Abstract

A homeostase em tecidos eucarióticos é rigidamente regulada por um equilíbrio intrincado do prosurvival e sinais antisurvival. O supressor de tumor PTEN (fosfatase e homólogo tensina suprimida no cromossoma 10), uma fosfatase de especificidade dupla, desempenha um papel funcional na paragem do ciclo celular e apoptose. NF-kB e os seus reguladores a jusante (tal como VEGF) desempenham um papel central na prevenção de apoptose, promoção do crescimento do tumor e inflamação. Portanto, pensou para estimar a expressão da polimerase de PTEN, poli-ADP-ribose (PARP), NF-κBp50, NF-κBp65 e VEGF para avaliar os efeitos da suplementação de óleo de peixe na sinalização apoptótica e inflamatória no carcinoma do cólon. ratos Wistar machos no Grupo I receberam dieta purificada enquanto o Grupo II e III recebeu modificado dieta suplementada com FO:CO (01:01) FO:CO (2.5:1), respectivamente. Estes foram ainda subdivididas em controlos que receberam acético-ácido etilenodiamina-tetra e grupos tratados receberam dimetil-dicloridrato (DMH) /semana durante 4 semanas. Animais sacrificados 48 horas após a última injecção de capital constituía fase de iniciação e que sacrificados após 16 semanas constituído fase pós-iniciação. Analisamos expressão de PTEN, NF-κBp50, NF-κBp65 pelo citómetro de fluxo e de localização nuclear de NF-kB por imunofluorescência. PARP e VEGF foi avaliada por imuno-histoquímica. Na fase de iniciação, os animais que receberam DMH mostraram aumento da% de células apoptóticas, PTEN, PARP, NF-κBp50, NF-κBp65 e VEGF no entanto, na fase de pós-iniciação nenhuma alteração significativa na apoptose com a diminuição da PTEN e aumento da PARP, NF-κBp50 , NF-κBp65 e VEGF foram observados, quando comparados com animais de controlo. No tratamento com ambos os rácios de óleo de peixe em ambas as fases, o aumento em% de células em apoptose, diminuição da PTEN, PARP, NF-κBp50, NF-κBp65 e VEGF foram documentados em relação ao DMH animais tratados com efeito sendo mais exercida com maior ração em fase de pós-iniciação. Assim, o óleo de peixe activa a apoptose, diminui a danos no ADN e inibe a sinalização inflamatória de uma forma dependente da dose e tempo de modo a inibir a progressão de cancro do cólon

citação:. Kansal S, Bhatnagar A, Agnihotri N (2014) Peixe Oil suprime o crescimento celular e potencial metastático, regulando PTEN e NF-kB de sinalização no cancro colorectal. PLoS ONE 9 (1): e84627. doi: 10.1371 /journal.pone.0084627

editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de setembro de 2013; Aceito: 25 de novembro de 2013; Publicação: 08 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kansal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Conselho indiano de Pesquisa médica (Immuno /18/11/27/2008-ECD-I). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

relatórios epidemiológicos mostraram que a incidência de câncer está aumentando em todo o mundo [1]. O cancro é a doença em que há uma desregulação da proliferação celular e a morte celular. Em células cancerosas, vias de transdução de sinal endógenos ficar perturbado para redireccionar as decisões celulares de diferenciação e apoptose de proliferação e, mais tarde, invasão [2]. Fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) via de sinalização tem um papel crucial na promoção da sobrevivência celular através da inibição da apoptose. PI3K converte a membrana plasmática de lípidos de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP

2) para fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP

3), que recruta então as proteínas que contêm uma homologia plecstrina (PH) para domínio membranas celulares [3], como fosfoinositol quinase-1 dependente (PDK1) e Akt. Activado Akt é o mediador predominante e essencial para a regulação da apoptose e proliferação, visando diferentes substratos a jusante: quinase IkB, Bcl-2, citocromo c e outros [4], [5]. Actividade da via PI3K /Akt é regulada negativamente pela fosfatase e tensina homólogo excluída no cromossomo 10 (PTEN). PTEN desfosforila o grupo 3’OH e converte PIP

3 em PIP

2, que conduz à activação da apoptose e, portanto, funciona como um supressor de tumor [6]. Os relatórios demonstraram que a expressão de

PTEN

foi transcricionalmente reprimida através da activação de NF-kB. O NF-kB é composto por subunidade transactivação RelA /p65 e a subunidades p50 de ligação ao ADN e p52, que são processados ​​a partir de p105 e p100, respectivamente, do precursor [7]. NF-kB é sequestrado no citoplasma pela IkB inibidor para evitar a sua activação de transcrição em condições não estimuladas. As citocinas inflamatórias causar a fosforilação de IkB, que por sua vez liberta a NF-kB, que, subsequentemente, se transloca para o núcleo e afectar a expressão de genes alvo que têm papéis importantes na inibição da apoptose, a promoção do crescimento do tumor, e a activação de respostas inflamatórias que promove ainda mais a metástase através do aumento da expressão do factor de crescimento endotelial vasucular (VEGF) [8]. A modificação covalente de proteínas por poli (ADP-ribosil) ção é uma resposta bioquímica imediato e dramático a danos no ADN. É uma modificação de proteínas ubíquos encontrados em células de mamífero que modula muitas respostas celulares, incluindo a reparação do ADN. Poli-ADP-ribose-polimerase (PARP) catalisa a polimerização de unidades de ADP-ribose de NAD doador

+ moléculas de proteínas-alvo, resultando na ligação de polímeros lineares ou ramificados [9]. PARP exibem funções celulares pleiotrópicos que vão desde a manutenção da estabilidade genômica e remodelação da cromatina a regulação da morte celular, tornando assim os homólogos de PARP como um alvos promissores na terapia do câncer [10].

relatórios epidemiológicos mostraram que o câncer colorretal ( CRC) é o terceiro câncer mais comum em homens (depois do câncer de próstata e câncer de pulmão) e as mulheres (depois do cancro da mama e cancro do pulmão) [1]. Estudos experimentais têm demonstrado que uma variedade de factores estão relacionados com o desenvolvimento de CRC [11]. As experiências anteriores realizados no nosso laboratório mostraram que a administração de óleo de peixe (n-3 PUFA) /óleo de milho (n-6 PUFAs) em 2,5 /1 rácio tem uma melhor eficácia em comparação com 1/1 para a quimioprevenção de experimentalmente câncer colorretal induzida [12]. Outro estudo demonstrou que a acção quimiopreventiva de diferentes proporções de óleo de peixe e óleo de milho pode ser mediada através de Ras pathway [13] sinalização. Um outro estudo da do nosso laboratório demonstrou que o óleo de peixe (FO) e óleo de milho (CO) em relação 2.5:1 alterou os parâmetros de membrana mitocondrial, ROS, e Ca

2+, de tal maneira de modo a aumentar apoptose em ambas as fases, ao passo que FO:CO na proporção 01:01 apoptose aumentada apenas em fase de pós-iniciação [14]. Foi anteriormente mostrado que a EPA e DHA aumentou o nível de PTEN que por sua vez inibe a transcrição de genes anti-apoptóticos, portanto, demonstraram os efeitos benéficos do óleo de peixe no crescimento das células do tumor da mama [15]. Portanto, o presente estudo foi realizado para compreender o papel dos diferentes proporções de óleo de peixe e óleo de milho em vias apoptóticas e potencial metastático mediadas por PTEN e NF-kB no câncer de cólon induzida experimentalmente.

Materiais e Métodos

Chemicals

N, N ‘

-Dimethylhydrazine dicloridrato (DMH), paraformaledhyde (PFA), iodeto de propídio (PI), Hoechst 33342 (H342) e de albumina de soro bovino (BSA ) foram obtidos a partir de Sigma Chemical Company, St. Louis, EUA. O anticorpo monoclonal contra PTEN foi obtido a partir de genescript, Piscataway, NJ, EUA. Os anticorpos monoclonais contra a PARP, VEGF, p50 e NF-kB do NF-kB p65 foram adquiridos a partir de Santa Cruz, CA, EUA e BD Biosciences, MD, EUA, respectivamente. isotiocianato de fluoresceína (ITCF) IgG de caprino conjugado anti-rato

1 foi comprado de Bangalore Genei, Bangalore, Índia. Maxepa óleo de peixe [contendo 180 mg de ácido eicosapentaenóico (EPA) e 120 mg de ácido docosahexaenóico (DHA) /ml] foi obtido de Merck Chemicals Limited, Goa, Índia e óleo de milho contendo 58,8% de ácido linoleico, 26,4% oleico, 1,3% linolênico e ácido gordo saturado de 12,8% foi obtido a partir de Sigma Chemical Company, St. Louis, EUA. A mistura mineral (Agrimin) foi obtido a partir Virbac Saúde Animal India Pvt. Ltd., Mumbai, na Índia. Todos os outros produtos químicos usados ​​no estudo foram de grau analítico.

Animais e dieta

ratos Wistar machos pesando 100-200 g foram obtidos de e alojado no Animal House Central, Universidade de Panjab, Chandigarh . Os protocolos experimentais foram aprovados pelo “Comitê Institucional animal Ética da Universidade Panjab, Chandigarh” (Ref. No. 1-12 /IAEC 2009/03/09) e conduzido de acordo com as diretrizes da “Academia Nacional de Ciência Indiano” para o uso e tratamento dos animais experimentais. Os animais foram alojados em gaiolas de polipropileno na casa dos animais e foram aclimatizados antes de ser utilizado no estudo experimental. Água foi dada

ad libitum

. Após uma semana de aclimatação, os animais foram divididos aleatoriamente em diferentes grupos e foram alimentados com a dieta experimental, durante quatro semanas. A composição da dieta experimental foi dada na Tabela 1. As dietas foram preparadas a partir do American Institute of Nutrition dieta padrão de referência de AIN-76A [16]. A composição de todas as dietas experimentais foi ajustado para que os animais em todos os grupos iria consumir a mesma quantidade de calorias [12].

Experimental Design by

O delineamento experimental é representada na figura . 1. ratos Wistar machos (N = 96) foram igualmente divididos nos seguintes grupos experimentais:

Os colonócitos isoladas foram incubadas com Hoechst 342 (H342) corante e PI. Microfotografias foram adquiridos utilizando microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse 80

i

) grupo controle A-, B- DMH tratada, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. cor azul escuro representa as células vivas normais, fraco azul ou rosa representa células em apoptose (ampliação de 400 ×). E) Representação gráfica de% de células vivas e apoptóticos em diferentes grupos. Os resultados são expressos como média ± D.P.. para n = 4 (

** p 0,01 controle WRT,

### p 0,001 wrt DMH).

do grupo controle)

– Estes animais recebeu dieta purificada e uma injecção intraperitoneal semanal de ácido etilenodiamino tetra-acético 1 mM (EDTA), pH 6,5, durante um período de 4 semanas

DMH tratada

-. Os animais deste grupo receberam dieta purificada, juntamente com uma injecção intraperitoneal semanal de DMH (20 mg /kg de peso corporal) durante 4 semanas.

FO + CO (01:01) + EDTA

Os animais receberam uma dieta modificada suplementado com 01:01 proporção de FO e CO. a injecção intraperitoneal semanal de EDTA também foi dado por um período de 4 semanas.

FO + CO (01:01) + DMH

a dieta modificada suplementado com 01:01 proporção de FO e CO foi dado aos animais deste grupo e de uma injecção intraperitoneal semanal de DMH por um período de 4 semanas.

FO + CO (2,5 :1) + EDTA

os animais deste grupo receberam dieta modificado, suplementado com FO + CO na proporção de 2.5:1 e recebeu uma injecção intraperitoneal de EDTA semanalmente por um período de 4 semanas.

FO + CO (2.5:1) + DMH

uma dieta modificada suplementado com FO + CO na proporção de 2.5:1 foi dado aos animais deste grupo e uma injeção intraperitoneal semanal de DMH por um período de 4 semanas.

Cada grupo foi ainda subdividido para estudos sobre a iniciação e fase pós iniciação e os animais foram distribuídos igualmente entre as duas fases. Os animais que foram sacrificados 48 h após a última EDTA /injeções DMH constituiu a fase de iniciação [17] e os animais mantidos durante 12 semanas após o regime de tratamento constituiu o estudo de fase pós-iniciação. Todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical.

Isolamento das colonócitos

Os colonócitos foram isolados pelo método de Sanders [18]. todo o cólon foi cortado longitudinalmente para expor lúmen e colocado em Ca quente

2+ e Mg

2 + solução salina tamponada de livre de Hank (HBSS), 30 mmol /l de EDTA, 5 mmol /l de ditiotreitol (DTT) , 0,1% de BSA (albumina de soro bovino). Após uma incubação de agitação de 15 min a 37 ° C, do lado da mucosa foi raspada para remover suavemente as criptas intactas. As células isoladas foram depois centrifugadas a 2200 rpm e lavadas duas vezes em HBSS quente contendo 1,3 mM de CaCl

2, 1 mM MgSO

4 e 0,1% de BSA. As células foram contadas utilizando um hemocitómetro e a sua viabilidade foi verificada pelo método de exclusão de azul de tripano [19].

Estimativa de células vivas e apoptóticos

A percentagem de células vivas e apoptóticas foram avaliadas por imunof luorescência . Isolado colonócitos (1-2 × 10

6) foram ressuspensas em 1 ml de PBS e incubadas com 10 uL de Hoechst 342 (H342) corante (1 mM) a 37 ° C durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS. Em seguida, as células foram incubadas com 10 uL de PI (1 mg /ml) a 37 ° C durante 10 min. As células foram novamente lavadas e ressuspensas em PBS. Microfotografias foram adquiridos usando o microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse 80

i

) e analisados ​​utilizando software de imagem Eclipse do Norte Elementos-D (NIS-D). Fotomicrografias de células com H342 e PI foram fundidas. Em microfotografias fundidas, com células de cor-de-rosa e células com cor azul escuro na periferia representam células em apoptose ter condensado /DNA fragmentado enquanto desmaiou azul todo foram consideradas as células normais.

Análise de PTEN, NF- p50 kB e p65 NF-kB pelo citómetro de fluxo

As proteínas intracelulares foram estimados pelo citómetro de fluxo. Os colonócitos foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 20 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar duas vezes com PBS, as colonócitos foram permeabilizadas com 100% de gelo metanol frio (adicionado gota a gota) e deixada durante 15 min a -20 ° C. As células foram novamente lavadas duas vezes em PBS frio. Cerca de 1 × 10

6 células foram adicionadas a um tubo de FACS, ressuspensas em tampão de saponina (PBS contendo 0,1% de saponina e 2% de BSA) e incubada durante 30 min a 4 ° C. Os diferentes alíquotas de colonócitos foram então incubadas com PTEN diluído, NF-kB p50 e p65 de NF-kB (1:100) anticorpos monoclonais durante 30 min à temperatura ambiente e, em seguida, lavada uma vez com tampão de saponina. Os colonócitos foram então incubadas com anticorpo secundário conjugado com FITC diluído durante 45 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas uma vez com tampão de saponina e, em seguida, com PBS. As células foram ressuspensas em PBS. A aquisição de cada amostra foi realizado em FACS Canto (BD Biosciences, EUA) e os dados coletados foram analisados ​​utilizando o software Diva BD FACS. Os controlos subsequentes para PTEN, NF-kB p50 e p65 NF-kB também foram executados simultaneamente. Os resultados de PTEN, p50 e NF-kB do NF-kB p65 foram representados como a média de MFI líquido (MFI de células tratadas com Ab – MFI de células apenas)

A localização de p50 de NF-kB e NF. -κB p65 por imunofluorescência

Os colonócitos fixos isolados foram lavados com PBS gelado duas vezes. As células foram secas ao ar sobre lâminas de vidro (VWR Scientific, Thane, Maharashtra, índia) e deixadas a aderir durante 10 min a temperatura ambiente. As células foram permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 e a ligação não específica foi bloqueada com 2% (w /v) de BSA em PBS durante 30 min à temperatura ambiente, antes da incubação com o anticorpo monoclonal diluído contra p50 de NF-kB (1 :50) e p65 de NF-kB (1:50) durante 1 hora à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas com PBS, incubadas com conjugado com FITC diluído IgG anti-ratinho

1 durante 2 horas à temperatura ambiente e lavou-se novamente com PBS. As secções foram contra-coradas com PI, durante 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas com PBS. Os cortes foram montados e selados com a tinta unha clara. As imagens foram obtidas utilizando um microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse 80

i

) e analisados ​​com Eclipse Norte Elementos-D de imagem (NIS-D) software. Fotomicrografias de células com NF-kB p50 /p65 e PI foram fundidas. Após a fusão as fotomicrografias, cor verde indica que a expressão de NF-kB p50 /p65 no citoplasma da célula, a cor vermelha representa a coloração nuclear com PI e cor amarela indica a localização de p50 de NF-kB /p65 no núcleo da célula .

estimativa imuno-histoquímica de VEGF e PARP

As secções de tecido (2-3 m de espessura) foram montadas em lâminas revestidas com poli-L-lisina. As lâminas foram aquecidas a 65 ° C antes de desparafinização em xileno. As lâminas foram re-hidratadas com soluções de álcool de série (100%, 90%, 70%, 50%, 30%). A actividade da peroxidase endógena foi extinta por incubação das lâminas com 3% H

2O

2 (em metanol) durante 20 min a 4 ° C. As secções foram bloqueadas com BSA a 2% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. A recuperação de antígenos foi feita com tampão de recuperação (pH 6,0), usando o micro-ondas (5 min no microondas para o VEGF e 5 min × 2 para a PARP). As lâminas foram deixadas arrefecer durante 20 minutos. Após recuperação de antigénios, as secções foram incubadas com VEGF (1:100) e PARP (1:50) para anticorpos durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida. As lâminas foram lavadas em PBS e seguido de incubação de 2 horas com anticorpo conjugado com HRP anti-rato (1:100) para o VEGF e o anticorpo conjugado com HRP anti-coelho (1:100) para PARP a 37 ° C numa câmara húmida. As lâminas foram visualizadas usando DAB e H

2O

2. As secções foram então contrastadas com hematoxilina durante 2 min, seguido de enxaguamento em água desionizada H

2O. As lâminas foram desidratadas e montadas com DPX para análise. As imagens foram adquiridas e analisadas utilizando o Nikon Eclipse 80

i

microscópio (Japão) e Eclipse do Norte software de imagem Elementos-D (NIS-D).

Análise Estatística

A resultados obtidos foram expressos como média ± SD As diferenças entre os grupos foram avaliados por análise de variância após verificar a normalidade por parcela Q-Q. O software utilizado para a análise estatística foi o SPSS 18.0 pacote de software para Windows. A significância estatística foi determinada por ANOVA de uma via com testes de Bonferroni múltipla comparação post hoc, e as diferenças foram consideradas significativas para p . 0,05

Resultados

Efeito da suplementação de óleo de peixe na apoptose /necrose no

cancro do cólon induzida experimentalmente

no presente estudo, a% de células apoptóticas foi calculada utilizando imunofluorescência e os resultados estão representados na fig. 1 e 2. Na fase de iniciação, os animais que receberam DMH têm mostrado um aumento significativo na% de culas apopticas quando comparado com os animais de controlo (Figura 1). No entanto, o tratamento com FO + CO (01:01) + DMH e FO + CO (2.5:1) + DMH, uma diminuição significativa na% de células vivas e um aumento significativo da% de células apoptóticas foram observadas como comparado com DMH animais tratados. Tem sido observado que, em fase de pós-iniciação, o tratamento com DMH, não houve nenhuma alteração significativa na% de culas apopticas quando comparado com os animais de controlo (Figura 2). Ao receber ambos os rácios, de óleo de peixe e óleo de milho, foi demonstrado que uma diminuição significativa na% de células vivas e uma melhoria significativa da% de células apoptóticas, em comparação com animais tratados com DMH.

O isolado colonócitos foram incubadas com Hoechst 342 (H342) corante e PI. Microfotografias foram adquiridos utilizando microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse 80

i

) grupo controle A-, B- DMH tratada, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. cor azul escuro representa as células vivas normais, fraco azul ou rosa representa células em apoptose (ampliação de 400 ×). E) Representação gráfica de% de células vivas e apoptóticos em diferentes grupos. Os resultados são expressos como média ± D.P.. para n = 4 (

### p 0,001 wrt DMH).

alterações alteração na expressão de PTEN em tratamento com diferentes proporções de óleo de peixe

Depois de avaliar em% de células apoptóticas no recebimento dessas PUFAs, que, em seguida, pensado para examinar a expressão do regulador da apoptose. O supressor de tumor PTEN (fosfatase e homólogo de angiotensina) é o mais importante regulador via de sinalização apoptótica. Portanto, no presente estudo, a expressão de PTEN foi estimado e os resultados de PTEN são dadas na Tabela 1. Na fase de iniciação, os dados flowcytometric descreveu que a expressão de PTEN foi significativamente elevados em animais tratados com DMH, em comparação com animais de controlo que, em tratamento dos animais com diferentes rácios de FO + CO, PTEN foi aumentada consideravelmente em relação aos animais de controlo, mas o aumento foi menor em comparação com animais tratados com DMH. Os dados de fase de pós-iniciação demonstrou que a expressão de PTEN foi diminuído significativamente após tratamento com DMH em relação aos animais de controlo. No entanto, o tratamento com ambos os rácios de óleo de peixe e óleo de milho, a expressão de PTEN foi aumentada consideravelmente. O aumento foi mais significativo com FO + CO (2.5:1) + DMH na fase pós-iniciação.

Efeito da suplementação de óleo de peixe e óleo de milho sobre a actividade PARP

PARP é um enzima de ligação de ADN abundante que detecta as quebras da cadeia de ADN. enzima PARP desempenha um papel importante em funções celulares diferentes, tornando assim PARP como um alvo promissor na terapia do cancro [10]. Portanto, no presente estudo, a actividade da PARP foi analisado para avaliar o efeito de diferentes proporções de óleo de peixe e óleo de milho a enzima de reparação do ADN. Os resultados da coloração imuno-histoquímica de PARP são mostrados na fig. 3. A mucosa do cólon de animais de controle tem representado muito moderada ou fraca expressão de PARP. No tratamento com DMH, expressão de PARP foi aumentada em ambas as fases, em comparação com animais de controlo. As células foram fortemente positivas para a PARP na fase de pós-iniciação, em comparação com a fase de iniciação. No entanto, ao receber as diferentes proporções de óleo de peixe e óleo de milho, a expressão da PARP foi diminuído, em comparação com animais tratados com DMH sendo o efeito pronunciado com FO + CO (2.5:1) + DMH na fase de pós-iniciação.

coloração imuno-histoquímica de PARP em parafina seções formol de tecido do cólon. A-D mostra o fotomicrografias representativas de fase de iniciação e E-H representa a fase de pós-iniciação ( “seta” descreve a expressão de PARP). (A e E) de controle, (B e F) DMH tratada, (C e G) FO + CO (01:01) + DMH, (D e H) FO + CO (2.5:1) + DMH (Ampliação 400X) .

regulação negativa do subunidades NF-kB sobre a suplementação de óleo de peixe

A ativação de NF-kB via é um evento crucial no crescimento do tumor induzida por inflamação e progressão [20]. NF-kB é um factor de transcrição ubíqua que tem um papel fundamental na sobrevivência celular e morte celular [21]. NF-kB está presente no citossol numa forma ligada com IkB. Fosforilação de resíduos de serina das proteínas IkB por IkB quinases (IKKS), tem como alvo o IkB para a degradação proteossómica. As subunidades NF-kB livres (p50 e p65) são transportados para o núcleo como um dímero e segmentar os promotores que conduzem à activação de genes que estão envolvidos na proliferação celular, invasão e a morte celular. NF-kB é regulada negativamente por PTEN e outros objectivos muitos genes anti-apoptóticos tais como Bcl-2 e Bcl-XL [15]. Portanto, depois de avaliar a expressão de PTEN, que, em seguida, pensado para analisar a expressão, bem como a localização de ambas as subunidades de NF-kB no câncer de cólon induzida experimentalmente.

Expressão e Localização de NF-kB p65

a expressão de p65 de NF-kB foi medida por citómetro de fluxo e a localização foi examinado utilizando microscopia de fluorescência. Os resultados de citometria de fluxo da fase de iniciação descrito que a expressão da p65 de NF-kB foi significativamente aumentada por tratamento com DMH em comparação com os animais de controlo. No tratamento com FO + CO (01:01) + DMH, NF-kB p65 foi ainda mais agravado significativamente no entanto, ao receber FO + CO (2.5:1) + DMH, expressão da p65 NF-kB foi diminuiu significativamente em comparação com DMH os animais tratados (Tabela 2). Os dados de fase de pós-iniciação revelou que em dar DMH, a expressão de NF-kB p65 foi significativamente aumentada em comparação com os animais de controlo. No tratamento com ambos os rácios de FO + CO + DMH, a expressão foi significativamente diminuída em relação ao grupo tratado com DMH. A redução foi mais significativa com FO + CO (2.5:1) + DMH, em comparação com FO + CO (01:01) + DMH.

Como as subunidades NF-kB ativados translocate do citoplasma para núcleo, por conseguinte, no presente estudo, foi também avaliada a localização nuclear de NF-kB. Os resultados de localização de p65 de NF-kB são resumidos na Fig. 4. Os dados de imunofluorescência revelou que o tratamento com DMH, a% de células com p65 de NF-kB, no núcleo e no citoplasma foi significativamente aumentada em ambas as fases, em comparação com os animais de controlo (Fig 4B . 4F). No entanto, o tratamento com diferentes proporções de óleo de peixe e óleo de milho, a localização de p65 de NF-kB do citoplasma para o núcleo foi reduzida com o efeito mais marcado com FO + CO (2.5:1) + DMH na fase de pós-iniciação .

Os colonócitos fixas isoladas foram permeabilizadas e incubadas com anticorpo monoclonal contra p65 de NF-kB e anticorpo secundário conjugado com FITC correspondente As secções foram contra-coradas com PI para visualizar a localização nuclear. fluorescência vermelha representa a coloração nuclear por PI sem expressão de NF-kB (representado por “seta pontilhada”) e fluorescência verde indica a expressão de NF-kB p65. A cor amarela indica a localização de NF-kB p65 do citoplasma para núcleo (representado por “seta”). A-D mostra a fase de iniciação e E-H representa a fase pós-iniciação. (A e E) de controle, (B e F) DMH tratada, (C e G) FO + CO (01:01) + DMH, (D e H) FO + CO (2.5:1) + DMH (Ampliação 400X) .

expressão e localização de NF-kB p50

análise de citometria de fluxo, mostrou que o tratamento com agente cancerígeno, a expressão de p50 de NF-kB foi aumentada significativamente (p 0,001) em ambas as fases, em comparação com os animais de controlo (Tabela 3). No entanto, o tratamento com FO + CO (01:01) + DMH e FO + CO (2.5:1) + DMH, a expressão de p50 de NF-kB foi reduzida significativamente (p 0,001) em comparação com animais tratados com DMH, tanto a iniciação, bem como fase de pós-iniciação.

no presente estudo, a localização de p50 NF-kB do citoplasma para núcleo foi feito por dupla marcação. Imunofluorescência de dados revelou que o tratamento com DMH, a% de células com p50 de NF-kB

+ no núcleo e no citoplasma foram aumentadas significativamente em ambas as fases, em comparação com os animais de controlo (Fig 5B . 5F). No entanto, o tratamento com diferentes proporções de óleo de peixe e óleo de milho, a localização de p50 de NF-kB do citoplasma para o núcleo foi recusado com sendo o efeito mais pronunciado com FO + CO (2.5:1) + DMH na pós-iniciação fase.

Os colonócitos fixas isoladas foram permeabilizadas e incubadas com anticorpo monoclonal contra p65 de NF-kB e anticorpo secundário conjugado com FITC correspondente As secções foram contra-coradas com PI para visualizar a localização nuclear. fluorescência vermelha representa a coloração nuclear por PI sem expressão de NF-kB (representado por “seta pontilhada”) e fluorescência verde indica a expressão de NF-kB p65. A cor amarela indica a localização de NF-kB p65 do citoplasma para núcleo (representado por “seta”). A-D mostra a fase de iniciação e E-H representa a fase pós-iniciação. (A e E) de controle, (B e F) DMH tratada, (C e G) FO + CO (01:01) + DMH, (D e H) FO + CO (2.5:1) + DMH (Ampliação 400X) .

Efeito do óleo de peixe na VEGF tanto na iniciação e fase pós-iniciação do câncer de cólon

a angiogênese é um componente essencial do desenvolvimento embrionário normal, requerendo interacções complexas entre as células endoteliais e células do tecido envolvente. Sinalização por VEGF e seus receptores VEGFR desempenham papéis fundamentais nessas interações [22]. O VEGF liga-se a estes receptores e estimula a proliferação celular endotelial, migração e sobrevivência. Portanto, no presente estudo, foi avaliado o efeito da suplementação de óleo de peixe e óleo de milho na expressão de VEGF. Os resultados da coloração imuno-histoquímica de VEGF para o presente estudo estão representados na fig. 6. A mucosa do cólon de animais de controlo foi representada uma fraca expressão de VEGF nas células endoteliais. No tratamento com DMH, a expressão de VEGF foi elevada nas células endoteliais do cólon em ambas as fases, em comparação com animais de controlo. O aumento na expressão de VEGF foi mais pronunciado na fase de pós-iniciação, em comparação com a fase de iniciação. Ao receber o FO + CO (01:01) + DMH, não houve diferença significativa na expressão de VEGF na fase de iniciação, em comparação com animais tratados da DMH, no entanto, o tratamento com FO + CO (01:01) + DMH na fase de pós-iniciação, a expressão de VEGF foi reduzida. Ao receber FO + CO (2.5:1) + DMH, a expressão de VEGF foi reduzida em ambas as fases, em comparação com animais tratados com DMH.

A expressão de VEGF foi analisada usando imuno-histoquímica em secções embebidas em parafina fixadas em formalina de tecido do cólon. A-D mostra o fotomicrografias representativas de fase de iniciação e E-H representa a fase de pós-iniciação (→ descreve a expressão de VEGF). (A e E) de controle, (B e F) DMH tratada, (C e G) FO + CO (01:01) + DMH, (D e H) FO + CO (2.5:1) + DMH (Ampliação 400X) .

Discussão

foi demonstrado pelos relatórios anteriores que o DHA e EPA, dois componentes activos do óleo de peixe, evitar a transcrição de genes dependente de NF-kB e aumentam a expressão de PTEN em células pancreáticas, da mama e cancro do cólon. Os estudos anteriores realizados em nosso laboratório demonstraram que FO + CO (2.5:1) tem melhor eficácia quimiopreventivo em comparação com FO + CO (01:01) no câncer de cólon induzida experimentalmente [12]. Portanto, o presente estudo foi conduzido para entender o mecanismo de acção quimiopreventiva destes PUFAs de dieta sobre as vias apoptóticas. Os resultados do presente estudo demonstraram que a adição de óleo de peixe e óleo de milho na dieta exerce um efeito quimiopreventivo diferencial através do aumento da apoptose, que pode ser mediada através de alterações na expressão de PTEN e de sinalização de NF-kB.

A principal regulador da apoptose é a via PTEN. PTEN antagoniza a actividade de PI3K por PIP3 conversão de volta para PIP2, e, assim, reduzindo o pool celular de PIP3 [23], [24]. A perda da função de PTEN gene supressor de tumor, é a aberração genética mais comum no cancro [25].