Abstract

Fundo

Recentemente , uma nova variante de ER-α, ER-α36 foi identificado e clonado. ER-α36 não possui actividade de transcrição intrínseca e, principalmente, medeia a sinalização de estrogénio não genômica. Aqui, nós estudamos o papel das vias de estrogênio sinalização não genômicas mediadas por ER-α36 em ação resistência e agonista do tamoxifeno.

Metodologia

A localização celular da ER-α36 foi examinado por imunofluorescência em MCF- 7 e células Hec1A. Células MCF-7 de cancro da mama, células MCF-7 expressando recombinante ER-α36 (MCF-7 /ER36), Hec1A células cancerosas endometrial e células Hec1A com siRNA knockdown de ER-α36 (Hec1A /RNAiER36) foram tratados com 17β-Estradial ( E2) e tamoxifeno (TAM) na ausência e na presença do inibidor de cinase U0126 e LY294002. Examinámos a fosforilação de moléculas sinalizadoras e a expressão de c-Myc por imunotransferência, e crescimento de células tumorais por ensaio MTT.

Conclusões

variante ER-ER α36 aumenta a actividade agonista TAM através da activação vias no cancro endometrial sinalização, e que ER-α36 está envolvido na iniciou-membrana

de novo

e adquiriu resistência TAM no cancro da mama

Citation:. Lin SL, Yan LY, Zhang XT, yuan J, Li H, Qiao J, et al. (2010) ER-α36, uma variante do ER-α, Promove Tamoxifen Agonist ação em células de câncer endometrial via MAPK /ERK e PI3K /Akt Pathways. PLoS ONE 5 (2): e9013. doi: 10.1371 /journal.pone.0009013

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 11 de dezembro de 2009; Aceito: 13 de janeiro de 2010; Publicação: 02 de fevereiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa básica da China (2006CB504004, 2006CB944005). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o tamoxifeno é um modulador selectivo do receptor de estrogênio (SERM), com agonistas mista /actividades antagonistas que tem sido amplamente utilizada como um tratamento eficaz de todas as fases do receptor de estrogénio (ER) cancro da mama -positivo [1]. Tamoxifen suprime a recorrência de câncer de mama e reduz a incidência de câncer de mama contralateral em 49% [2]. O tamoxifeno também tem sido usada como um agente quimiopreventivo de mulheres que têm elevado risco de cancro da mama [3]. Acredita-se que o tamoxifeno actua como um antagonista de competir com estrogénios para o domínio de ligação do ligando do ER, inibindo assim estrogénio mitogénica mediada por ER sinalização [4]. No entanto, o maior obstáculo ao tamoxifeno uso é a resistência tamoxifeno, que ocorre

de novo

ou pode ser adquirida após a sua utilização [5]. Além disso, o uso de tamoxifeno aumenta a incidência de cancro do endométrio em mulheres pós-menopáusicas com tratamento a longo prazo [6]. Os mecanismos moleculares subjacentes ambos

de novo

e adquiriu resistência ao tamoxifeno e sua ação agonista no tecido endometrial são mal compreendidos.

ER pertence à família hormônio esteróide da superfamília de receptores nucleares. é predominantemente Considera-se que o ER actua como um factor de transcrição que está localizada principalmente no núcleo celular [7]. No entanto, provas acumuladas de que o ER demonstrou também existe na membrana de plasma e participa na sinalização rápida estrogénio. Tem sido relatado que ER é modificado pós-tradução por palmitoilação no domínio de ligação ao ligando que podem contribuir para a sua localização da membrana [8]. Associação de ER e caveolin-1 também foi mostrado para facilitar a localização ER sobre a membrana do plasma [9]. Caveolina-1 é uma proteína estrutural de caveolae e serve como uma proteína de andaime para recrutar moléculas, tais como receptores do factor de crescimento, proteínas G, quinases Src de tirosina da família de PI3K e a [10] sinalização. Postulou-se que o estrogénio pode activar rapidamente diferentes vias de sinalização, incluindo a MAPK /ERK, fosfolipase C, PI3K /Akt e G vias acoplados à proteína activada por receptor no caveolae [11].

Recentemente, foram identificados e clonada uma nova variante de ER-α com um peso molecular de 36 kDa, que foi nomeado como o ER-α36 [12]. O original de 66 kDa ER-α foi denominado ER-α66 [13]. ER-α36 transcrição é iniciada a partir de um promotor localizado no primeiro intrão do gene do ER-α66 e é gerado a partir de dois eventos de splicing alternativo. ER-α36 proteína não tem, portanto, dependente do ligando e o domínio de transactivação -independente (FA-1 e FA-2), mas retém domínio de ligação ao ADN e domínio de dimerização parcial e domínios de ligação de ligandos [12]. ER-α36 possui um domínio ácido 27 amino única no C-terminal que substitui os últimos 138 aminoácidos codificados pelos exons 7 e 8 do gene ER-α66. O nosso relatório anterior mostrou que 17β-estradiol e SERMs como o tamoxifeno pode induzir a activação da via /ERK MAPK e estimular a proliferação celular por meio de ER-α36 associada à membrana [14]. Nós, assim, a hipótese de que o ER-α36 pode ser associada com a actividade agonista do tamoxifeno. No presente relatório, estudamos a função ER-α36 em células MCF-7 de cancro da mama ER-positivo e células cancerosas endometrial Hec1A, e investigou a contribuição da MAPK /ERK e PI3K /caminhos Akt mediado por ER-α36 ao agonista ação do tamoxifeno em câncer endometrial.

resultados

ER-α36 é expressa na membrana plasmática em células MCF-7 e células Hec1A

ER-α36 é uma nova variante de ER-α66 gerado pelo uso promotor alternativo e splicing alternativo [12]. Para examinar a expressão de ER-α36 em células MCF-7 e células Hec1A, análise de transferência de Western foi realizada usando anticorpo específico do ER-A36 contra os únicos 20 aminoácidos na extremidade C-terminal de ER-α36. ER-α36 é expresso em ambas as linhas celulares (Fig. 1A, esquerda). No entanto, a análise de Western blot falhou para detectar a expressão de ER-α66 em células Hec1A (Fig. 1A, direita), de acordo com o que Hec1A é uma linha celular de cancro ER-negativo [15]. Para examinar a localização celular de ER-α36, foi realizado ensaio de imunofluorescência. Em ambas as linhas celulares, imunofluorescência revelou um padrão de distribuição de membrana plasmática intensa (Fig. 1B). Cavéola é invaginada microestruturas sobre a membrana de plasma no qual caveolin-1 serve como uma proteína de andaime para formar o complexo de sinalização. Como mostrado na Fig. 1C, caveolin-1 foi expressa principalmente na superfície da célula (vermelho). imagens incorporadas da ER-α36 e caveolin-1 mostrou sinais de co-localização substanciais (amarelo) na membrana plasmática.

, a expressão de ER-α36 e proteína ER-α66 em células MCF-7 e Hec1A A . Extractos proteicos foram preparados a partir de células MCF-7 e Hec1A e usados ​​para a análise de Western blot. B, A localização de ER-α36 em células MCF-7 e Hec1A. Células cultivadas em lamelas foram fixadas e imunofluorescência corados com um anticorpo anti-ER-α36 específico (verde). As células foram contrastadas com Hoechst 33258 (azul). C, a co-localização de ER-α36 e caveolin-1 na membrana do plasma de células Hec1A. Verde: ER-α36; Vermelho: caveolin-1; azul: nuclear; sinais de amarelo, co-localização. Bar, a 10 micrómetros. D, análise tempo-curso de expressão ER-α36 em células Hec1A. Hec1A células foram tratadas com 2 uM Tam para pontos de tempo indicados. Os níveis de expressão da proteína foram normalizados com o nível de expressão β-actina, e cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 em comparação com células não tratadas

Em seguida, analisamos a expressão de ER-α36 induzida pelo ligando.. Hec1A linhas celulares foram tratadas com tamoxifeno para diferentes pontos de tempo e expressão de ER-α36 foi avaliada por análise de transferência de Western, que revela que a expressão de ER-α36 foi aumentada em células tratadas com tamoxifeno (Fig. 1D).

ER-α36 medeia estrógeno e e Tamoxifen- Stimulated ERK Activation

para investigar o mecanismo subjacente ao efeito agonista do tamoxifeno em células de câncer de endométrio, decidimos analisar a função da ER-a36 em células Hec1A tratadas com tamoxifeno. Em primeiro lugar, examinou os níveis de fosforilação da MAPK /ERK, uma cinase de serina-treonina envolvida na proliferação de células [16]. Como mostrado na Fig. 2A e a fig. 2B, E2 ou tratamentos tamoxifeno resultar na rápida fosforilação de ERK1 /2. Reprobing a membrana com um anticorpo total de ERK1 /2 indicou que o teor total de ERK1 /2 não foi alterada, o que sugere que o aumento da ERK1 /2 fosforilação não foi causado por um aumento da expressão de ERK1 /2.

A e B, Hec1A células foram tratadas com 10 nM de E2 ou 2 uM Tam para os pontos de tempo indicados. Os níveis de fosforilação de ERK1 2 /foram medidos em extractos de proteína com a análise de Western blot. Total de ERK1 /2 foi utilizado como controlo de carga. Cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 em comparação com células não tratadas. C e D, expressão ER-α36 em Hec1A /V e células Hec1A /RNAi. Cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 comparado com células Hec1A /V. E, Hec1A /V e células Hec1A /ARNi tratadas com 10 nM de E2 ou 2 uM Tam foram analisadas para os níveis de ERK1 /2 com a fosforilação de Western blot. Total de ERK1 /2 foi utilizado como controlo de carga, e cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 em comparação com células não tratadas (-) vs tratamentos. F, lisados ​​de Hec1A células tratadas com DMSO (pistas 1, 2 e 3), 10 nM E2 (pistas 2 e 5), 2 m Tam (pistas 3 e 6), ou pré-tratadas com 10 mM U0126 (pistas 4, 5 e 6 ) por 30 min foram analisados ​​com análise de Western blot.

para testar o envolvimento de ER-α36 nas atividades de E2 e tamoxifeno observada em células Hec1A que carecem de expressão ER-α66, decidimos bater down expressão ER-α36 com a abordagem siRNA. Nós estabelecemos linhas de células estáveis ​​que expressam vetor de expressão shRNA contra ER-α36 (células Hec1A /RNAi) e examinou a expressão ER-α36 (Fig. 2C e 2D). Como mostrado na Fig. 2E, E2 e tamoxifeno não estimularam a fosforilação da ERK1 /2 em células Hec1A com ER-A36 derrubado, o que sugere que o ER-A36 é o receptor que medeia as actividades de estrogénio e tamoxifeno.

Quinase

reguladas extracelularmente cinase (MEK) actua a montante da ERK1 /2 e pode fosforilam e activam ERK1 /2 [17]. O U0126 inibidor específico MEK efetivamente inibiu a 2 activação ERK1 /estimulado por E2 e tamoxifeno (Fig. 2F).

Também estabelecemos linhas celulares estáveis ​​de células cancerosas MCF-7 de mama ER-positivo que ER recombinante constitutivamente expresso -α36 (MCF-7 /ER36 células) (Fig. 3A). No controlo de células MCF-7 transfectadas com o vector vazio, tratamento E2 fosforilação induzida da ERK1 /2 (Fig. 3B), que pode ser abolida por tamoxifeno (Fig. 3C). No entanto, o tamoxifeno induziu a fosforilação da ERK1 /2 em células MCF-7 /ER36 células (Fig. 3D). MEK U0126 inibidor específico inibiu eficazmente a 2 activação de ERK1 /estimulada por E2 e tamoxifeno (Fig. 3E). Portanto, estes resultados indicam que o ER-α36 medeia a via /ERK Ras /MEK induzida por estrogénio e tamoxifeno e sugeriu que o ER-A36 pode estar envolvido na resistência tamoxifeno e até mesmo promover a acção agonista do tamoxifeno.

A , análise de Western blot de expressão ER-α36 em MCF-7 /V e MCF 7-/ER36 células. Os níveis de expressão foram normalizados para níveis de β-actina, e cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 comparado com MCF-7 /V células. B e C, as células MCF-7 /V células tratadas com 10 nM de E2 sozinha ou com 2 uM Tam juntos para os pontos de tempo indicados. Os extractos de proteína foram analisados ​​por análise de Western blot. Total de ERK1 /2 foi utilizado como controlo de carga. Cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 em comparação com células de controlo. D, MCF-7 /ER36 células tratadas com 2 uM Tam para diferentes pontos de tempo foram analisados ​​para a ERK1 2 fosforilação /com Western blot. Os níveis de expressão foram normalizadas para os níveis do total de ERK1 /2, e cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3) *, P . 0,05 comparada para as células não tratadas. E, os lisados ​​foram preparados a partir de MCF-7 /ER36 células tratadas com DMSO (pistas 1, 2 e 3), 10 nM de E2 (pistas 2 e 5), 2 uM de Tam (pistas 3 e 6) ou pré-tratados com U0126 10 uM (pistas 4, 5 e 6) durante 30 min e imunologicamente com anticorpos contra pErk1 /2 ou total ERK1 /2.

ER-α36 Medeia estrógeno e e Tamoxifen-Stimulated PI3K /Akt Activation

é bem conhecido que a serina /treonina-quinase Akt, ou proteína-quinase B, desempenha um papel importante na proliferação celular e sobrevivência por inibição da apoptose [18]. Testou-se o tratamento com tamoxifeno E2 e também induz a activação da via de Akt em células Hec1A. Tratamento de E2 e tamoxifeno conduziu a uma rápida fosforilação da Akt (Fig. 4A e 4B), enquanto que tanto o tamoxifeno e E2 não conseguiu induzir a fosforilação nas células de Akt Hec1A /ARNi (Fig. 4C). O tamoxifeno também induziu a fosforilação de Akt em células MCF-7 que altamente expresso recombinante ER-α36 (Fig. 4E). O pré-tratamento com o inibidor de PI3K LY294002 revogada a fosforilação estimulada por E2 Akt ou tamoxifeno em ambas as linhas celulares (Fig. 4D e 4F), indicando que o ER-α36 medeia tamoxifeno induzida Akt fosforilação através da via PI3K nestas células. Assim, os nossos dados sugerem que activaton da via PI3K /Akt ER-α36 mediada também pode estar envolvido na resistência e acção agonista do tamoxifeno.

Hec1A células foram tratadas com 10 nM de E2 (A) ou 2 fiM Tam (B) para os pontos de tempo indicados e os lisados ​​foram coradas imunologicamente com um anticorpo contra Akt fosforilada. Os níveis de fosforilação foram normalizados com a proteína Akt total e cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 em comparação com células não tratadas. C, a análise por Western blot da fosforilação de Akt em Hec1A /V e células Hec1A /ARNi ER36 tratadas com 10 nM de E2 ou 2 uM Tam durante 10 min. Os níveis de fosforilação foram normalizados com a proteína Akt total e cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 em comparação com células não tratadas. #, P 0,05 comparado com E2- ou células Hec1A /V-tratados Tam. D, células Hec1A pré-tratado com 50 uM de inibidor de PI3K LY294002 (LY, pistas 4, 5 e 6), durante 2 h e depois tratou-se com 10 nM de E2 (pistas 2 e 5) ou 2 fiM Tam (pistas 3 e 6), durante 10 min . E, a análise de Western blot de fosforilação de Akt em células MCF-7 /ER36 células tratadas com 2 uM Tam para os pontos de tempo indicados. A expressão foi normalizada para Akt total, e cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3) *, P . 0,05 comparada para as células não tratadas. F, os lisados ​​foram preparados a partir de MCF-7 /ER36 células tratadas com DMSO (pistas 1 e 2), 2 uM de Tam (pistas 2 e 4) ou pré-tratado com 50 uM de inibidor de PI3K LY294002 (LY, pistas 3 e 4) para dois h, e imunologicamente com anticorpos contra fosforilada Akt ou Akt total.

ER-α36 está envolvido na regulação do c-Myc expressão de proteínas em células Hec1A

proto-oncogene c-Myc tem profundas efeitos mitogénicos em células cancerosas através da sua capacidade de promover a progressão do ciclo celular [19]. Os oligonucleótidos anti-sentido para c-Myc podem inibir a proliferação das células do cancro da mama [20]. O tamoxifeno inibe a expressão de c-Myc induzida por estrogénio em células de câncer de mama-ER-α66 positivo. No entanto, c-Myc desempenha um papel importante na acção agonista tamoxifeno [21]. Medimos os níveis de c-Myc expressão em células Hec1A tratados com E2 ou tamoxifeno. Como mostrado na Fig. 5A, o tratamento com E2 ou tamoxifeno induzida a expressão de c-Myc em células Hec1A /V, mas não em /ARNi células ER-α36 Hec1A, o que poderia ser eficazmente revogada pelo U0126 inibidor MEK (Fig. 5B) e inibidor de PI3K LY294002 (Fig. 5C).

a, a análise Western blot da expressão de c-Myc em Hec1A /V e células Hec1A /ARNi tratadas com 10 nM de E2 ou 2 uM Tam durante 12 h. Os níveis de expressão foram normalizadas para os níveis de β-actina, e cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 em comparação com células não tratadas (-) vs tratamentos. #, P 0,05 comparado com células Hec1A /V-tratados Tam. células B e C, Hec1A foram tratadas durante 12 h com 10 nM de E2 ou 2 uM Tam ou em conjunto com 10 uM de inibidor de MEK U0126 ou 50 uM de inibidor de PI3K LY294002. Os níveis de expressão de c-Myc foram normalizadas para os níveis de β-actina, e cada barra representa o valor médio ± SEM (n = 3). *, P 0,05 em comparação com células não tratadas (-) vs tratamentos. #, P . 0,05 em comparação com células E2- e Tam-tratados Hec1A /V

ER-α36 Medeia Proliferação celular Tamoxifen estimulada em células Hec1A

Para aprofundar o estudo do papel de ER-α36 em actividade agonista tamoxifeno em células de cancro do endométrio, Hec1A /V e células Hec1A /ARNi foram tratados com tamoxifeno e o seu prolifaration foi medida com o ensaio MTT. ensaio MTT mostraram que o tamoxifeno estimulou o crescimento de células Hec1A /V. No entanto, o tamoxifeno foi capaz de inibir o crescimento de células Hec1A /ARNi de uma forma dependente da dose (Fig. 6A). A proliferação celular induzida pelo tamoxifeno foi inibida pela U0126 inibidor MEK e PI3K inibidor LY294002 (Fig. 6B), sugerindo que tanto a MAPK /ERK e PI3K /vias de Akt foram envolvidos em E2 e tamoxifeno estimulou o crescimento celular em células de cancro do endométrio.

placas de 96 poços a, células Hec1A transfectadas com o vector vazio de expressão (Hec1A /V) ou linhas celulares Hec1A em que ERα36 tinha sido estavelmente derrubado por expressão shRNA (Hec1A /ARNi) foram plaqueadas (3 × 10

3 células /cavidade). As células foram tratadas com diferentes concentrações de Tam em meio contendo 2,5% de dextrano-carvão despojado de FBS durante 72 h. ensaio de MTT foi realizado como descrito em

Materiais e métodos

. Os resultados de três experiências independentes e foram ponderadas valor média ± SEM são mostrados. *, P 0,05 comparado com células /V Hec1A-tratados Tam respectivamente. B, células Hec1A foram tratadas com 10 nM de E2 ou 2 uM Tam em conjunto com 10 uM do inibidor MEK U0126 ou 50 uM de inibidor de PI3K LY294002, respectivamente, durante 72 h, e analisadas por ensaio MTT. Os resultados de três experiências independentes e foram ponderadas valor média ± SEM são mostrados. *, P 0,05 em comparação com células de controlo. C, vector de expressão vazio transfectadas células MCF-7 (células MCF-7 /v) ou células MCF-7 transfectadas com (7-MCF /ER36 células) ERα36 vector de expressão foram semeados em placas de 96 poços (5 x 10

3 células /poço). As células foram tratadas com diferentes concentrações de tamoxifeno em meio contendo 10% de FBS durante 72 h. ensaio de MTT foi realizado. Os resultados de três experiências independentes e foram ponderadas valor média ± SEM são mostrados. *, P 0,05 comparado com tratados com Tam MCF-7 /ER36 de células, respectivamente. D, MCF-7 /V e MCF-7 /ER36 células foram tratadas com 2 uM Tam em conjunto com 10 uM U0126 ou 50 uM de inibidor de PI3K LY294002, respectivamente, durante 72 h e analisadas por ensaio MTT. Os resultados de três experiências independentes e foram ponderadas valor média ± SEM são mostrados. *, P 0,05 em relação ao controle 7-MCF /V células

Observou-se que o tamoxifeno proliferação de células fortemente inibida nos 7 MCF-A /V células, de acordo com relatórios anteriores que as funções de tamoxifeno como um. potente antagonista no cancro da mama ER-positivo células MCF-7 [22]. No entanto, as células MCF-7 /ER36 células que expressam constitutivamente níveis elevados de RE-α36 recombinante exibiu insensibilidade ao tratamento com tamoxifeno (Fig. 6C). A MEK U0126 inibidor de PI3K LY294002 e inibidor, além disso, inibiu o crescimento de ambas as linhas celulares (Fig. 6D). Estes resultados sugerem novamente que o alto nível de expressão ER-α36 pode conferir resistência ao tamoxifeno.

Discussão

O tamoxifeno é um SERM que tem sido amplamente utilizada para tratar avançada ER-positivo cancro da mama e para prevenir o câncer de mama em pré alto risco e mulheres na pós-menopausa como um agente quimiopreventivo [23], [24]. No entanto, o tamoxifeno também tem actividade estrogénica parcial no útero que pode levar a hiperplasia do endométrio [25]. uso de tamoxifeno a longo prazo está associada a um aumento da incidência de cancro do endométrio [26]. Aqui relatamos que uma nova variante de ER-α, ER-α36, que é altamente expresso na membrana plasmática de células de cancro do endométrio Hec1A e nas amostras de cancro do endométrio a partir de pacientes que tinham sido tratados com tamoxifeno durante pelo menos três anos. Ambos E2 e tamoxifeno induzida a proliferação celular de células Hec1A presumivelmente através das ER-α36 mediada vias de sinalização não-genômicos.

Uma série de hipóteses têm sido postuladas para explicar a ação agonista do tamoxifeno na carcinogênese endometrial. Tem sido sugerido que os metabolitos reactivos de Tamoxifen forma de DNA de-aductos e gerar mutagenicidade no tecido do endométrio [27]. Também tem sido demonstrado que o domínio de AF1 ER-α66 bem como o recrutamento coativador células e específicos do promotor estão envolvidos na acção agonista tamoxifeno [28], [29]. O papel do tamoxifeno na carcinogénese do endométrio podem utilizar actividade genómico distinto [30]. Recentemente, evidências acumuladas sugerem que as vias de sinalização iniciada por membrana conferir resistência tamoxifeno e ação agonista através de diferentes cascatas de cinase e mensageiros segundo distintas [15].

A família MAPK consiste de ERK, JNK e P38. ERK desempenha um papel essencial no crescimento e proliferação celular. JNK e p38 estão envolvidas na diferenciação celular e a apoptose induzida por estímulos de stress, tais como a luz UV [31], γ radiação [32], [33], ADN-prejudicial e quimiopreventivos drogas [34]. Muitas moléculas de sinalização oncogénicos activar a via de MAPK /ERK [35]. expressão de ERK é geralmente aumentada e a sua actividade é regulada para cima em tecidos de cancro da mama em comparação com tecidos normais vizinhas [36]. Além disso, a resistência tamoxifeno

in vivo

é predominantemente mediada por mecanismos não-genômicos. a acção do estrogénio Genomic parece menos ativo [37], [38]. Neste estudo, descobrimos que ER-α36 medeia tanto E2- e ativação induzida pelo tamoxifeno da via MAPK /ERK e superexpressão ER-α36 no tamoxifeno MCF 7-células sensíveis à redução de sensibilidade ao tamoxifeno. Além disso, o ER-α36 tamoxifeno medeia a activação induzida de via de MAPK /ERK e também contribui para a acção agonista do tamoxifeno em células de cancro do endométrio Hec1A. tecidos de câncer de endométrio que altamente expressa ER-α36 também exibidos altos níveis de fosforilação ERK.

O PI3K /Akt desempenha um papel importante no crescimento e sobrevivência celular [39]. Akt é activado por muitas vias de sinalização, tais como sobre-expressão de receptores de factores de crescimento [40]. Introdução de um Akt constitutivamente activa em células MCF-7 poderia induzir resistência tamoxifeno, protegendo as células de apoptose induzida por tamoxifeno [41]. Além disso, a actividade de Akt é dramaticaly aumentada em células MCF7 resistentes tamoxifen- [18]. Em pacientes Akt-positivos fosforilada, terapia endócrina tem pior eficácia do que em pacientes Akt negativo fosforilados [42]. Neste estudo, verificou-se activação estimulada por tamoxifeno ER-α36 mediada de Akt em células com elevados níveis de expressão de ER-α36 sugerindo que a activação da via PI3K /Akt mediada por ER-α36 contribui para a resistência e o agonista de acção de tamoxifeno .

A proteína c-Myc é um factor de transcrição nuclear que desempenha um papel essencial no crescimento de células [43]. Estudos anteriores demonstraram que MAPK /ERK e PI3K /Akt regular a expressão de c-Myc proteína [44], [45], [46]. Encontramos ambos E2 e tamoxifeno induzida expressão de c-Myc através da ativação ER-α36 mediada por ERK e Akt. A incubação de células com Hec1A U0126 inibidor MEK e inibidor de PI3K LY294002 e bloqueado E2- tamoxifen- induzida a expressão de c-Myc. Portanto, o tamoxifeno exerce a sua acção através de agonista via não-ER-genómico mediada por α36.

Em resumo, foi relatado aqui que o ER-α36 é expressa na membrana de plasma e no citoplasma de células de carcinoma do endométrio. Demonstramos ainda que ambos E2 e tamoxifeno promoveu a proliferação de células de cancro do endométrio através da activação mediada por ER-α36 da MAPK /ERK e PI3K /Akt e a sobre-expressão vias ER-α36 levou a resistência tamoxifeno em células MCF-7. Nossos resultados fornecem novas informações importantes para entender melhor os mecanismos moleculares subjacentes à acção agonista do tamoxifeno.

Materiais e Métodos

Materiais e Reagentes

Todos os produtos químicos e reagentes foram adquiridos de Sigma indicada a menos que o contrário. Anticorpo policlonal anti-ERK1 /2, anticorpo policlonal anti-fosfo-ERK1 /2 (Thr

202 /Tyr

204), policlonal anti-caveolin-1 -TRITC anticorpo, anticorpo anti-c-Myc monoclonais, policlonais anticorpo anti-Akt, anticorpos monoclonais anti-er-α66 anticorpo (D-12) e anticorpo anti-β-actina monoclonal foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Policlonal anti-fosfo-AKT (Ser

473) foi obtido a partir do anticorpo Signalway Anticorpo (Pearland, TX). O anticorpo específico do ER-α36 contra os 20 aminoácidos únicas na posição C-terminal do ER-α36, plasmídeo de expressão de ER-α36, vector de expressão de ER-α36 shRNA e o vector de expressão vazio foram descritos antes [12], [14]. U0126 foi adquirido de Calbiochem (La Jolla, CA).

Cultura de Células e Linhas Celulares

células MCF-7 de cancro da mama humano foram obtidas de ATCC (Manassas, VA), e do endométrio humano Hec1A células cancerosas foram obtidas do Dr. Li-Hui Wei (Hospital Peking University Pessoas, Pequim). Ambas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO

2 no meio de cultura apropriado. Para estabelecer as células MCF-7 que expressam recombinante ER-α36, as células foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10

5 células por 60 mm de prato e transfectadas 24 horas mais tarde com um vector de expressão conduzido pelo cytomagalovirus (CMV) em o vector de expressão de mamífero pCB6 + como descrito noutro local [14], usando o Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O vector de expressão contém o cDNA de ER-α36 de comprimento completo. O vector de expressão vazio também foi transfectada em células para servir como controlo. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram re-plaqueadas e seleccionadas com 500 jig /ml de G418 durante duas semanas. O meio foi mudado de três em três dias até as colónias apareceram. Os clones foram expandidos para posterior análise. Os clones com expressão elevada de ER-α36 eram uma mistura de mais do que vinte clones e denominado MCF-7 /ER-α36. Uma linha de células com os clones reunidos transfectadas com o vector de expressão vazio foi chamado MCF-7 /V e utilizada como um controlo.

também linhas celulares estabelecidas a partir de células transfectadas com um Hec1A shRNA vector de expressão de ER-α36 (Hec1A /ARNi) e o vector de expressão vazio (Hec1A /V). Resumidamente, o ER-α36 shRNA vector de expressão pRNAT-U6.1 /Neo plasmídeo contendo o shRNA contra ER-A36 (GenScript Corp. TX) e o vector de expressão vazio foram transfectados em células Hec1A com Lipofectamine 2000 de acordo com as instruções do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram re-plaqueadas e seleccionadas com G418 (600 ug /ml) durante duas semanas. Clones foram expandidos para análise posterior.

imunofluorescência e microscopia confocal

A localização celular da proteína foi determinada por imunofluorescência indireta. Hec1A ou células MCF-7 cultivadas em lamelas de vidro estéreis foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 min. Depois de ter sido permeabilizadas com 0,4% de Triton X-100 à temperatura ambiente durante 10 min, as células foram bloqueadas em PBS a 4% durante 1 h e incubou-se durante a noite a 4 ° C com anticorpo anti-ER-específica-α36 suplementado com BSA. Após três lavagens em PBS, as células foram marcadas com o anticorpo secundário conjugado com FITC. O corante de ADN Hoechst 33258 foi usada para coloração nuclear.

Para dupla coloração de ER-α36 e caveolin-1, após a coloração de ER-α36 e lavagem em PBS, as células foram bloqueadas em 4% BSA-PBS suplementado durante 1 h à temperatura ambiente. Após a incubação com anti-caveolin-1-TRITC anticorpo durante a noite, as células foram novamente lavadas em PBS e coradas com Hoechst 33258. análises microscópicas foram realizadas utilizando um microscópio confocal de varredura a laser (Zeiss LSM 510 META, Alemanha).

semi-quantitativo de RT-PCR

o ARN total foi extraído por TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total (1,6 ug) foi utilizada para a produção da primeira cadeia de ADNc por transcriptase reversa (Takara, Dalian, P.R.China). Os seguintes conjuntos de iniciadores foram desenhados para a amplificação de ER-α36 humana (BX640939, 1145-1434 pb): para a frente, 5′-CAAGTGGTTTCCTCGTGTCTAAAGC-3 ‘e inverso, 5′-TGTTGAGTGTTGGTTGC CAGG-3′; ARNm de GAPDH humano foi amplificado por o iniciador de sentido directo 5’-ACGGATTTGG TCGTATTGGG-3 ‘e o iniciador inverso 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’.

Ensaio MTT

A proliferação celular foi analisada utilizando o 3 – (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazólio (MTT) [47]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma concentração final de 5 x 10

3 /cavidade para MCF-7 /V e MCF-7 /ER36 células ou 3 × 10

3 /cavidade para Hec1A /V e células Hec1A /ARNi. MCF-7 /V e MCF-7 /ER36 células foram incubadas em meio DMEM contendo 10% de FCS com os tratamentos indicados. Hec1A células /V e Hec1A /ARNi foram incubadas em meio isento de vermelho de fenol contendo 2,5% de FCS dextrano-carvão despojado (Biochrom AG, Berlim, Alemanha) com os tratamentos indicados. As células foram então incubadas com MTT (0,5 mg /ml) durante 4 h a 37 ° C. Após a remoção do meio contendo o reagente MTT, 150 ul de DMSO foram adicionados a cada poço. As placas foram lidas a comprimentos de onda de 490 nm utilizando um leitor de microplacas (Bioteck Powerwave ™, EUA).

Análise Western Blotting

As células foram cultivadas em meio de vermelho de fenol livre com 2,5% de dextrano charcoal- FCS durante 48-72 horas e em seguida mudadas para meio sem soro 12 horas antes da estimulação por agentes indicado. As células foram recolhidas em PBS arrefecido em gelo, e os extractos celulares foram preparados em tampão RIPA com o cocktail de inibidores de proteinase a partir de Sigma (St. Louis, MO). Os lisados ​​celulares foram cozidos com tampão de gel de carga durante 5 min a 100 ° C, resolvido em 10% SDS-PAGE, transferidos para membranas de PVDF, sondadas com anticorpos apropriados e visualizada com quimioluminescência aumentada (ECL) reagentes de detecção (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ).

análise estatística

a análise estatística foi realizada utilizando-amostras pareadas

t

-teste ou ANOVA seguido pelo teste de Student-Newman-Keuls para determinar diferenças de médias.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Li-Hui Wei por gentilmente fornecer as células Hec1A.. Agradecemos também o Dr. Yong-Feng Shang na Universidade de Pequim e Dr. Heide Schatten da Universidade de Missouri para a leitura cuidadosa do manuscrito e sugestões pensativo.