Abstract

Os papéis biológicos do receptor de estrogênio 1 (

ERS1

), receptor de estrogénio 2 (

ERS2

) e aromatase (

CYP19A1

) genes no desenvolvimento do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) não é clara, assim como o uso de sua expressão como fator prognóstico. O objetivo deste estudo foi investigar o valor prognóstico dos receptores de estrogênio e expressão de mRNA aromatase, juntamente com a concentração de proteína aromatase, em pacientes com NSCLC ressecados. amostras de tecido do pulmão do tumor e não de tumor foram analisadas quanto à expressão de ARNm de

ERS1

,

ERS2

e

CYP19A1

por RT-PCR. concentração da aromatase foi medido com um ensaio ELISA. Um total de 96 pacientes foram incluídos.

ERS1

expressão foi significativamente mais elevada em tecido não-tumoral do que em amostras de tumor. Duas categorias de expressão gênica foram criados para cada gene (e proteínas): alta e baixa.

ERS1 categoria de alto

mostraram aumento da sobrevivência global (OS), quando comparado à categoria baixa expressão. concentração de proteína da aromatase foi significativamente superior nas amostras de tumor. Superior

expressão ERS1

em tecidos tumorais foi relacionada com a sobrevivência global mais longa. A análise de combinações de expressão gênica fornece evidência para mais OS quando ambos

ERS1

e

ERS2

são altamente expressos.

ESR1

, sozinho ou em combinação com

ERS2

ou

CYP19A

1, é o fator prognóstico mais determinação dentro dos analisados ​​3 genes. Parece que

ERS1

pode desempenhar um papel em NSCLC prognóstico, por si só ou em combinação com outros genes, tais como o

ERS2

ou

Cyp19a1

.

ERS2

em combinação com concentração de aromatase poderia ter uma função semelhante

Citation:. Aresti U, Carrera S, Iruarrizaga E, Fuente N, Marrodan I, de Lobera AR, et al. (2014) Receptor de Estrógeno 1 Gene Expression e sua combinação com receptor de estrogênio 2 ou aromatase Expressão prediz sobrevida em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (10): e109659. doi: 10.1371 /journal.pone.0109659

Edição: Harriet Wikman, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Alemanha |

Recebido: 08 de abril de 2014; Aceito: 02 de setembro de 2014; Publicação: 13 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Aresti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que, por razões aprovadas, algumas restrições de acesso aplicam-se aos dados subjacentes às conclusões. deposição pública do conjunto de dados violaria o cumprimento ético, como o conjunto de dados contém informações de identificação humana. Um conjunto identificou-de dados está disponível mediante pedido e os pedidos podem ser enviados para López-Vivanco em [email protected]

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa (PROYECT BIO07 /CA /012 ) do Basque Broadcasting Corporation (EITB; www.eitb.com) Cancer Marathon. Financiamento para pagar as Abertas custos de publicação de acesso para este artigo foi fornecido pelo Instituto de Salud Carlos III do Ministério da Economia espanhol e Competitividade (concessão: RD06 /0020/0067, ISCIII). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

com base nas estatísticas dos EUA como um exemplo da evolução do câncer de pulmão nos países desenvolvidos, é claro que a prevenção e cura deste tipo particular de cancro precisa melhorar. As projeções para 2014 são 159,260 mortes devido ao cancro do pulmão (27,2% de todas as mortes por câncer), enquanto esse tipo de câncer provoca mais mortes do que a soma dos três tipos de câncer mais comuns próxima (cólon, mama e próstata) [1]. Além disso, a evolução das taxas de cancro do pulmão sobrevivência de cinco anos, estimada em cerca de 12%, 13% e 16% nos períodos 1975-1977, 1987-89 e 2001-2007, respectivamente [2], foi claramente insatisfatório.

os estrogénios estão envolvidos no desenvolvimento de vários tipos de cancro da mama:, endométrio, ovário, tiróide, pulmão e [3] – [8]. No pulmão, estrogénios induzir a proliferação celular através da activação de determinados genes do factor de crescimento tais como o factor de crescimento epidérmico e factor de crescimento semelhante a insulina, mediadores da mitogénese em tumores pulmonares [9]. Exercem a sua função através de dois diferentes receptores específicos de estrogênio, receptor de estrogênio alfa (ERa) e estrogênio receptor-β (RpE), membros da superfamília de receptores nucleares de factores de transcrição [10], e através de duas vias diferentes, genômica e não genómico, com os mesmos efeitos biológicos: a proliferação, crescimento, apoptose, diferenciação e angiogénese.

ERS1

e

ERS2

genes são expressos na maior parte dos cancros mais comuns, do pulmão, da mama, digestivo e endócrino, mas o seu papel pode variar muito, dependendo do tipo de tumor [10] – [ ,,,0],16].

Produção de estrogénios os dois mais abundantes e importantes (estradiol e estrona) é catalisada por 19a1 citocromo P450 (aromatase), o produto de

gene CYP19A1, que é activa no pulmão tecidos. Além disso, há um circuito de realimentação, porque estrogénios induzir a activação do factor de crescimento epidérmico que leva a um aumento na expressão e actividade de [17] da aromatase, por sua vez, aumentar a produção de estrogénio. Claramente, esses fatos indicam que aromatase desempenha um papel notável no desenvolvimento do câncer, e foi levantada a hipótese de que a sua expressão elevada indica um pior prognóstico [18].

Este trabalho tenta confirmar (ou rejeitar) se algum dos essas expressões genes é útil como ferramenta de prognóstico e para esclarecer a divergência entre estudos anteriores baseados principalmente em imuno-histoquímica (IHQ) métodos [6], [12], [19], e outros mais recentes que utilizaram em tempo real técnica de PCR para determinar gene expressão [20], [21]. Nesse sentido serão criados grupos de diferentes níveis de expressão e relacionado com a sobrevivência.

Materiais e Métodos

Declaração 1.-Ética

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa clínica do Hospital Universitário de Cruces (CEIC /Hospital de Cruces) e foi realizada de acordo com a declaração de Helsinki. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes após a plena explicação da finalidade e natureza de todos os procedimentos utilizados.

2.-Os pacientes

Entre 110 pacientes recrutados, apenas 96 pacientes preencheram os critérios de seleção. Para ser pacientes incluídos devem ser diagnosticados com NSCLC e cirurgia de ressecção foram submetidos; pacientes que recebem quimioterapia neoadjuvante e pacientes cujo tumor primário não foi localizado no pulmão foram excluídos. As suas características clínicas são descritas na Tabela 1. Para cada participante, tumor e amostras de tecido fresco não tumorais foram preparados por anatomopatologista. As amostras foram obtidas por meio de dissecção macro e tecido não tumoral correspondeu tecidos pulmonares normais adjacentes.

3.-Techniques

3.1-TEMPO REAL RT-PCR.

O ARN total a partir de tecido tumoral e não tumoral foi extraída com RNeasy Mini Kit Além disso (Qiagen). Um passo em tempo real RT-PCR foram realizadas utilizando um Platinum RT-PCR quantitativo Thermoscript System One-Step e 7900HT rápido Real-Time PCR System (ambos da Life Technologies). receptores de estrogênio e ensaios de expressão de aromatase, bem como RPLPO (controle endógeno) foram adquiridos da Life Technologies:

ERS1

/Hs00174860_m1,

ERS2

/Hs00230957_m1,

CYP19A1

/Hs00903411_m1 e RPLPO /NM_053275.3. Cada ensaio amplifica um número de diferentes transcritos. Informação detalhada sobre o comprimento do transcrito, comprimento proteína associada, sonda de exão-exão limite, a amplificação do amplicon e funcionalidade proteína está incluído no ficheiro S1.

O ARN total foi adicionado para obter uma concentração de 100 mg /mL num volume final de 10 ul de reacção. Utilizou-se um perfil de tempo /temperatura padrão. Um controlo positivo foi incluído em cada placa: As amostras de RNA extraídas a partir de células MCF-7 (HTB22), comprado (Novembro de 2009) a partir de ATCC. HTB22 foi escolhido como um (calibrador) de uma amostra de referência para a quantização comparativa (pelo método Delta Cq). a expressão do gene é relatado como valores RQ obtidos a partir de quantificação comparativa, em que RQ = Normalizada Quantidade Relativa = 2

-.. (ΔΔ Cq)

3.2-ELISA

ensaio imunoenzimático Enzyme-linked kits para aromatase humana (ARO) (USCN Life Science Inc.) foram utilizados para a detecção de proteína da aromatase. A proteína foi extractada a partir de amostras tumorais e não tumorais, seguindo este protocolo do kit. Para este procedimento, os tecidos estavam disponíveis a partir de 85 pacientes. A concentração de proteína foi medida num leitor de microplacas da estrela polar (BMG Labtech) usando o método de ácido bicinconínico proteína. Os dados foram analisados ​​usando

Quatro Parâmetro Logístico Fit

, desenvolvido pela MyAssays, Soluções de análise de software.

4-estatística A análise

Para a análise estatística SPSS /v.17, Graphpad foram selecionados -Prism /v.3 e MedCalc /12.7.5 pacotes de software. Em resumo, estes foram usados ​​para o cálculo de estatísticas descritivas, e para a realização de: testes de Kolmogorov-Smirnov para normalidade, testes não paramétricos (Mann-Whitney, Kruskal Wallis) na comparação entre medianas, correlação, sobrevivência e análise de regressão de Cox. Todos os testes foram bicaudais eo nível de significância foi de 0,05. Para análise de sobrevivência, as curvas de Kaplan-Meier foram construídas e a significância foi avaliada pelo teste de Log Rank (Mantel-Cox). Para avaliar a influência de variáveis ​​sobre a sobrevida global, foi realizada análise de regressão de Cox. Em primeiro lugar, as comparações aos pares foram feitas e quaisquer variáveis ​​com uma significância inferior a 0,2 foram mantidas numa segunda análise geral. Em seguida, eles foram eliminados, um-por-um, o significado se excedeu o limite de 0,05. A análise foi repetida após a remoção de cada variável. A sobrevida global (OS) foi calculado a partir da data da cirurgia /ressecção à data do último follow-up ou morte, em meses.

Resultados

1-

ERS1

A primeira comparação, entre os não-tumoral e tecido tumoral

ERS1

níveis obtido um p 0,0001, considerado extremamente significativo. As estatísticas de resultados de comparação RQ são mostrados na Tabela 2. Como pode ser visto,

ERS1

expressão do gene foi significativamente inferior em tumor do que os tecidos não tumorais.

Para a análise da relação entre a sobrevivência e

ERS1

expressão do gene, as amostras foram divididas em dois grupos, de acordo com os níveis de expressão mediana (baixa para valores inferiores média, alta para os valores mais elevados do que os valores médios de Kaplan-Meier curvas de sobrevida foram calculadas para ambos , revelando diferenças significativas dentro das amostras tumorais;. Log Rank = 0,050, figura 1a Para os tecidos tumorais, a sobrevida mediana foi de 28,0 meses no

ERS1

grupo menor expressão, e 34,0 meses no maior

ERS1

grupo expressão (Tabela 3), um teste de Mann-Whitney mostrou que isso seja uma diferença significativa, p = 0,042, apontando para uma relação entre a

ERS1

maior expressão de genes no tecido tumoral e sobrevida do paciente .

A amostra do doente é dividida em alta e Baixa (expressão inferior e superior em média). Painéis:. A)

ERS1

e

ERS2

, b)

CYP19A1 Comprar e ARO, e c)

ERS1 + ERS2 Comprar e CYP19A1 + ARO

para confirmar, ou exclui, com base nos resultados de sobrevivência se a expressão do gene foi alterado nas amostras de tumor, a mesma análise foi efectuada para as amostras não-tumorais dos mesmos pacientes, e não houve diferenças significativas na sobrevivência foram encontradas entre estes subgrupos; Log Rank = 0,524; . P = 0,815

expressão ERS1

em amostras de tumores foi a única variável, nos três genes e as proteínas, o que foi significativo no desenvolvimento de um modelo de regressão Cox: O nível total de significância foi de 0,031 para o modelo, p = 0,027 para o

ERS1

nível de ARNm de tumor com um Exp (B) de 0,002. P-valor para as amostras de tecido não-tumoral foi 0,529, não significativa, de modo que não foi incluído no modelo. Como o tumor rácio /não tumor, que passava primeira rodada, p = 0,105, mas depois parece não ser significativo. Apenas histologia (incluindo meramente adenocarcinomas e carcinomas de células escamosas) também foi significativa com p = 0,007 e um Exp (B) de 0,462.

2

ERS2

ERS2

expressão do gene foi comparado no tumor tecidos /não-tumorais e neste caso não foram encontradas diferenças significativas (teste de Mann-Whitney, p = 0,364). Pode ser visto na Tabela 2, os resultados de expressão de genes foram muito semelhantes nos dois tipos de tecido. Analisando a sobrevivência em função do nível de expressão do gene ERS2 como anteriormente (Figura 1a), não foram encontradas diferenças significativas entre o baixo e subgrupos de expressão elevados de tumor (p = 0,253) ou não-tumoral (p = 0,078) amostras. Era uma tendência notável para uma melhor sobrevida em pacientes com níveis mais baixos de ERS2 em suas amostras de tecido não-tumorais, sugerindo uma possível associação sobrevivência menor expressão /mais tempo.

Mantendo estes dados em mente, o significado das diferenças de OS também foi avaliada com um teste de Mann-Whitney. Como pode ser visto na Tabela 3, o padrão em amostras de tumores foi o inverso do que em amostras não-tumorais: as taxas de sobrevida média no grupo de baixa /tumor foram consideravelmente mais baixos do que aqueles no grupo de alto /tumor, embora essas diferenças não foram significativas (p = 0,11). Em contraste, as taxas médias foram consideravelmente mais elevada no grupo de baixo /não tumor do que o grupo de alto /não tumor, 33,1 contra 25,9 meses, respectivamente, e esta diferença foi significativa (p = 0,024).

Combinando tumorais e não tumorais e baixa e as classes altas, quatro categorias são criadas. As diferenças de OS entre estas categorias foram significativas (Kruskal Wallis p = 0,017; Log Rank = 0,021), com a menor taxa de sobrevivência na categoria de baixo tumor + alta não tumoral, ou seja, pacientes com

ERS2

/baixa expressão no tecido tumoral e

ERS2

expressão /alta no tecido não tumoral (média = 16,6 meses), ea mais alta taxa de sobrevivência em alta tumor + baixo não tumoral, ou seja, aqueles com

ERS2 Twitter /alta expressão no tecido tumoral e

ERS2

/baixa expressão no tecido não tumoral (média = 36,9 meses).

Nenhum

variáveis ​​ERS2

relacionados foi incluído no modelo de Cox porque seus testes univariados iniciais Cox exceder 0,2 treshold:. p = 0,278, p = 0,990 e p = 0,691 para tecidos tumorais, tecidos não-tumorais e tumor rácio /não tumor, respectivamente

3

CYP19A1

/aromatase

Como relatado na Tabela 2, a aromatase foi medido tanto no ARNm e os níveis de proteína (ng /ml). Não houve diferenças significativas entre tumores e amostras não-tumorais ao medir mRNA, p = 0,32. Em contraste, os níveis de proteína comparando a diferença foi encontrada para ser altamente significativa, P 0,001. Para analisar a relação entre os níveis de expressão de mRNA individuais e proteínas concentrações um teste de correlação foi realizada, mas não houve resultados significativos foram obtidos (Spearman, p = 0,133).

Para análise de sobrevivência, mais uma vez, a amostra total de pacientes foi dividida em grupos de baixo e alto (inferior e superior em média) de expressão /concentração. testes de Kaplan-Meier não detectou diferenças significativas tanto para a expressão do gene, amostras tumorais p = 0,154 (Figura 1b), as amostras não tumorais log-rank p = 0,578, ou concentração de proteína, amostras tumorais p = 0,266 (Figura 1b) e não tumoral amostras de log-rank p = 0,532

Embora em análise de sobrevivência não houve diferenças significativas, a Tabela 3 mostra que o padrão de expressão gênica e concentração de proteína foi bastante semelhante:. grupos de baixa expressão tendem a ter um maior sobrevida, enquanto os grupos de expressão elevada tendem a ter menor sobrevida. Subdividindo o total da amostra em fase inicial NSCLC (I-II) e fase tardia (III-IV) NSCLC, houve uma diferença significativa nas taxas de sobrevivência nos casos em estágio inicial entre baixa (mediana = 31,4 meses) e alta (mediana = 25,0 meses) grupos de expressão de genes aromatase: Log Rank = 0,07; Mann-Whitney, p = 0,016. Não houve tal diferença quando amostras de tecidos não tumorais foram comparados, ou considerando a concentração de proteína aromatase.

Tal como aconteceu com o

ERS2

, nenhum dos

CYP19A1

ou proteína relacionada aromatase variáveis ​​foi incluído no modelo de regressão Cox final, embora um deles passou análise inicial (p 0,200):

CYP19A1

tumor tecidos p = 0,966,

CYP19A1

não-tumor tecidos p = 0,810,

CYP19A

1 tumor /não rácio tumor p = 0,727, tumor aromatase tecidos p = 0,240, aromatase não-tumor tecidos p = 0,692 e relação tumor /não tumor aromatase p = 0,038.

4-combinado expressão gênica-sobrevivência análise

recentemente, demonstrou-se [22] que as combinações de diferentes resultados de expressão gênica pode definir em detalhe a situação geral no NSCLC. Como previamente uma determinada variável é dividida em grupos de baixas e altas, e, em seguida, se duas variáveis ​​são combinadas, quatro subgrupos podem ser definidos; para

ERS1

e

ERS2

, os subgrupos são de Baixa

ERS1

+ Low-

ERS2

, Low-

ERS1

+ alta

ERS2

, alta

ERS1

+ Low-

ERS2 Comprar e alta

ERS1

+ alto

ERS2

. Ao comparar as amostras, consulte a Tabela 4, os de maior expressão dos dois genes foram as que apresentaram maior OS. A diferença entre Low-

ERS1

+ Low-

ERS2 Comprar e alta

ERS1

+ Alta

ERS2

grupos foi significativa, Mann-Whitney p = 0,025, no entanto, um ensaio de Kaplan-Meier OS não foi, p = 0,057 (Figura 1C). Medianas para um subgrupo de Baixa

ERS1

+ Alta

ERS2 Comprar e Alta

ERS1

+ Low

ERS2

(26,63 e 28,80 meses, respectivamente) estavam perto aos do Low-

ERS1

+ Low-

ERS2

grupo; embora as comparações das quatro categorias não detectou diferenças significativas, o padrão obtido tende a sugerir que a alta expressão dos dois genes está associada com melhor sobrevida.

Em seguida,

CYP19A1

expressão e concentração de proteína aromatase foram considerados. Não houve diferenças significativas entre Low

CYP19A1

+ Low-aromatase proteína e alta

-CYP19A1

+ grupos de proteínas de aromatase alto (Tabela 4). Neste caso, a expressão mais elevada e concentrações tendem a ser associados com a sobrevivência mais curto, embora não significativa, p = 0,088 (Figura 1C).

Finalmente, os níveis de genes de receptores de estrogénio de expressão foram combinados com a expressão do gene e proteína de aromatase As concentrações e as taxas de sobrevida média avaliada (Tabela 5). Mais uma vez, quatro categorias foram consideradas na análise. A associação mais forte foi encontrada para

ERS1

combinada com

expressão CYP19A1

gene: as maiores taxas OS foram encontrados para as categorias alta

-ERS1

+ Low

-CYP19A1

e alta

-ERS1

+ alta

CYP19A1

(ambos contendo o

ERS1-

grupo expressão alta), enquanto que para a categoria de Baixa

ERS1

-high-

CYP19A1

foi consideravelmente menor. Estas diferenças foram significativas (Kaplan-Meier Log Rank = 0,0001; Kruskal-Wallis p = 0,011).

Para quantificar a extensão em que a sobrevivência foi menor no Baixo

-ERS1

+ alta

-CYP19A1

categoria, as outras três categorias foram agrupados em um só e uma regressão de Cox foi realizada. Os resultados foram altamente significativos: p = 0.000007; Exp (B) = 4,041. Neste Low-

ER

S1 + Alta

CYP19A

1 categoria, probabilidade de sobrevivência de um paciente foi quatro vezes menor do que para o resto dos pacientes (reagrupados num conjunto). Por outro lado, considerando-se a concentração de proteína aromatase, em vez de expressão de genes, as diferenças não eram mais significativo.

Para o

ERS2

/

CYP19A1

comparação quatro categoria, não foram encontradas diferenças significativas (ver Tabela 5). A sobrevivência menor correspondeu à categoria de Baixa

ERS2

+ Alta

-CYP19A1

longe das restantes categorias. Na verdade, a repetição do teste de Kaplan-Meier para baixo

-ERS2

+ Alta

-CYP19A1 Comprar e outras categorias individualmente, as três comparações de pares fez diferença de rendimento significativas (Low

-ERS2

+ Low

-CYP19A

vs. Baixo

-ERS2

+ alta

-CYP19A1

p = 0,031; alta

-ERS2

+ Low

-CYP19A1

vs. Baixo

-ERS2

+ alta

-CYP19A1

p = 0,045; e alta

-ERS2

+ alta

-CYP19A1

vs. Baixo

-ERS2

+ alta

-CYP19A1

p = 0,035). Como foi o caso de

ERS1

, a comparação das categorias Baixa

-ERS2

+ Low

-CYP19A1

, Alta

-ERS2

+ Low

-CYP19A1 Comprar e alta

-ERS2

+ alta

-CYP19A1

reagrupadas em apenas um set, com a categoria Baixo

-ERS2

+ alta

-CYP19A1

, utilizando regressão de Cox para quantificar as diferenças de sobrevivência, deu um resultado altamente significativo: p = 0,009, Exp (B) = 2.307

Considerando a concentração de proteína no lugar de

expressão CYP19A1

gene. , a categoria com o menor sobrevivência foi novamente baixo

-ERS2

+ de alta de aromatase, mas as taxas eram dramaticamente mais elevada para alta

-ERS2

+ Low-aromatase e bastante inferior para categorias Low

-ERS2

+ Low-aromatase e alta

-ERS2

+ alta aromatase. As diferenças entre as quatro categorias não foram significativas com o teste de Kaplan-Meier (p = 0,093), mas eles estavam com Kruskal-Wallis (p = 0,049).

O

ERS1

+ aromatase e

ERS2

+ combinações de aromatase compartilha uma característica interessante: Alto

ERS1 /2

+ Low-aromatase são as subclasses com maior sobrevivência em ambos os casos. A regressão de Cox de Alta

ERS1

+ Low-aromatase contra os outros três

ERS1

+ combinações de aromatase não foi significativo p = 0,114, Exp (B) = 1,89. Alta

ERS2

+ Low-aromatase produz o mesmo resultado p = 0,061 Exp (B) = 2,12.

Discussão

Embora tempo real RT-PCR foi usado anteriormente para determinar a expressão de receptores de estrogênio em amostras de tumor de pulmão, estes estudos têm sido limitados devido ao pequeno tamanho da amostra utilizada [23] ou por terem sido restrita a culturas de células [9], [24]. Além disso, IHC tem sido o método mais vulgarmente utilizados para detectar a presença de proteínas de ERa e variações e RpE na sua concentração. A investigação sobre aromatase tem seguido um padrão semelhante [11], [18], [25].

Até agora, tem havido discrepâncias consideráveis ​​nos resultados IHC relatados (mesmo usando mesmo anticorpo, técnica e tipo de tecido) : taxas de detecção pode variar de 0 a 80% para ERa, 30 a 100% em RpE e 60 a 100% para aromatase. Gomez-Fernandez et al. [26], Raso et al. [27] e Miki et al. [28] discutiu o problema, estabelecendo uma fonte dessas discrepâncias: as diferentes anticorpos que agem contra epítopos diferentes. Brueckl et ai. [21] e Atmaca et ai. [20], publicado a sua

ERS1

resultados de expressão com base no método de RT-PCR e amostras humanas (incluindo conjunto maior de pacientes), acrescentando uma nova fonte de discrepância, a multiplicidade de variantes de splicing de ESR1 mRNAs.

O

gene ERS1

foi expressa em 100% das amostras tumorais e não tumorais. Dentro das amostras de tumor havia um padrão significativo na sobrevida: aqueles com maior

ERS1

expressão do gene tinham maior sobrevida e isso contrasta com estudos anteriores. Por exemplo, em Fasco et ai. [23] nenhuma correlação foi encontrada, talvez devido ao pequeno grupo de pacientes, enquanto Olivo-Marston et al. [29] relataram uma correlação inversa entre a expressão de ER-positivo α e sobrevivência em amostras de soro e em uma das duas coortes tecido estudado. Os diferentes resultados podem ser explicados, em parte, pela abordagem à análise: eles tomaram o primeiro tercil como expressão negativa e os outros dois como positivo. Estudos anteriores têm tendido para utilizar métodos de IHC e os resultados têm sido muito misto, variando de quaisquer proteínas detectadas a presença de RE-α associados com a sobrevivência mais pobre, sozinho ou em combinação com o receptor do factor de crescimento epidérmico [6], [12] , [19], [22], [30], [31]. Outras razões para estas diferenças, além do problema do anticorpo acima mencionado e splicing alternativo, são os efeitos da regulação pós-translacional sobre a detecção [9], [26], [28], [32].

O

ERS1

resultados de expressão relacionadas com a sobrevivência estão de acordo com Brueckl et al. [21] e Atmaca et ai. [20]. Na verdade, eles usaram uma abordagem de análise semelhante ao que têm sido utilizados aqui, o método Delta Cq, utilizando a mediana para dividir os pacientes em subgrupos de baixa e alta expressão.

Em relação à

ERS2

expressão gênica , pacientes com alto e baixo

ERS

2 expressão em tecido tumoral e não tumoral, respectivamente, tendem a ter taxas de sobrevivência mais elevadas; e aqueles com o perfil de expressão oposto (Low

ERS2

no tumor /alta

ERS2

no tecido não tumoral) têm pior prognóstico. Alguns autores não encontraram qualquer relação entre a expressão da proteína ER-β e sobrevivência [22], [23], [33], enquanto outros, de acordo com nossos resultados, observamos que a presença da proteína ER-β está relacionada a melhor prognóstico. Quando se inclui em Cox modelo multivariado de regressão

expressão ERS2

no tumor, não-tumor e sua relação não deu resultados significativos. Relativos

CYP19A1

expressão, grupos de expressão pacientes em estágio inicial resultados (Alta Baixa /) de sobrevivência estão em concordância com os de Mah et al. [18], embora os seus resultados foram baseados em métodos de IHC para a detecção de proteína Tal como acontece com

ERS2

, nenhum dos

CYP19A1

ou aromatase variáveis ​​foram incluídas em Cox mocel multivariada.

tendo em combinações de expressão mente gene /proteína, Alta

ERS1

/Alta

ERS2

prevê claramente superior OS e pode ser usado como fator prognóstico. relatórios anteriores que utilizaram esta abordagem foram baseados em métodos de IHC e obtiveram comparações significativas através da combinação de variáveis ​​que descrevem a presença de proteínas de ER-beta e de aromatase [22], [34], [35].

O mais poderoso combinação gene foi encontrado para ser de Baixa

ERS1

+ Alta

CYP19A1

expressões e isso foi associado com menor sobrevida. Tendo analisado os quatro subconjuntos envolvendo

ERS1 /CYP19A1

, parece que de Baixa

ERS1

é mais decisivo para a sobrevivência de Alta

CYP19A1

expressão gênica, uma vez que a desvantagem de sobrevivência não é encontrado quando a alta

expressão CYP19A1

gene é combinado com alta

ERS1

expressão, mas a taxa de oS para o ponto baixo

ERS1

+ /baixa

CYP19A1

expressão aponta para a conclusão de que é a combinação exata que resulta no sistema operacional mais curto. A diferença no padrão entre a expressão do

CYP19A1

ea presença da proteína correspondente (Tabela 5) nos leva a concluir que algo compensa um aumento de OS na categoria de Baixa

ERS1

+ alta

-CYP19A1

, e uma diminuição na alta

ERS1

/alta

CYP19A1

/alta. Isso pode ser splicing, modificação pós translacional ou outro mecanismo biológico ainda não identificado, embora ele também pode ser atribuído ao tamanho relativamente pequeno da amostra.

Para obter um preditor comparável de OS baseado em

ERS2

, a combinação de Baixa

ERS2

+ Alta

CYP19A1

necessário para ser definido contra as três outras combinações possíveis (Tabela 5) agrupados em um único conjunto. A taxa de risco de uma regressão de Cox para os pacientes com Low-

ERS2

+ Alta

expressão CYP19A1

contra os outros três categorias é 2,307, enquanto o mesmo teste para o ponto baixo

ERS1

+ Alta

CYP19A1

expressão produziu uma razão de risco de 4,041, o que sublinha a força relativa da

ERS1

níveis como preditor. Por outro lado, no caso de

ERS2

proteína /aromatase, as diferenças significativas nos índices de sobrevivência foram notáveis, um padrão que não foi visto com

ERS1

. Tal como acontece com os

ERS1

/CYP19A1 combinações, pode-se concluir que de Baixa

ERS2

é mais importante do Alto

expressão CYP19A1

gene quando se considera a diferença na sobrevida entre os quatro subconjuntos. Além disso, a eventual existência de algum tipo de regulação devem ser considerados devido a variações nas taxas para categorias de Baixa

ERS2

+ Low-

CYP19A1

, Alta

ERS2

+ de Baixa

CYP19A1 Comprar e Alta

ERS2

+ Alta

CYP19A1 Comprar e as diferenças de comportamento da

ERS1

e

ERS2

perfis quando combinado com expressão ou o produto da

gene CYP19A1.

em conclusão

ERS1

, sozinho ou em combinação com

ERS2

ou

CYP19A1

, é o factor de prognóstico mais determinação dentro dos genes analisados ​​3, tendo em conta a sua desregulação em tecidos de tumor, a sua relação com a sobrevivência, e que a razão de risco quando é combinada com outras variáveis ​​é maior do que para a

ERS2

. A origem da desregulamentação, que parece estar causando subexpressão de

ERS1

RNA ainda não foi elucidado. O caso da

ERS2

é bastante diferente, uma vez que o padrão de sobrevida do paciente muda de expressão consideravelmente quando se considera na não-tumor ou tecido tumoral. Mais uma vez, acreditamos que existe algum fator ainda desconhecido perturbar esse processo. São necessárias mais pesquisas para identificar esses fatores e o nível em que eles estão agindo.

Informações de Suporte

arquivo S1.

Informações detalhadas sobre ERS1,

ERS2 Comprar e genes CYP19A1 comprimento transcrição, comprimento proteína associada, sonda exão-exão de fronteira, amplificação amplicon e funcionalidade proteína. Tabela S1a.

CYP19A1

transcritos do gene e proteína informações, adaptado a partir do site Life Technologies, para Ensaio ID Hs00903411_m1. Tabela S1b.

CYP19A1

transcritos do gene e proteína informações, adaptado de ENSEMB, para Ensaio ID Hs00903411_m1. Tabela S2a.

ERS1

transcritos do gene e proteína informações, adaptado a partir do site Life Technologies, para Ensaio ID Hs00174860_m1. Tabela S2B.

ERS1

transcritos do gene e proteína informações, adaptado de ENSEMB, para Ensaio ID Hs00174860_m1. Tabela S3a.

ERS2

transcritos do gene e proteína informações, adaptado a partir do site Life Technologies, para Ensaio ID Hs00230957_m1. Tabela S3B. .

ERS2

transcritos do gene e proteína informações, adaptado de ENSEMB, para Ensaio ID Hs00230957_m1

doi: 10.1371 /journal.pone.0109659.s001

(DOC)