inibidores do crescimento de doses mais baixas (5 e 10 uM) de isómeros ópticos de silibina (silibina a e silibina B), bem como os seus derivados DHS (a e B), 7OM (a e B) e 7OG (a e B) em células HTB9. Como mostrado na figura 3, na dose de 5