Abstract
Apesar de segmentação de células cancerígenas usando nanocarriers-entrega de drogas é uma promessa para melhorar a especificidade agente terapêutico, a estratégia de maximizar a afinidade do ligando para os receptores sobre-expressos em células cancerosas é sub-óptima. Para determinar os princípios de design que maximizem a especificidade nanocarrier para as células cancerosas, estudamos um modelo teórico baseado no cinética generalizadas de nanocarriers com um ou mais ligantes que se ligam especificamente desses receptores sobre-expressos. Mostramos que a cinética inerentes ao sistema de jogar um papel importante na determinação da especificidade e pode, de facto, ser explorado para atingir ordens de magnitude melhoria na especificidade. Em contraste com a actual tendência da concepção terapêutica, mostra-se que estes aumentos de especificidade pode geralmente ser conseguido por uma combinação de baixas taxas de endocitose e nanocarriers com vários ligandos de baixa afinidade. Estes resultados são muito robusta através de mecanismos de endocitose e protocolos de distribuição de medicamentos, sugerindo a necessidade de uma mudança de paradigma na concepção de entrega de droga alvo-receptor
Citation:. Tsekouras K, Goncharenko I, Colvin ME, Huang KC, Gopinathan a (2013) projeto de alta especificidade nanocarriers explorando Efeitos não-equilíbrio na Cancer Cell segmentação. PLoS ONE 8 (6): e65623. doi: 10.1371 /journal.pone.0065623
editor: Bing Xu, Brandeis University, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de janeiro de 2013; Aceito: 25 de abril de 2013; Publicação: 26 de junho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Tsekouras et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores reconhecer o apoio da National Science Foundation subvenção EF-1.038.697. AG também reconhece o apoio de um Award James S. McDonnell Foundation, da Universidade da Califórnia Instituto para o México e os Estados Unidos (UC MEXUS) concessão, e um George E. Brown, Jr. Award. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Os danos colaterais aos tecidos saudáveis causadas pela ação do agente terapêutico continua a ser um grande problema para a terapia do cancro, limitando a eficácia do tratamento e aplicabilidade, e, finalmente, comprometer a sobrevida do paciente. A especificidade pode ser aumentada por meio de nanocarriers contendo o agente terapêutico equipados com ligandos que se ligam a receptores sobre-expressos em células de cancro selectivamente [1] – [3]. Embora esta abordagem tem a promessa, com um número de fármacos no mercado [4] e a investigação em curso concentrando-se em conjugados nanocarrier-ligando e na identificação de receptores viáveis [5] – [8], a ocorrência de efeitos colaterais nos pacientes restos tratados com nanocarrier um factor limitativo. O desenho racional de nanocarriers polivalentes para a especificidade ideal, portanto, apresenta um desafio intrigante e importante
Vários estudos teóricos e experimentais recentes [9] – [15]. Ter sido motivada pela relevância do ligando-receptor multivalente de ligação para ambos nanocarrier concepção e os processos biológicos, tais como a função do sistema imunitário. No contexto de direccionamento celular de cancro de alta especificidade, foi demonstrado que nanocarriers multivalentes equipados com ligandos de baixa afinidade pode alcançar uma cobertura muito mais elevado nas células com densidades mais elevadas do receptor modestamente em condições de equilíbrio [3], [16]. No entanto, é o número de nanocarriers internalizadas que é consequência de terapêutica e não apenas o número em contacto com a superfície da célula sob condições idealizadas de equilíbrio. A expectativa, em seguida, que a especificidade será regido pelas diferentes escalas de tempo associadas com a ligação endocitose, ligando-receptor /unbinding, eo método de entrega da droga. Mesmo quando se considera resposta linear simples próximo do equilíbrio, verificou-se que a magnitude da taxa de endocitose define a especificidade máxima [3], que aponta para a importância crítica da cinética. Na verdade, descobrimos que tanto a magnitude da taxa de endocitose e sua dependência funcional no número de ligandos ligados, que é regida pelo mecanismo molecular de endocitose, ter repercussões importantes para a especificidade.
Além disso, o equilíbrio estudos baseados não pode atender a diferentes protocolos de entrega de drogas, uma vez que estas criam as disponibilidades nanocarrier dependentes do tempo e, assim, evitar a existência de um estado estacionário. Em qualquer caso, um estado estável é virtualmente impossível de alcançar
in vivo
, onde os ciclos naturais biológicos, mecanismos de homeostase, e os aspectos práticos da regulamentação de drogas de administração, tudo conspira contra ele. Vamos explorar estas questões com uma abordagem que examinam os
cinética
de complexos nanocarrier ligando de ligação a células saudáveis e cancerosas de modo a identificar as estratégias de design de drogas que maximizam a segmentação especificidade. Mostramos que existem picos na especificidade, como uma função de ambos afinidade e o número de ligandos, o que implica a existência de modelos ideais nanocarrier com um grande número de ligandos de ligação muito fracamente individuais com constantes de dissociação de ligando-receptor no intervalo de mM. Demonstramos ainda que a especificidade pode ser aumentada em ordens de grandeza, explorando a cinética do sistema, através de direccionamento de receptores que se lentamente endocitadas apenas em grupos e /ou por um ajuste judiciosa da dependência do tempo da libertação do fármaco. Notavelmente, a região de design ideal do espaço de parâmetro mostra pouca variação mesmo entre significativamente diferentes protocolos de entrega de drogas e mecanismos de endocitose, apontando para a existência de princípios de design robusto.
Métodos
Nós construímos um mínimo modelo cinético para a endocitose de nanocarriers equipados com
N
ligandos (Fig. 1). Ligantes ligam de forma independente para e desvincular a partir de receptores individuais com taxas, para as células saudáveis e, para as células cancerosas, onde está o fator pelo qual as células cancerosas superexpressam receptores. Os valores destas taxas dependem de uma variedade de factores tais como o tamanho nanocarrier e ligando /receptor tipo, e pode ser relacionada com constantes de cinética química padrão observando que e, onde é a concentração do receptor eficaz na vizinhança de um único ligando (Ficheiro S1) e presume-se que existe um grande excesso de receptores móveis. Por conseguinte, quando é a constante de dissociação e a constante de afinidade de ligando-receptor. A independência da ligação, enquanto que assumiu para a simplicidade ligando, é uma boa aproximação para muitas interações supramoleculares polivalentes [17]. Nanocarriers entrar no sistema com uma taxa de entrada, determinada pela
de libertação de fármaco
protocolo, que é o método pelo qual o tratamento é administrado e a cinética de primeira ligação dos nanotransportadores à superfície da célula. Foram examinados três casos: (i) o estado de equilíbrio proveniente de uma fonte constante de nanotransportadores, (ii) o resultado de uma dose única, de alta concentração, e (iii) A entrega pretargeted em que um complexo de ligando é introduzido primeiro (a) e, em seguida, seguidos mais tarde pela terapêutica activa (a), que docas com nanocarriers restantes no sistema. Para este último protocolo, medimos especificidade para um dado
tempo de recolha de janela
, onde é definida por escalas de tempo fisiológicas e corresponde ao tempo para além do qual a endocitose de complexos terapêutico-nanocarrier activados é negligenciável. Depois de anexar a uma célula, nanocarriers são removidos do sistema se todos os ligantes desvincular (não consideramos nanocarrier “reciclagem”) ou se eles sofrem endocitose. Endocitose ocorre com uma taxa, cujo dependência em relação ao número de ligandos ligados chamamos o
endocitose perfil
.
(A) nanocarrier (ouro) com dois dos quatro ligantes ligados nos receptores (verde) . (B) mapeamento para um passeio aleatório 1D com perfis constantes, sigmoidal, e lineares ditando taxas de endocitose em cada estado de ligação do ligando.
Cada nanocarrier pode, então, ser representado por um 1D aleatória walker na discreta intervalo entre uma barreira de absorção a 0 e uma barreira que reflecte a
N
, com uma taxa de perda de partículas em cada local (Fig. 1B). Em tempo, um andador na posição
n
representa um nanocarrier com
n
ligandos ligados. Denotando a probabilidade de que uma nanocarrier possui
n
ligandos ligados em tempo de
t
como, nós derivada equação mestre para um nanocarrier ligado a uma célula saudável:
for, (1 ) para, (2) para, (3) para uma nanocarrier ligado a uma célula de cancro, em Eqs. 1-3 é simplesmente substituído por.
Este sistema de equações mestre pode ser reformulada como a equação vetorial (4) onde o componente de é e os elementos da matriz são ditadas pelos coeficientes apropriados nas equações mestras . Eq. 4 pode então ser resolvida numericamente, com condições iniciais, para determinar os autovetores e autovalores para várias combinações de perfis endocitose, protocolos de entrega de drogas, e os valores de,, e (para entrega de drogas pretargeted) janelas de tempo de coleta. Para cada combinação de protocolo de entrega de droga e perfil endocitose determinou-se a especificidade,, onde e são os números dos nanocarriers endocytosed por câncer e as células saudáveis, respectivamente. e pode ser computado como a integral sobre a janela de tempo relevante da taxa líquida de internalização de drogas,. O factor na equação para normaliza para o aumento do número de receptores na célula cancerosa. Além de determinar as soluções numéricas completas para todas as combinações, que validou todos os resultados com simulações de Monte Carlo usando o algoritmo Gillespie. Além disso, obtivemos uma solução analítica para a combinação de um perfil endocitose constante no estado estacionário no limite que concorda com os nossos resultados numéricos (S1 arquivo).
Resultados
picos especificidade para números elevados ligantes de fracamente ligados
para investigar o papel dos efeitos cinéticos sobre a especificidade, primeiro analisou o impacto de diferentes perfis de endocitose para um protocolo de entrega de droga no estado estacionário fixo. Estamos interessados em saber como a especificidade depende do seguinte subconjunto de parâmetros de projeto nanocarrier: o número ligando e a constante de afinidade ligando-receptor. FIG. 2A mostra a especificidade para um perfil constante endocitose, onde. Existe uma gama bem definida de parâmetros de projecto óptima, onde a especificidade é substancialmente mais elevada do que o ambiente. Localmente as melhores soluções aparecem em uma curva contínua desde pequenos picos a para a grande () para grandes picos em grande para.
(A-C) mapas de superfície de especificidade no âmbito do protocolo de entrega de droga no estado estacionário com constante (A), linear (B), e endocitose sigmoidal com (C). (D) especificidade máxima sob entrega da droga em estado estacionário e endocitose sigmoidal para vários valores de limite. Em todos os casos, o número total de ligantes é, e.
Em geral, para valores razoáveis de e (Tabela 1), descobrimos que os picos de especificidade globalmente para um elevado número de ligantes e uma dissociação taxa da ordem dos mM (Fig. 2A). Isto pode ser compreendido em termos dos valores relativos do único ligando ligado e desligado taxas. Se, nanocarriers irá ligar-se a ambas as células saudáveis e cancerosas, enquanto que, se nanocarriers irá vincular a nenhum tipo de célula; tanto efeitos reduzem especificidade. Se, nanocarriers sobre células saudáveis permanecem mais propensos a desvincular do que para ligar a um ligando; No entanto, se está perto de tal forma que, em seguida, nanocarriers em células cancerígenas será mais provável para ligar do que para desvincular um ligando. Assim, neste regime, o ligando de ligação para selecciona nanocarriers ligado às células cancerosas, e os aumentos desejados polarização que esta população pré-seleccionado alimentado para a próxima reacção de ligação ao ligando. Portanto, no nanocarriers média, gastam mais tempo ligado às células cancerosas em comparação com as células saudáveis e, portanto, têm uma maior probabilidade de serem endocitado. Por muito grande, nanocarriers fortemente preferem se ligar ao invés de desvincular um ligando independentemente de eles são obrigados a células saudáveis ou cancerosas, dando uma probabilidade muito alta de que um nanocarrier é de maneira inespecífica endocitado. Esta probabilidade aumenta com o número de ligandos, que conduzem à diminuição especificidade e tendendo a 1 (o limite inferior) no limite grande. A especificidade na é idêntica unidade, de modo aumenta, a máxima tende a abordagem, com a singularidade de definir o melhor em como vai para o infinito, um resultado que é confirmado pelos nossos analytics (S1 arquivo).
próxima considerados os efeitos de alterar a forma funcional do perfil de endocitose. As Figs. 2B e C mostram as especificidades para o perfil linear endocitose (5) e o perfil endocitose sigmoidal (6) onde é a função de passo Heaviside e é o valor limite de, respectivamente. A localização do ótimo global não é significativamente afetado pelas alterações no perfil endocitose. No estado de equilíbrio, os valores de especificidade são semelhantes para linear e constante endocitose, o último dos quais modelos o cenário em que cada evento de ligação ligando-receptor desencadeia uma cascata de sinalização independente, que tem uma probabilidade finita de provocar endocitose. Em contraste, para a endocitose sigmoidal, a magnitude da especificidade óptima é consideravelmente melhorada. Para este endocitose cooperativa requerendo vários eventos de ligação [18], a especificidade é tão reforçada porque a endocitose ocorre apenas com nanocarriers em estados de ligação ao ligando cuja abundância relativa exibir os efeitos cumulativos de seleção a cada passo. Para um número total de ligandos fixo, Fig. 2D demonstra que a especificidade aumenta acentuadamente por ordens de grandeza que o valor do limiar,, necessária para provocar aumentos de endocitose. Este efeito é uma consequência directa de a especificidade, dependendo das cinéticas da ligação, unbinding, e endocitose. Estes resultados indicam que os receptores de segmentação que estão endocytosed de forma cooperativa pode produzir melhorias significativas na especificidade.
A seguir, examinou o impacto de diferentes protocolos de entrega de drogas para um perfil endocitose constante fixa, mais uma vez se concentrar em como a especificidade depende dos parâmetros de projecto nanocarrier. As Figs. 3A, B e C mostram a especificidade como uma função de e para o estado estacionário, de dose única, e protocolos de distribuição de medicamentos pretargeted, respectivamente. Notavelmente, tal como na Fig. 2, observou-se um conjunto robusto de soluções localmente ótimas aparecendo em uma curva contínua que vão desde para a grande para. O facto de este regime ideal parece estar conservada entre diferentes protocolos sugere que projetos de drogas genericamente ideais, independente do protocolo de administração, são possíveis. Para o protocolo de entrega de droga pretargeted para as mesmas condições, pode-se também conseguir muito grandes especificidades simplesmente através de uma escolha adequada de janela de tempo de recolha: muda em pelo factor pode resultar em ordens de magnitude na especificidade (Fig 3D.). Deve também notar-se que a especificidade é muito mais sensível e apenas fracamente dependente.
(A-C) A especificidade para um perfil constante sob a endocitose de estado estacionário (A), de dose única (B), e protocolos de distribuição de medicamentos pretargeted (C). Para o protocolo de entrega de droga pretargeted, janela de tempo da coleção é de 200 a 300 segundos. (D) especificidade máxima no âmbito do protocolo de entrega de droga pretargeted e endocitose constante para vários valores de. Em todos os casos e.
realce multiplicativo na especificidade com a combinação ideal de protocolo de entrega de droga e perfil endocitose
Nossos resultados indicam que a especificidade pode ser significativamente melhorado por meio do ajuste de forma independente a droga protocolo de entrega e o perfil endocitose através da escolha do tipo de receptor alvo. Isto sugere que as combinações judiciosas de protocolo de entrega de droga e perfil endocitose juntamente com parâmetros de projeto apropriadas poderia produzir novos aumentos dos especificidade. Na Fig. 4A, que demonstram esta melhoria no caso de administração de fármaco e pretargeted endocitose sigmoidal, para a qual descobrimos uma especificidade máxima até vezes o valor da selectividade esperado a partir do factor de sobre-expressão sozinho e mais de 300 vezes a especificidade para a combinação de steady entrega estado e endocitose constante, o que é o mais próximo de imitar as condições de equilíbrio. O efeito parece ser multiplicativo, com apenas modesta () aumenta esperado devido a endocitose cooperativa (Fig. 2D) ou a entrega pretargeted (Fig. 3D) sozinho.
(A) A combinação de protocolo de entrega de droga pretargeted e endocitose sigmoidal apresenta a maior especificidade de todas as combinações examinados. ,, Limite no. (B) especificidade máxima em todas as combinações. ,, Para a endocitose sigmoidal, e 200-300 seg para o protocolo de entrega de droga pretargeted. As linhas a cheio correspondem a e. (C) Efeitos do fator de sobre-expressão da especificidade através de protocolos de distribuição de medicamentos para o perfil de endocitose constante em,. A especificidade sobe visivelmente. (D) Efeitos da taxa de endocitose (normalizada por) através de protocolos de distribuição de medicamentos para o perfil de endocitose constante a,,.
Enquanto a região ideal era amplamente consistente através de protocolos ou perfis endocitose quando um ou outro foi fixado, queríamos saber se esta permaneceu verdadeiro para combinações arbitrárias. FIG. 4B representa as especificidades máximos para todas as combinações de protocolo de entrega de droga e perfil de endocitose. Há um agrupamento clara das soluções ideais para todas as combinações ao longo de uma região que vão desde a grande a grande para baixa. Enquanto nós explicou o ótimo em geral, o ótimo global para a baixa é de grande interesse. Como discutido acima, este regime deve correspondem aproximadamente a situação quando um nanocarrier ligado com um ligante a uma célula cancerosa é marginalmente mais provável de se ligar outro ligando. Isto significa ou. Com a assíntota em geral estar, chega-se a regra heurística, onde é uma constante que depende de, e. FIG. 4B mostra duas dessas curvas com diferentes valores de para comparação.
Uma vez que as soluções de design ideais e as especificidades correspondentes dependem e, mostramos essas dependências nas figuras. 4C e D através de protocolos de entrega de drogas para um perfil endocitose constante fixa. A especificidade aumenta acentuadamente para um valor que é protocolos em todo mais ou menos constante. Uma vez que este valor é definido pelos parâmetros de design e escolha de receptor (consulte S1 Arquivo para mais detalhes), uma outra estratégia para alcançar alta especificidade é escolher um receptor para que o seu factor de sobre-expressão típica é apenas acima deste valor. Isso garante que todas as células cancerosas com são alvo com alta especificidade. Na verdade, este também foi identificada como um mecanismo para a super-selectividade em estudos de equilíbrio [16]. Os efeitos cinéticos do protocolo de entrega de droga afectar significativamente a selectividade real perto, com o protocolo pretargeted possuindo a maior especificidade reforço. Finalmente, observou-se que a especificidade em geral, diminui com o aumento da taxa de endocitose (Fig. 4D), indicando que os receptores que estão a ser reciclados de forma mais lenta são potencialmente melhores alvos. Esta dependência particular também pode surgir em um contexto muito diferente: a criação acelerada de gradientes de morfogénios na presença de degradação, que podem ser descritos por equações semelhantes [19]
Discussão
Em conclusão. , mostrámos que os picos de especificidade ocorrer como uma função tanto a afinidade e o número de ligandos, o que implica a existência de modelos ideais nanocarrier. Em geral, os complexos de ligando individuais no intervalo de mM () e um grande número de ligandos por portadora tem características de design que produzem alta especificidade em nossas simulações. Esta região ideal do espaço de parâmetros de design é robusto através de protocolos de entrega de drogas e mecanismos de endocitose. A precisão magnitude especificidade de pico e nitidez pode ser personalizado através da selecção cuidadosa dos parâmetros ou estratégias de administração. Possíveis estratégias para aumentar a especificidade incluem receptores de segmentação que desencadeiam a endocitose apenas se ligado em grupos e /ou ter uma baixa taxa de endocitose em geral, e utilizando entrega de drogas pretargeted com longos tempos de espera.
Deve notar-se que o aumento da especificidade vem no custo de ter um número total mais baixo de nanocarriers endocitose. Enquanto assumiu-se que a dosagem pode ser aumentada, se necessário, na prática clínica, pode haver outros factores, tais como a capacidade do rim para limpar o medicamento a partir do corpo que podem limitar a capacidade de maximizar a especificidade. A fim de abordar os princípios gerais de design e estratégias, nós também preferiu ignorar uma série de outras características específicas do sistema, incluindo a possibilidade de que é dependente do tempo, as interações entre ligantes, e os detalhes da geometria complexa nanocarrier (ver S1 arquivo para detalhes).
No geral, nosso trabalho complementa os estudos de equilíbrio, como [16], demonstrando que é possível projetar complexos especificidade muito elevada para condições de não equilíbrio. Uma vantagem específica da nossa abordagem do uso de baixa afinidade nanocarriers multivalentes é que ela reduz a necessidade de ligandos de elevada especificidade, que são geralmente de peso molecular elevado (tais como fragmentos de anticorpo) e podem conduzir a medicamentos que têm fraca biodisponibil idade [20] . É de notar que o nosso trabalho não é focado em um único sistema biológico mas sim aborda toda uma classe de problemas biológicos, químicos e de bioengenharia. Ao se concentrar em apenas quantidades físicas e não a substância química específica, biológicas e características clínicas de cada sistema possível, temos derivado princípios de design amplos, gerais e abrangentes. Os nossos resultados podem, por conseguinte, potencialmente, ser aplicado a processos que Trade off alguns locais de reconhecimento altamente específico contra um maior número de sítios menos específicas; Por exemplo, para criar uma coluna de produtos químicos para optimamente separadas ou conceber sequências de DNA com um número de sobre-representados certos motivos. É também interessante notar que as reacções de ligação sucessiva ligando-receptor configurar um processo de etapa de reacção múltipla semelhante à revisão cinética [21], que aumenta consideravelmente o relativamente baixo viés em direção vinculativo sobre as células cancerosas. Assim, como o número de passos aumenta, a especificidade pode tornar-se muito alta. No entanto, ao contrário de revisão cinética, a energia não é dispendido para viés cada passo da reacção, com o custo resultante sendo a redução global de probabilidade nanocarrier endocitose. Finalmente, dada a onipresença das interações de baixa afinidade polivalentes e do meio ambiente inerentemente não-equilíbrio em biologia, é possível que a natureza já explora o mecanismo que temos discutido para obter melhorias significativas na especificidade ao longo dos limites ditados pelo equilíbrio.
Informações de Apoio
arquivo S1.
contém informações de suporte em suposições em nosso modelo sobre a disponibilidade do receptor e interdependência ligando, dependências de taxa, as definições de e, e uma solução analítica das equações mestras e determinação da especificidade para o caso de estado estacionário com perfil endocitose constante. Figura S1, plot de superfície de especificidade como uma função de, e mostrando uma nervura estendendo-se para valores grandes de (fora da página). Para fixa e grande, a especificidade como uma função de tem um pico a. Aqui, e. Figura S2, valor Crossover do fator de sobre-expressão como uma função de afinidade, e o número de ligantes, (inserção). para ambas as parcelas, para a trama principal e para a inserção. Em geral, tende a seguir qualitativamente o comportamento da especificidade para os mesmos valores dos parâmetros
doi:. 10.1371 /journal.pone.0065623.s001
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