Abstract

Objectivo

3 ‘ desoxi-3 ‘- [

18F] -fluorotimidina ([18F] FLT) é um marcador utilizado para avaliar a proliferação celular

in vivo

. O objectivo do estudo foi a utilização de [18F] tomografia por emissão de FLT positrões (PET) para estudar os efeitos anti-proliferativos de forma não invasiva precoce do agente quimioterapêutico experimental TP202377 em ambos os tumores sensíveis e resistentes.

Métodos

foram usadas xenoenxertos em ratinhos de 3 linhas de células de cancro humanas: a linha celular de cancro do ovário A2780 sensível TP202377 (n = 8-16 tumores /grupo), a linha celular induzida resistente A2780 /Top216 (n = 8-12 tumores /grupo) e a linha natural resistente cólon SW620 de células do cancro (n = 10 tumores /grupo).

In vivo

captação de [18F] FLT foi estudado no início do estudo e repetida 6 horas, do dia 1 eo dia 6 após TP202377 tratamento (40 mg /kg i.v.) foi iniciado. captação do traçador foi quantificada utilizando pequenos animais PET /CT.

Resultados

TP202377 (40 mg /kg a 0 horas) causou inibição do crescimento no dia 6 no modelo de tumor A2780 sensível em relação ao controle grupo (P 0,001). No A2780 modelo de tumor de tratamento TP202377 causou redução significativa na incorporação de [18F] FLT em 6 horas (-46%, p 0,001) e no dia 1 (-44%; P 0,001) após início do tratamento, em comparação com a absorção de linha de base. No dia 6 de captação foi comparável à linha de base. O tratamento com TP202377 não influenciou o crescimento do tumor ou [18F] absorção de FLT nos modelos resistentes tumorais A2780 /Top216 e SW620. Em todos os grupos de controle de captação de [18F] FLT não se alterou. a expressão do gene de Ki67 em paralelo [18F] absorção de FLT.

Conclusão

O tratamento de xenoenxertos de A2780 em ratinhos com TP202377 (dose única iv) causou uma diminuição significativa na proliferação celular avaliada por [18F] FLT PET após 6 horas. A inibição persistiu no Dia 1; no entanto, a proliferação celular tinha regressado aos valores basais no dia 6. No resistentes A2780 Top216 e SW620 modelos de tumor captação /de [18F] FLT não se alterou após o tratamento. Com [18F] FLT PET foi possível distinguir de forma não invasiva entre tumores sensíveis e resistentes já 6 horas após o início do tratamento

citação:. Munk Jensen M, Erichsen KD, Björkling F, Madsen J, Jensen PB, Sehested M, et al. (2012) [18F] FLT PET para avaliação não invasiva da sensibilidade do tumor à quimioterapia: Estudos com Experimental Quimioterapia TP202377 em Câncer xenoenxertos humanos em ratinhos. PLoS ONE 7 (11): e50618. doi: 10.1371 /journal.pone.0050618

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de agosto de 2012; Aceito: 23 de outubro de 2012; Publicado: November 30, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Munk Jensen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Tecnologia avançada, Conselho Dinamarquês para Pesquisa médica, Fundação Rigshospitalet Research, Svend Andersen Foundation, AP Møller Foundation, Novo Nordisk Foundation, Fundação Lundbeck e dinamarquês Cancer Society. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Peter Buhl Jensen tem interesses de propriedade e emprego no TopoTarget A /S. Maxwell Sehested tem interesses de propriedade e emprego no TopoTarget A /S. Fredrik Björkling tem emprego no TopoTarget A /S. Kamille Dumong Erichsen tem emprego no TopoTarget A /S. Todos os outros autores não têm qualquer conflito de interesses. Que alguns dos co-autores são empregados por TopoTarget A /S não altera a adesão dos autores para as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar.

Introdução

Um desafio durante o desenvolvimento de novas drogas anti-câncer é discriminar entre respondedores e não-respondedores no início do curso de tratamento. Durante o desenvolvimento pré-clínico de agentes anti-câncer de testes do efeito in vivo de novas drogas-candidatos com biomarcadores de imagem pode ajudar na orientação de que os candidatos droga para desenvolver, melhorar os conhecimentos dos candidatos a medicamentos e ajudar na seleção de quais biomarcadores preditivos poderia ser incluídos nos estudos clínicos futuros. Muitos agentes quimioterapêuticos novos e já aprovados que só têm efeito anti-tumor num subgrupo de pacientes. A identificação desses pacientes após início precoce do tratamento pode resultar em uma mudança para outros tratamentos nos pacientes não respondem e, consequentemente, reduzir os tratamentos desnecessários. A utilização da técnica de imagiologia de tomografia por emissão de positrões não-invasiva (PET) para a imagem da célula proliferação com o marcador 3? -desoxi-3 ‘- [18F] -fluorotimidina ([18F] FLT) foi testado em diferentes configurações pré-clínicos [1] – [10]. [18F] FLT é utilizado para avaliar a proliferação celular

In vivo

por PET, por medição da actividade de timidina-quinase 1 (TK1), que é sobre-regulada na fase S do ciclo celular [11] – [ ,,,0],16]. TK1 é uma enzima da via de ADN residual. TK1 converte timidina para monofosfato de timidina (através do qual ele está ainda fosforilado em trifosfato de timidina e incorporados no DNA) e, assim, têm uma função chave na síntese de DNA e proliferação celular. TK1 é uma enzima centrais envolvidos na captação de [18F] medições FLT e, portanto, a expressão do gene TK1 foi incluído nos presentes estudos para avaliação de [18F] absorção de FLT. O método padrão para a avaliação da proliferação de células de tumores é por imuno-histoquímica de Ki67. A medição da quantidade de células positivas Ki67 em um tumor sólido requer uma biópsia e, portanto, as medições sequenciais de proliferação celular em tumores durante o tratamento é muitas vezes limitado por causa dos desafios com remoção de biópsias em série. antigénio Ki67 é uma proteína expressa em células onde se encontra localizado no nucléolo [17] em proliferação. Ki67 é expressa em G1, S, G2 e fase M do ciclo celular, mas não durante a fase G0 de repouso, sendo a expressão mais alta na fase mitótica [18]. A proliferação celular é, muitas vezes, quer o alvo primário ou secundário de muitas drogas anti-cancro, e, por conseguinte, a investigação de alterações na proliferação de células por utilização de [18F] FLT PET pode ser utilizado após o tratamento com vários fármacos anti-cancro. No entanto, [18F] alterações FLT após o tratamento são muito variáveis ​​e dependem dos tumores e tratamentos [19].

Apesar de muitos estudos pré-clínicos investigaram as mudanças na [18F] absorção de FLT após o tratamento com diferentes quimioterápicos poucos estudos analisaram as diferenças de captação de [18F] FLT entre responder e tumores não responder [20], [21].

Anteriormente, descobrimos que [18F] FLT diminuiu 2, 6 e 24 horas após o tratamento com Top216 num modelo de tumor A2780 sensível [22]. TP202377 é um análogo da Top216 anteriormente descrito com a mesma actividade anti-tumoral potente, mas menor toxicidade [23]. Ambos Top216 TP202377 e pertencem a um grupo de compostos em construir um 1,3-di-hidro-2-ona andaime. Estes compostos inibem a síntese de proteínas e do ADN e induzem a apoptose e apresentam actividade anti-cancro potente em várias linhas celulares e modelos de ratinho de cancro humano. TP202377 induz regressão completa do tumor em um modelo PC3 rato (linha de células de câncer de próstata humano) xenotransplante [23]. O mecanismo exacto de acção destes compostos é ainda desconhecido; No entanto, o efeito anti-cancro é de alguma forma ligada à via mTOR e pode ser devido ao esgotamento dos aminoácidos intracelulares [24].

De modo a investigar se a diminuição de [18F] absorção FLT após o tratamento é preditivo para um posterior regressão do tamanho do tumor, existe uma necessidade de conhecimento sobre se as primeiras alterações em [18F] absorção FLT são específicos para os tumores sensíveis. Neste estudo nós investigamos [18F] absorção de FLT em três modelos de tumor das quais duas são resistentes a TP202377 (A2780 /Top216 e SW620) [23], [24] após o tratamento, a fim de investigar se as alterações na [18F] absorção de FLT revela se os tumores são sensíveis droga. Utilizou-se o modelo de tumor do ovário A2780 sensível porque TP202377 tem efeito anti-tumor neste modelo de tumor e o desenvolvimento de novos agentes quimioterapêuticos para o tratamento de cancro do ovário é altamente necessário. Muitos pacientes de cancro do ovário mostram uma resposta inicial à quimioterapia; No entanto, numerosos pacientes com recaída tumores resistentes aos medicamentos e, por conseguinte, o desenvolvimento de novos agentes quimioterapêuticos para o tratamento de cancro do ovário é de grande interesse.

O objectivo do estudo era, por conseguinte, para analisar se [18F] FLT PET pode ser utilizada para separar responder de tumores não responder no prazo de 24 horas após o início do tratamento com o novo anti-câncer composto TP202377. Para fazer isso, nós fotografada proliferação de células

in vivo

com [18F] FLT PET antes e durante o tratamento em ambos um TP202377 sensível e dois modelos humanos resistentes tumor rato câncer. Os dados de imagem foram comparados com Ki67 e expressão gênica TK1 e crescimento do tumor medido com tomografia computadorizada (CT).

Materiais e Métodos

Tumor Modelo

Animal Care e todos os procedimentos experimentais foram realizados sob a aprovação do animal Welfare Council Dinamarquês (2006 /561-1124). Fêmea NMRI (Naval Medical Research Institute) ratinhos nus (8 semanas de idade) foram adquiridos a partir de Taconic Europa (Lille Skensved, Dinamarca) e deixou-se aclimatar durante uma semana na instalação para animais antes de qualquer intervenção foi iniciado. árvore foram usadas diferentes linhas de células, a linha de ovário humano sensível ao TP202377 celular de carcinoma A2780 [25] (uma oferta de R. Ozols, Fox Chase Cancer Center, Filadélfia, PA, Janeiro de 2004), uma forma TP202377 resistente da linha celular A2780 A2780 /Top216 ea linha de células de cancro do cólon humano SW620. A linha celular SW620 foi adquirida da ATCC (LGC Standards AB, Borås, Suécia). O resistentes clone A2780 Top216 (A2870 /Top216) foi feita depois de série

in vitro

passagens e seleção de clones de A2780 na presença de concentrações crescentes de Top216. A /Top216 clone A2780 é multi-resistente a TP202377 [23].

O crescimento de tumores seguinte TP202377-tratamento de A2780 (painel superior), A2780 /Top216 (meados painel) e SW620 (painel inferior). O volume do tumor foi determinado por microCT. Os ratinhos foram tratados com TP202377 (40 mg /kg i.v.) ou veículo no dia 0. N = 8-16 tumores /grupo. *) P 0,05, **) p 0,01, ***) p 0,001 tratamento versus grupo de controle no mesmo ponto de tempo

[18F] absorção de FLT medida como SUVmean (painéis esquerdos). e SUVmax (painéis da direita) no A2780, A2780 /Top216 e SW620 após o tratamento com TP202377 ou veículo. N = 8-16 tumores /grupo. *) P 0,05, **) p 0,01, ***) p 0,001 versus linha de base no mesmo grupo de tratamento. #) P 0,05, ##) p 0,01, ###) p . 0.001 tratamento versus grupo de controle no mesmo ponto de tempo

Representante [18F] imagens FLT PET /CT de A2780 ( painel superior), A2780 /Top216 (meados painel) e xenoenxertos SW620 (painel inferior) (círculos pontilhados). [18F] absorção de FLT é medido nos mesmos animais no início do estudo e 6 horas, dias 1 e 6 follow início do tratamento com TP202377.

As alterações no volume do tumor medidos como proporção Dia 6 /base, em comparação com captação de [18F] FLT medido como proporção de 6 horas /linha de base (painel direito) e Dia 1 /linha de base (painel esquerdo).

a expressão de Ki67 e TK1 normalizados para a média geométrica dos três de referência genes. Os dados são apresentados como alterações de dobragem após o tratamento em relação aos níveis basais. N = 6-8 tumores /grupo. *) P 0,05, **) p 0,01, ***) p 0,001 versus linha de base no mesmo grupo de tratamento. #) P 0,05, ##) A P 0,01, ###) p 0,001. Tratamento versus grupo de controle no mesmo ponto de tempo

Para estabelecimento de xenotransplantes, 10

7 células em 100 mL do meio misturado com 100 mL Matrixgel ™ Basement Membrane Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) foram injectados subcutaneamente no flanco esquerdo e direito, respectivamente, durante a anestesia com 01:01 v /v mistura de Hypnorm® (Janssen Pharmaceutica, Beerse, Bélgica) e Dormicum® (Roche, Basileia, Suíça). As linhas celulares foi testado livre de micoplasma. Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640+ forma GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (Biological Industries, Israel) e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen) em 5 .% de CO

2 a 37 ° C

foram usadas Experimental design by

os xenoenxertos em ratinhos a partir de 3 linhas celulares de cancro humano: a linha de células de cancro do ovário A2780 TP202377-sensível (n = 4 -8 ratos /grupo = 8-16 tumores /grupo), a linha celular induzida TP202377-resistant A2780 /Top216 (n = 4-6 ratinhos /grupo = 8-12 tumores /grupo) e o natural TP202377 resistente ao câncer de cólon SW620 A linha de células (n = 5 ratinhos /grupo = 10 tumores /grupo).

In vivo

captação de [18F] FLT foi estudada em vários pontos de tempo após o tratamento com TP202377 (40 mg /kg por via intravenosa a 0 horas) ou veículo (2% de DMSO, 20% de HP-b-CD em solução salina ). A estrutura química do TP202377 é mostrado na Figura 1. TP202377 foi em análises anteriores mostraram inibir o crescimento dos tumores de xenoenxerto A2780, mas não do A2780 /Top216 e SW620. [18F] varreduras FLT foram realizadas antes quer TP202377 ou veículo foi injectado para determinar o nível basal de captação do traçador. O desenho do estudo foi longitudinal e a [18F] varreduras FLT foram repetidas nos mesmos animais 6 horas, um dia, e no dia 6 (5-7) após a injecção.

O volume do tumor foi seguida por tomografia computadorizada durante os experimentos [26]. Os volumes tumorais foram calculados em relação ao volume no início do estudo.

A expressão de Ki67 e TK1 foram analisados ​​

in vitro

em grupos paralelos de ratos com A2780, A2780 /Top216 e tumores SW620, respectivamente, que foram tratados quer com TP202377 ou veículo e biópsia antes e 6 horas, dias 1 e 5 após o início do tratamento. As biópsias foram feitas usando uma agulha de 18G e colocado imediatamente no RNA Later® (Ambion (Europe) Limited, Cambridge, Reino Unido). Todas as amostras foram armazenadas a 4 ° C e, no dia seguinte RNAlater® foi removida e as amostras transferidas para -80 ° C até posterior processamento qPCR.

Síntese de [18F] FLT

[18F] FLT foi sintetizado usando 3-N-Boc-1- [5-O- (4,4′-dimetoxitritil) -3-O-nosilo-2-desoxi-D-β-lyxofuranosyl] timina como precursor e sintetizado em GE TracerLab MX Sintetizador como previamente descrito [22]. Todos os reagentes e [18F] cassetes FLT foram comprados da ABX (Radeberg, Alemanha).

microPET e microCT imagem

i.v.

Os camundongos foram injetados com 9,6 ± 1,7 (média ± SD) MBq [18F] FLT. Uma hora depois os ratos injecção traçadores foram anestesiados com 3% de sevoflurano (Abbott Scandinavia AB, Solna, Suécia) misturado com 35% de O

2 em N

2 e fixo sobre um leito em presença de três marcadores fiduciais permitindo a fusão de PET e CT imagens. Um exame PET foi adquirida através de um MicroPET Foco 120 (Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, EUA), seguido por um microCT varredura adquirida com um sistema MicroCAT® II (Siemens Medical Solutions) como descrito anteriormente [22]. Após a aquisição de dados, os dados PET foram organizados em sinograms e subsequentemente reconstruída com o algoritmo de reconstrução máxima a posteriori (MAP). O tamanho do pixel foi 0,866 × 0,866 × 0,796 mm e no campo Centro de vista a resolução foi de 1,4 mm de largura total-at-meia-máxima.

Imagens

PET e microCT foram fundidos no software Inveon (Siemens Medical Solutions). Antes região fusão de interesses (ROIs) foram elaboradas nas imagens CT manualmente através de uma avaliação qualitativa que abrange os tumores integrais e posteriormente absorção de volume tumoral e tracer, avaliados por valores padrão de captação (SUV) média e máxima, foram gerados pelo somatório dos voxels dentro do aviões tomográfica.

quantitativo em tempo real de Reacção em Cadeia da polimerase (qPCR)

o ARN total foi isolado a partir das biópsias com TRI reagent® seguindo as instruções do fabricante (Molecular Research Center Inc., OH, USA ) e, subsequentemente, a integridade de ARN foi medida num Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). qualidade RNA é indicado como número de integridade do RNA (RIN). A concentração de ARN foi determinada por NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EUA). O ARN total (0,3 mg) foi revertida transcrito utilizando o kit Affinityscript ™ QPCR de síntese de ADNc (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram arrefecidas e armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.

A expressão de genes foi quantificado num sistema em tempo real, PCR Mx3000P® da Stratagene. Todos gene de interesse (Góis) e genes de referência foram quantificados com Brilliant® Mix SYBR® Verde QPCR Master (Stratagene). O perfil térmico seguinte foi utilizado em todas as experiências: 10 minutos de desnaturação a 95 ° C, seguido de 45 ciclos de 30 segundos de desnaturação a 95 ° C, 1 minuto de recozimento a 60 ° C e uma extensão minutos a 72 ° C. Uma curva de dissociação foi depois adquirido pela desnaturação dos produtos durante 1 minuto a 95 ° C seguido por um aumento gradual da temperatura desde 55 ° C a 95 ° C, com passos de C /ciclo de 0,5 ° em que a duração de cada ciclo foi de 18 segundos .

dados QPCR foram analisados ​​no programa QBASE. A quantificação relativa do Gois foi calculada utilizando vários genes de referência [27]. Tecido a partir de amostras de linha de base serviu como calibrador. O nível do Gois foi normalizada para a média geométrica dos três genes de referência. Os três genes de referência mais estáveis ​​foram encontrados a partir de um painel de 12 candidatos, o painel gene de referência humana (TATAA Biocenter AB, Göteborg, Suécia), mediante o uso do algoritmo geNorm.

Os iniciadores foram concebidos usando Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, EUA) e as sequências são mostradas na tabela 1. Para cada gene a concentração óptima de iniciadores foi encontrado. Todos os ensaios foram optimizadas para ter eficiências entre 95% e 105%. Todas as amostras foram realizadas em triplicado utilizando um uL de ADNc. Para cada amostra de um controle de transcrição não-reverse (Nort) foi incluído, e em cada prato um controle sem modelo (NTC) foi incluído.

Análise Estatística

Comparações de volume tumoral entre o tratamento e grupos de controlo foram calculados utilizando o teste t de Student não pareado. Teste t pareado foi utilizado para comparações intra-grupo. correção de Bonferroni da P-valores para comparações múltiplas foi aplicado. Correlações entre SUVmean e SUVmax rácios e tumor de crescimento foram calculadas por meio de regressão linear. Os cálculos foram feitos em O SPSS 18.0 (IBM Corporation, Armonk, Nova Iorque, EUA). Os dados são apresentados como média ± SEM e P . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Tumor Volume

tumores A2780 que foram tratados com TP202377 tinham volumes no dia 6, que foram 161 ± 13% em relação à linha de base. Nos volumes do grupo de controlo no dia 6 A2780 foram 322 ± 38% em relação à linha de base, que foram significativamente maiores em comparação com o grupo de tratamento (P 0,001). tumores A2780 /Top216 que foram tratados com TP202377 tinham volumes no 6 ° dia que eram 442 ± 65% em relação à linha de base. No A2780 /Top216 volumes do grupo de controlo no dia 6 foram 376 ± 59% em relação à linha de base que não era diferente do do grupo de tratamento. SW620 tumores que foram tratados com TP202377 tinham volumes no 6 ° dia que eram 198 ± 15% em relação à linha de base. Nos volumes do grupo de controlo SW620 no dia 6 foram 193 ± 9%, o que não era diferente do do grupo de tratamento (Figura 2).

[18F] FLT Absorção

absorção basal de [18F] FLT medido como SUVmean foi de 1,44 ± 0,06 em tumores A2780, 0,83 ± 0,02 em tumores A2780 os /Top216 e 0,86 ± 0,03 em tumores SW620. No tumor A2780 tratamento modelo TP202377 causou redução significativa na incorporação de [18F] FLT de 1,51 ± 0,07 na linha de base para 0,78 ± 0,03 em 6 horas (-46 ± 3%, p 0,001) e 0,79 ± 0,04 no dia 1 (- 46 ± 3%; P 0,001) (Figura 3). No dia 6 de absorção foi de 1,67 ± 0,12 que foi comparável à linha de base. Entre o grupo de tratamento e controlo da absorção era diferente em 6 horas (p 0,001) e no dia 1 (P 0,001) (Figura 4). O tratamento com TP202377 não influenciou [18F] absorção de FLT SUVmean nos modelos resistentes tumorais A2780 /Top216 ou SW620 e não foram observadas diferenças entre os grupos de tratamento e controle. Em todo o controle grupos [18F] FLT SUVmean não se alterou durante o experimento.

Linha de Base captação de [18F] FLT medida como SUVmax foi 2,58 ± 0,13 nos tumores A2780, 1,24 ± 0,03 na A2780 /Top216 tumores e 1,50 ± 0,04 em tumores SW620. TP202377 tratamento causou redução significativa na incorporação de [18F] FLT no modelo de tumor A2780, conforme medido por SUVmax. Na absorção de grupo de tratamento diminuiu de 2,67 ± 0,17 na linha de base para 1,20 ± 0,05 (-53 ± 3%; P 0,001) em 6 horas e 1,19 ± 0,05 (-54 ± 3%; P 0,001) no dia 1. No dia 6 captação havia retornado a um nível basal de 2,94 ± 0,23. Entre o grupo de tratamento e controlo da absorção era diferente em 6 horas (p 0,001) e no dia 1 (p 0,001). (Figura 3)

O tratamento com TP202377 não influenciou [18F] absorção FLT SUVmax em o modelo de tumor resistentes A2780 /Top216, no entanto, a absorção de SUVmax diminuiu de 1,50 ± 0,07 na linha de base para 1,36 ± 0,08 em 6 horas (-10 ± 3%, p = 0,02) no modelo de tumor SW620. Na captação grupo controle SW620 no dia 6 de 1,49 ± 0,04 foi menor em relação à linha de base captação 1,29 ± 0,07 (-14 ± 4%, P = 0,04). Não foram observadas diferenças entre os grupos de tratamento e controle tanto para o A2780 /Top216 ou tumores SW620 (Figura 3).

As correlações entre SUVmean ou SUVmax proporções desde o início até 6 horas e dia 1, respectivamente, e o volume do tumor alterações desde o início até ao dia 6 foram calculados. Para o TP202377 tratada A2780 e /tumores Top216 A2780 juntos, encontramos uma correlação positiva entre o crescimento do tumor e SUVmean 6 horas /basal (r

2 = 0,53; P 0,001), SUVmean Day1 /basal (r

2 = 0,65; P 0,001), SUVmax 6 horas /linha de base (r

2 = 0,51; P 0,001) e SUVmax Dia1 /linha de base (r

2 = 0,63; P 0,001) (Figura 5).

Ki67 e Gene Expression TK1

a árvore de genes de referência mais estáveis ​​foram encontrados para ser isomerase peptidilprolil a (PPIA), P0 ribossomal de proteínas (RPLP0) e vinculativa caixa de TATA proteína (TBP). O nível do Gois foi normalizada para a média geométrica destes três genes. Os níveis de expressão génica são as mencionadas em relação à linha de base. números integridade do RNA (RIN-valores) foram de 8,8 ± 0,9 (média ± SD) para todas as amostras.

a expressão do gene de Ki67 foi menor no grupo de tratamento comparado com o grupo de controlo em 6 horas (0,60 ± 0,02 vs. 1,00 ± 0,04; P 0,001) e no dia 1 (0,35 ± 0,03 vs 0,97 ± 0,05; P 0,001) após o início do tratamento no grupo de tumor A2780. No Dia 5, a expressão de Ki67 no grupo de tratamento era comparável ao do grupo de controlo. Em comparação com a expressão da linha de base, Ki67 foi diminuída em 6 horas (-40 ± 2%; p 0,001) e no dia 1 (-65 ± 3%; p 0,001) no grupo de tratamento A2780. A expressão de Ki67 não se alterou em qualquer um dos /Top216 SW620 e os grupos de tratamento A2780 ou qualquer dos grupos de controlo.

Expressão de TK1 foi mantido nos tumores A2780 em ambos o tratamento e o grupo de controlo. No entanto, nos tumores Top216 /A2780 observou-se um pequeno aumento na expressão TK1 no tratamento em comparação com o grupo de controlo em 6 horas (1,13 ± 0,06 vs. 0,93 ± 0,03; P = 0,04) após o início do tratamento (Figura 6). No dia 5 expressão de TK1 foi reduzida no grupo de controle do tumor SW620 relação ao valor basal (-27 ± 6%, P = 0,02).

Discussão

O presente estudo demonstrou diferenciação não-invasivo entre a resposta e não respondendo os tumores 6 horas após o início do tratamento com o fármaco anti-cancro TP202377 pelo uso de [18F] FLT PET. Seis horas após a injecção de TP202377 observou-se uma diminuição de -46% em valores SUVmean e -53% de redução nos valores SUVmax no tipo de tumor A2780-sensível TP202377. A diminuição da captação do traçador precedida regressões no volume do tumor no Dia 6. Não foram observadas mudanças na SUVmean após o tratamento dos dois modelos de tumor resistentes a TP202377. No entanto, no modelo de tumor SW620 TP202377 resistente observou-se uma pequena redução à temperatura de -10% 6 horas após a injecção de TP202377 quando medido como SUVmax. No Dia 1 SUVmax era comparável à avaliação basal nos tumores SW620. A razão que observamos esta pequena alteração na captação SUVmax às 6 horas poderia ser que este modelo de tumor não é absoluta resistente a TP202377 mas só tem sensibilidade muito baixa de drogas em comparação com A2780. No entanto, não há mudanças no volume do tumor no final da experiência foram observados apesar da pequena diminuição na SUVmax em 6 horas. Não houve diferença significativa em qualquer SUVmean SUVmax ou entre o grupo de tratamento e de controlo, 6 horas após o início do tratamento, de modo que ainda observada uma diferença entre os tumores que respondem e que não responderam a este ponto de tempo.

No Dia 6 [18F] absorção FLT no grupo de tratamento era comparável ao do grupo de controlo nos tumores A2780 sensíveis que indicam que os tumores começaram a voltar a proliferar. Avaliou-se a [18F] FLT resposta após uma dose única de TP202377 e, a fim de adquirir o efeito do tratamento a longo prazo da droga precisa de ser injectada por várias vezes. Potencialmente, a avaliação de um estado proliferativo tumores com [18F] FLT poderia ser utilizado para a determinação da janela de tempo óptimo entre duas injecções de medicamento.

As alterações em [18F] FLT em 6 horas e no dia 1 foram correlacionados com volume tumoral relação de linha de base /dia 6, a fim de examinar se, no nível tumor individual, foi possível prever a resposta do tumor. Houve uma boa correlação entre as alterações após 6 horas e Dia 1 em [18F] absorção de FLT tracer e as mudanças no volume do tumor no dia 6. Os tumores que diminuiu mais na captação do traçador imediatamente (6 horas e Dia 1) após o início do tratamento foram os tumores que mais tarde teve o menor aumento no volume do tumor. Por conseguinte, 6 horas após o início do tratamento, fomos capazes de apontar os tumores que responderam melhor ao tratamento. Durante o desenvolvimento de novos fármacos quimioterapêuticos, especialmente nas fases precoces clínicos, a identificação de responder tumores é de grande valor, a fim de prever o resultado do tratamento. A maioria dos novos tratamentos anti-câncer têm um efeito sobre alvos específicos em tumores e fazer na maioria dos casos tem efeito apenas em subgrupos de pacientes. Uma identificação dos doentes que responderam com [18F] FLT PET precoce após o início do tratamento pode reduzir o custo de desenvolvimento de drogas e evitar o tratamento desnecessário em pacientes em que a terapia não funcionar como o tratamento pode ser interrompido nos pacientes que não responderam. Além disso, [18F] FLT PET permitiria a utilização de fármacos potentes, que só são eficazes em alguns pacientes, se combinado com monitorização da resposta de imagem.

O nível de expressão de Ki67 e o gene TK1 foi medida num estudo paralelo. Expressão de Ki67 em paralelo a absorção de [18F] FLT, que confirmou os resultados de PET, indicando que a diminuição da captação do traçador foi devido a uma verdadeira mudança fisiológica e não uma consequência de, por exemplo, diminuiu a entrega de [18F] FLT. Não foram observadas mudanças na expressão gênica TK1. Em um estudo anterior, em que foi analisada [18F] absorção de FLT após o tratamento com o TP202377 analógico Top216, desvio entre [18F] absorção de FLT e TK1 expressão foi observada, bem [22]. Parece que o tratamento com estes medicamentos, apesar de induzir uma diminuição significativa na [18F] absorção de FLT, não regula a expressão de genes TK1 e mais estudos são necessários a fim de saber mais sobre a influência da TK1 no [18F] absorção de FLT após o tratamento com TP202377. Outros estudos também não foram encontradas quaisquer alterações nos níveis de mRNA de TK1 apesar de uma mudança no [18] captação FLT tracer [2], ou apenas observado uma correlação semana entre o [18F] FLT e TK1 mRNA [28]. Apesar TK1 é ser fator central na captação de [18F] FLT estes dois não são sempre fortemente ligado [29], e alterações na [18F] absorção de FLT poderia ser devido a mudanças nos níveis de proteína e de atividade ou alterações nos níveis ATP [5 ], [12], [30], [31].

Uma das linhas de células resistentes à TP202377 utilizados neste estudo foi derivada da linha celular A2780 TP202377-sensível. A linha celular SW620 foi encontrado anteriormente para ser naturalmente resistentes a TP202377. Utilizou-se tanto um induzida resistente e uma linha celular resistente naturalmente, a fim de analisar se haveria qualquer diferença no [18F] FLT resposta ao tratamento entre as duas linhas celulares. Curiosamente, a [18F] absorção FLT em cada uma das linhas de células resistentes à TP202377 foi inferior em comparação com a linha de células A2780 TP202377-sensível. No entanto, a absorção de [18F] FLT estava em ambas as linhas celulares acima dos níveis de fundo. Baixa absorção de [18F] FLT em SW620 também foi relatado por outros [32].

Em muitos estudos, o efeito de muitos tipos diferentes de quimioterapia na captação de [18F] FLT foi estudado [1] – [10]. No entanto, poucos estudos têm testado ambos os tumores sensíveis e resistentes. Um estudo analisou [18F] absorção de FLT, tanto um sensível cetuximab e uma linha celular resistente ao cetuximab a seguir ao tratamento com cetuximab; No entanto, não há alterações na absorção de FLT foram observadas em ambas as linhas de células [20]. Outro estudo não encontrou nenhum efeito discernível do tratamento trastuzumab na captação tumoral de [18F] FLT em uma coorte de ambos responderam e não responderam tumores [21].

Em conclusão, verificou-se uma diminuição de -53% no [ ,,,0],18F] absorção de FLT SUVmax 6 horas após o início do tratamento no modelo de tumor A2780 TP202377-sensível. Nos modelos de tumor TP202377 resistente não vimos quaisquer alterações relevantes clínicos em [18F] absorção de FLT após o tratamento. inibição do crescimento do tumor após o tratamento TP202377 foi observado no modelo de tumor A2780 responder mas não os dois modelos de tumor que não responderam. Este estudo demonstrou que as diferenças de [18F] absorção FLT 6 horas após o início do tratamento com um novo composto anti-tumoral podia separar responder de tumores não responder antes de se observou qualquer regressão do tamanho do tumor. Acreditamos que este conceito realizar grandes promessas, tanto para o desenvolvimento de medicamentos e terapia de câncer de alfaiataria.