Abstract

laser de dessorção /ionização espectrometria de massa de imagem assistida por matriz de alta resolução (HR-MALDI-IMS) é uma aplicação emergente para a análise abrangente e detalhada da distribuição espacial das moléculas ionizadas in situ em lâminas de tecido. HR-MALDI-IMS no modo negativo numa gama de massa de m /z 500-1000 foi realizada em temperatura de corte óptima (OCT) amostras de tecido embebidas em compostos da próstata humana obtidas a partir de pacientes com cancro da próstata, no momento da prostatectomia radical. HR-análise de MALDI-IMS das 14 amostras no conjunto de descoberta identificado como 26 moléculas altamente expresso na próstata. espectrometria de massa em tandem (MS /MS) mostrou que estas moléculas incluiu 14 fosfatidilinositóis (IP), 3 fosfatidiletanolaminas (PEs), ácidos fosfatídicos e 3 (PAS). Entre os IPs, a expressão da PI (18: 0/18: 1), PI (18: 0/20: 3) e PI (18: 0/20: 2) foram significativamente maiores do que em tecido de cancro em epitélio benigna. Um algoritmo biomarcador para o câncer de próstata foi formulado através da análise dos perfis de IPs expressão no tecido canceroso e do epitélio benigno da descoberta definido usando ortogonais mínimos quadrados parciais análise discriminante (OPLS-DA). A sensibilidade e especificidade deste algoritmo para o diagnóstico do cancro da próstata em amostras de validação jogo 24 foram de 87,5 e 91,7%, respectivamente. Em conclusão, HR-MALDI-IMS identificados vários IPs como sendo mais altamente expressa em câncer de próstata do epitélio benigna da próstata. Estas diferenças nos perfis de expressão PI pode servir como uma ferramenta de diagnóstico da novela para o câncer de próstata

Citation:. Goto T, Terada N, Inoue T, Nakayama K, Okada Y, Yoshikawa T, et al. (2014) O Expression Perfil de fosfatidilinositol em alta Spatial Resolution Imaging Mass Spectrometry como um potencial biomarcador para o câncer de próstata. PLoS ONE 9 (2): e90242. doi: 10.1371 /journal.pone.0090242

editor: Ichiro Aoki, da Escola de Medicina da Universidade de Yokohama, Japão

Recebido: 26 de novembro de 2013; Aceito: 27 de janeiro de 2014; Publicação: 28 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Goto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) através do “Programa de Financiamento para o World-líder inovador R D em Ciência e Tecnologia (primeiro programa)”, iniciado pelo Conselho de política científica e Tecnológica ( CSTP) (https://www.first-ms3d.jp/english/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um dos cânceres mais comuns ea principal causa líder de mortes relacionadas ao câncer em homens [1]. Devido à sua heterogeneidade clínico e histológico, não foram ainda determinados os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do cancro da próstata. metabolismo de lipidos pode desempenhar um papel importante na carcinogénese humana, afectando numerosos processos celulares, incluindo crescimento celular, proliferação, diferenciação e motilidade [2] – [4]. Os padrões de expressão de vários fosfolípidos têm sido relatados para diferir no cancro da próstata e no tecido da próstata benigna [5]. Fosfatidilinosit�s (IPs), a principal classe de fosfolipídios, estão envolvidas na transdução de sinal intracelular [6], [7]. Em particular, a via de PI3-quinase, que regula muitas funções celulares, incluindo metabolismo dos lípidos, é frequentemente mutado ou activado no cancro da próstata [8], [9]. Ao contrário de outros fosfolipídios, perfis PI mostram padrões específicos em células de mamíferos, sendo afetada por vários aciltransferases na via remodelação (via Lands ‘) [10], [11]. Os perfis de PI de tecidos de cancro da mama humano Foi demonstrado que diferem daqueles das glândulas mamarias normais [12]. Até à data, no entanto, os perfis de PI não foram analisados ​​em tecidos de cancro da próstata.

desadsorção assistida por matriz /ionização por laser espectrometria de massa de imagem (MALDI-IMS) é uma nova modalidade que facilita a aquisição do espectros de massa abrangente directamente a partir de amostras de tecido e fornece mapas de densidade reconstruídas de iões detectados [13]. O cancro da próstata, no entanto, é multifocal e rodeado por um epitélio ou estroma benigna da próstata, o que torna difícil identificar lesões específicas de cancro convencional por MALDI-IMS. A resolução espacial desta técnica foi recentemente melhorado, para menos de 10 um, o que facilita uma análise detalhada bidimensional de fosfolípidos [12], [14] – [18]. Tal como a maioria das glândulas formas de cancro da próstata e o diâmetro de uma única glândula é não menor do que 50 um, o 10 um campo de alta resolução com dessorção por laser espectrometria de massa de imagem assistida por matriz /ionização (HR-MALDI-IMS) é suficiente para visualizar claramente lesões de câncer de próstata.

amostras de tecidos congelados embutidos em temperatura de corte óptima composto (OCT) são preservados em muitos laboratórios clínicos e são frequentemente usadas na pesquisa do câncer. Como resultado do problema de contaminação, no entanto, as amostras congeladas frescas sem composto OCT têm sido utilizados no domínio da investigação de lípidos IMS [19], [20]. A utilização de amostras armazenadas sem composto OCT é limitada, devido à formação de cristais de gelo e a dificuldade fazer secções de tecido.

Neste estudo, foi estabelecido um sistema em situ utilizando MALDI-RH em IMS para analisar a expressão de fosfolípido padrões de amostras de tecido da próstata embutidos em composto OCT. Este método identificados vários fosfolípidos como sendo mais altamente expressa no cancro da próstata do que no epitélio benigno adjacente. Nós, portanto, centrada sobre o perfil dos PIs expressão e avaliou o seu potencial para distinguir o câncer de próstata a partir do epitélio benigno. Para o nosso conhecimento, este estudo é o primeiro a usar HR-MALDI-IMS para investigar os padrões de expressão de fosfolipídios em amostras de tecido da próstata embutidos em composto OCT, e identificar com sucesso as diferenças de perfis de expressão PI no câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todos os experimentos envolvendo animais de laboratório foram realizados de acordo com as Diretrizes para Experimentação animal da Universidade de Kyoto. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Kyoto (número de autorização: 13331).

materiais clínicos foram usadas consentimento informado após a escrita foi obtida, de acordo com protocolos aprovados pelo conselho de revisão institucional do Hospital da Universidade de Kyoto.

amostras de tecidos Preparação de composto OCT incorporados

Nós previamente estabelecido um modelo de rato de xenotransplante romance de câncer de próstata humana, chamada KUCaP-2 [21]. Estes tecidos de xenoenxerto foram usadas para determinar as condições apropriadas para o sistema de MALDI-RH IMS para analisar amostras de tecido da próstata humanos embebidos em composto outubro tumores de xenoenxerto foram cada um dividido em duas partes, com um conjunto embutido em composto OCT (Tissue-Tek®; Sakura Finetek, Torrance, CA, EUA), sem tratamento de sacarose para evitar a influência de fixação, e a outra imediatamente congelado em azoto líquido para evitar a degradação de biomoléculas. Ambas as amostras foram armazenadas a -80 ° C.

O grupo de pacientes consistiu em 38 pacientes japoneses com câncer de próstata clinicamente localizado submetidos à prostatectomia radical no Hospital Universitário de Kyoto de 2005 a 2008. próstata fatias de tecido 5 mm de espessura foram colhidas imediatamente após a remoção e embebidos em composto OCT, sem tratamento de sacarose e congelou-se a -80 ° C. Todos os blocos congelados rendeu seções contendo tecido canceroso e do epitélio benigno.

A avaliação histológica e revestimento de matriz de amostras de tecido da próstata

Após a remoção máxima de composto OCT, as amostras de tecido foram criosseccionada em um criostato (CM1850 ; Leica, Wetzler, Alemanha) a -20 ° C. Cortes congelados de 5 um de espessura foram montadas em lâminas de vidro (revestimento MSC; Matsunami, Osaka, Japão) para hematoxilina e eosina (H E) de coloração. Todas as lâminas foram avaliadas por um único patologista (S.S.) para determinar a morfologia do tecido e como um guia para a análise de MALDI-HR-IMS. cortes seriados adicional a 10 mm foram montados em índio-estanho revestida de óxido-(ITO) lâminas de vidro (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e utilizados para análise HR-MALDI-IMS. Outubro incorporado composto e amostras de xenoenxerto congeladas frescas foram montados na mesma lâmina, enquanto que cada amostra clínica tecido da próstata de aproximadamente 7,5 × 7,5 mm foi montado numa única lâmina. Cada secção foi revestido com hemi-9-aminoacridina (9-AA) (Acros Organics, Geel, Bélgica), que serviu como a matriz para MALDI-MS. Cada lâmina foi ancorada no equipamento de deposição de vácuo (SVC-700TM /700-2; Sanyu Electron, Tóquio, Japão) e revestidos com uma camada de matriz 9-AA obtida por sublimação a 220 ° C. O tempo necessário para o processo de deposição de vapor foi de 8 min; a espessura da camada de 9-AA depositada sobre a lâmina não foi avaliada. As seções avaliadas pelo HR-MALDI-IMS também foram coradas com H E e avaliados pelo patologista. Para a H E de coloração após a análise de MALDI-HR-IMS, 9-AA foi removido das lâminas mergulhando-as em metanol durante 30 s

HR-MALDI-IMS e MS /MS

AR-MALDI-IMS foi realizada num espectrómetro de alta resolução de imagem microscópica de massa (RK27-4050C; Shimadzu, Quioto, Japão; o modelo protótipo de iMScope) equipado com um 355-nm laser Nd: YAG. Dados de espectrometria de massa foram adquiridos em modo negativo na gama de massa de m /z 500-1000 usando um método de calibração externo com o poder de resolução de massa de 10.000 a m /z 1000. A região de interesse (ROI), cerca de 2,000 x 2,000 uM em tamanho e contendo tecido de cancro, epitélio e estroma benigna, foi determinada de forma aleatória do ponto de vista microscópico de cada lâmina e os espectros de massa foram obtidos a uma resolução espacial de 10 um. O ROI foi reconfirmado pela amostra de espessura 10 mm coradas com H E após a medição HR-Madli-IMS. O mesmo instrumento foi utilizado para a espectrometria de massa em tandem (MS /MS) Análise; a composição de ácidos gordos e lípidos classe dos picos observados foram baseadas nos padrões espectrais dos picos de iões dos produtos. O Metaboloma Humano Banco de Dados (https://www.hmdb.ca/) e Natureza Lipidomics Gateway (https://www.lipidmaps.org/) foram utilizados para referenciar. Das 38 amostras, 14 foram seleccionados aleatoriamente como um conjunto descoberta e utilizado para identificar moléculas altamente expresso em tecidos da próstata e expressos diferencialmente no cancro da próstata e epitélio benigna. As outras 24 amostras foram utilizadas como um conjunto de validação e os perfis das moléculas identificadas expressão foram analisados ​​estatisticamente e sua utilidade como marcadores moleculares para diagnóstico de câncer de próstata foi avaliado.

O processamento de dados e análise estatística de HR-MALDI- resultados IMS

Usando SIMtools software (in-house software; Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão), os perfis de massa foram normalizados em relação à corrente total de íons para eliminar variações na eficiência de ionização, e utilizados para todos os imagem e estatística analisa. Ion imagens foram visualizadas utilizando o software Biomap (Novartis, Basel, Suíça). Mann-Whitney (M-W) testes U foram utilizados para comparar os fatores entre o tecido fresco congelado e outubro tecido embebido ou entre câncer e epitélio benigno. Para avaliar perfis de expressão PI, os dados normalizados foram importados para o software 13.0.3 SIMCA (Umetrics AB, Umeå, Suécia). Análise de Componentes Principais (PCA) foi utilizado para análises multivariadas sem supervisão e ortogonais mínimos quadrados parciais análise discriminante (OPLS-DA) foi utilizado para análises multivariadas supervisionado. modelos PCA e OPLS-DA são retratados como parcelas de pontuação (componente principal [PC1, PC2]), o que exibir qualquer agrupamento intrínseca das amostras com base na variação espectral. Na análise OPLS-DA, biomarcadores potenciais foram seleccionados com base no S-trama. O enredo da covariância em relação a correlação em conjunto com os gráficos de tendência de variáveis ​​resultou em facilitar a visualização dos dados. As variáveis ​​que mais alterados foram representados na parte superior ou na parte inferior do “S” em forma de trama, e aqueles que não variam significativamente foram representados graficamente no meio. O algoritmo para diferenciar o cancro do epitélio benigno também foi estabelecida por OPLS-DA, com um ponto de corte definido como 0,5. O poder de previsão do algoritmo também foi testada utilizando a área sob a curva característica de operador receptor (ROC). A sensibilidade foi definida como a proporção de regiões de cancro reais correctamente identificadas como tal, e a especificidade foi definida como a proporção de regiões reais epitélio benigna correctamente identificados como tal. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SIMCA 13.0.3 ou SPSS versão 11.0, com p . 0,05 considerado estatisticamente significativo

Resultados

tecidos de câncer de próstata embutidos em composto OCT são adequados para HR-MALDI -IMS

para avaliar a adequação das amostras de tecido de câncer de próstata embutidos em composto OCT para HR-MALDI-IMS, foi utilizado um modelo de xenoenxerto de ratinho de cancro da próstata humana (KUCaP-2). O espectro de massa em outubro, sem tecidos tumorais mostraram os mesmos picos como os espectros de massa na matriz de 9-AA sozinho, indicando que outubro não interferiu com a análise HR-MALDI-IMS no modo negativo (Figura 1A). Além disso, no intervalo de massa de m /z 500-1000, quase não havia diferenças significativas nos padrões espectrais de amostras compostas incorporado PTU e amostras congeladas frescas (Figura 1B, Tabela S1). Estes resultados indicaram que os tecidos de cancro da próstata incorporados em composto OCT são adequados para análises MALDI-RH em IMS no modo negativo.

tecido matriz revestida foi submetida a modo de ião negativo HR-MALDI-IMS. A resultando espectros média massa de cada região (painel superior, matriz; painel do meio, outubro + matriz; painel inferior, tumor + matriz) na faixa de massa de m /z 500-2000. Os eixos x mostra m /z, e os eixos y mostram a intensidade do sinal de espectro de massa. As imagens ópticas correspondentes também são mostrados. A barra de escala representa 200 m. B, H E as imagens de congelados (painel superior) fresco e composto OCT incorporado (painel inferior) espécimes de tumor xenoenxerto. A barra de escala representa 200 m. Resultando espectros de massa média de cada tecido do tumor xenoenxerto (superior congelado de fresco; inferior, composto OCT incorporado). Na faixa de massa de m /z 500-1000

Vinte fosfolipídios foram identificados como altamente expresso em tecidos da próstata humanos

amostras de tecido da próstata humanos embebidos em composto OCT foram analisadas por MALDI-RH em IMS no modo negativo na gama de massa de m /z 500-1000 (Figura 2A, B). As características dos 38 pacientes incluídos estão apresentados na Tabela 1. Das 38 amostras, 14 foram utilizados no conjunto de descoberta e 24 no conjunto de validação. ROIs que incluíam tanto o câncer e epitélio benigno foram selecionados aleatoriamente nas amostras conjunto 14 de descoberta. Os 100 primeiros picos dos espectros de massa foram analisados ​​em cada amostra. Excluindo matriz e picos isotópicos, 26 picos foram consistentemente detectados em 12 ou mais das 14 amostras (Tabela S2). As imagens de íon foram claramente visualizados em câncer de próstata e epitélio benigno usando HR-MALDI-IMS incidindo sobre estas 26 espécies m /z (Figura 2C). A análise por MS /MS pode identificar a estrutura destas moléculas, analisando os picos de iões seus precursores (Figura S1). Dos 26 picos, 20 foram identificadas como fosfolípidos (Tabela S3), com 14 sendo lysophosphatidylinositol (LPI) e IP (m /z 599,3, 809,5, 833,5, 835,5, 837,5, 857,5, 859,5, 861,5, 863,5, 883,5, 885,5, 887.5, 889,5 e 909,5), sendo três fosfatidiletanolaminas (PEs: m /z 716,5, 742.5 e 744,5) e três que são ácidos fosfat�icos (PAs: m /z 673,4, 699,5 e 701,5). Os ácidos gordos saturados observados contidos nestes fosfolípidos eram C16: 0 e C18: 0, e o gordo insaturado ácidos eram C18: 1, C18: 2, C20: 2, C20: 3, C20: 4, e C22:. 6

tecido Matrix revestido foi avaliada pelo modo de iões negativos HR-MALDI-IMS na faixa de massa de m /z 500-1000. A, H E manchado amostra de tecido da próstata humana contendo determinadas áreas de epitélio benigno (azul) e cancro da próstata (vermelho). A barra de escala representa 200 m. B, Regiões de interesse e resultando massas médias de epitélio benigna (painel superior) e câncer de próstata (painel inferior). O xey eixos mostra m /z e a intensidade do sinal normalizado para corrente de íons total, respectivamente. imagem espectrometria C, Mass mostrando a distribuição de 26 m comum espécie /z.

perfis de expressão PI diferem em câncer de próstata e epitélio benigno

Os fosfolipídios mais frequentemente detectado pelo analisa-RH MALDI-IMS em amostras de tecido de próstata foram IPs. Portanto, focada nos perfis de expressão PI no câncer de próstata e no epitélio benigno. Uma comparação entre a intensidade do sinal destes 14 Pis em cancro e epitélio benigna nas amostras conjunto descoberta mostrou que a expressão da PI (18: 0/18: 1), PI (18: 0/20: 3) e PI (18 : 0/20: 2) foi significativamente mais elevada do que no cancro no epitélio benigna (Tabela 2). . Visualizações representativa da distribuição destes PIS no HR-MALDI-IMS análises indicaram que os seus níveis de expressão foram igualmente mais elevados no cancro do que em epitélio benigna (Figura 3)

H E coradas e imagens de espectrometria de massa de amostras de 5 casos no conjunto de descoberta. H E as imagens manchadas mostram áreas de epitélio benigno (azul) e cancro da próstata (vermelho) definido. A barra de escala representa 200 m. imagens de espectrometria de massa mostram a distribuição representativa de m /z 863,5 (PI [18: 0/18: 1]), 887,5 (PI [18: 0/20: 3]) e 889,5 (PI [18: 0/20: 2 ]), que foram mais altamente expressa em câncer do que no epitélio benigno no conjunto de descoberta.

Para avaliar as diferenças globais nos perfis de câncer de próstata e epitélio benigno, análise de PCA de expressão PI a 14 IPs foi realizada nas amostras de conjunto de descoberta. As parcelas de pontuação de PCA em PC1 (R

2 = 0,562) e PC2 (R

2 = 0,204) mostraram agrupamentos pouco claras em tecido canceroso e do epitélio benigno (R

2X: 0,903 [cum] e Q

2: 0,624 [cum]; Figura 4A). Em contraste, OPLS-DA claramente distinguido do cancro da próstata a partir do epitélio benigno (R

2X: 0,874 [cum], R

2A: 0,735 [cum] e Q

2: 0,583 [cum]; Figura 4B) . A validação de uma análise de mínimos quadrados parciais discriminante (PLS-DA) foi sugestivo de um excelente modelo (Figura S2). Um OPLS S-trama em relação à proporção de IP no cancro e epitélio benigno é mostrado na Figura 4C. A intensidade do sinal de m /z 863,5 (PI [18: 0/18: 1]) e 889,5 (PI [18: 0/20: 2]) foram isoladas a partir do S-trama como variáveis ​​que distinguem fortemente entre o cancro da próstata e epitélio benigna. O perfil dos 14 IPs pelo OPLS-DA expressão foi usado para estabelecer um algoritmo de diferenciação com precisão a partir do epitélio do cancro benigno (Tabela S4). Usando o algoritmo com o ponto de corte definido como 0,5, a sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de câncer foram de 85,7 e 92,9%, respectivamente.

A, lote pontuação PCA mostrando a discriminação entre câncer e epitélio benigno no conjunto de descoberta . B, lote pontuação OPLS-DA mostrando uma clara discriminação entre câncer e epitélio benigno no conjunto de descoberta. C, OPLS-DA S-enredo correspondente à parcela pontuação mostrado em (B). O número ao lado de cada PI mostra seu valor m /z. D, curva ROC que mostra a capacidade do algoritmo biomarcador para distinguir do cancro da próstata a partir de epitélio benigno no conjunto de validação.

Para avaliar se este algoritmo pode ser usado no diagnóstico do cancro da próstata, os perfis de expressão do PIS foram avaliados nas amostras de conjunto de validação. Uma curva ROC calculada a partir deste algoritmo é mostrado na Figura 4D, com uma área sob a curva (AUC) de 0,964. O ponto de corte de 0,5 apresentou sensibilidade de 87,5% e uma especificidade de 91,7% em distinguir o câncer de próstata a partir do epitélio benigno.

Discussão

Lipídeos constituem diversas classes de moléculas com funções críticas em energia celular armazenamento, estrutura, e de sinalização. O risco de cancro da próstata foi mostrada para aumentar quando os ácidos gordos nomeadamente de plasma foram elevados, incluindo o ácido mirístico, o ácido a-linolénico e ácidos eicosapentanóico [22], [23]. Muitos lípidos polares individuais [24] – [27] e moléculas de colesterol, do [28], [29] têm sido associados com o desenvolvimento de cancro da próstata. No entanto, tem sido difícil de avaliar estas moléculas directamente no tecido da próstata, porque a maioria dos procedimentos de análise de lípidos, incluindo MS convencionais, exigem de extracção de lípidos. Uma ferramenta emergente, MALDI-IMS, pode proporcionar “em imagiologia in situ”, sem destruir as estruturas histológicas de materiais biológicos, e as imagens podem ser mapeadas em comparação com as correspondentes imagens histológicas [30] – [32].

Embora composto OCT é comumente usado para incorporar e preservar amostras de tecido, amostras totalmente incorporados em composto OCT foram considerados inadequados para pesquisa IMS lipídico, pois a contaminação por meio da OCT é facilmente detectado por espectrometria de massa e reduz severamente a detecção de outros componentes [19 ], [20]. Neste estudo, a FC-MALDI-IMS utilizando 9-AA como uma matriz mostraram espectros consistentes de amostras embebidas composto OCT numa gama de massa de m /z 500-1000 em modo negativo. O padrão espectral e qualidade destas amostras OCT-incorporados foram encontrados equivalentes às de amostras congeladas frescas. Este resultado pode ser importante, uma vez que as amostras congeladas são preservados em composto OCT em muitos laboratórios clínicos, permitindo a sua utilização para a pesquisa lipídica utilizando MALDI-IMS.

Nós mostramos que HR-MALDI-IMS tinha várias vantagens metodológicas comparação com estudos lipidomas convencionais em tecidos de câncer. cancro da próstata fase precoce é frequentemente multifocal e rodeado por epitélio da próstata benigna e /ou estroma, sem a formação de uma massa tumoral. Além disso, uma vez que o cancro da próstata e as glândulas constitui o diâmetro de uma única prensa pode ser tão pequena quanto 50 uM, a IMS convencional, com uma resolução superior a 50 um, pode apenas a cerca de distinguir entre tecidos cancerosos e outros. Assim, os estudos anteriores usando baixa resolução IMS não conseguiram distinguir precisamente regiões específicas do câncer de próstata a partir do epitélio benigno mesmo que rendeu potenciais candidatos [33] – [39]. High-resolution IMS pode ultrapassar este inconveniente e pode ser útil para a análise dos tecidos heterogéneos, como o cancro da próstata.

Verificou-se que a composição de IPs diferiam marcadamente no cancro da próstata e epitélio benigna, o que sugere que as diferenças no PI perfis de expressão pode resultar de diferenças nas atividades de várias aciltransferases. Estas alterações no perfil de expressão de PI podem afectar não só a fluidez da membrana celular, mas também a actividade da via de sinalização de PI3K [40] – [43]. Embora o papel preciso dos IPs específicos na sinalização de PI3K permanece desconhecida, foram relatados os níveis de expressão de IPs contendo ácidos gordos poli-insaturados para correlacionar com os de PI3-fosfato [42]. Nosso estudo era preliminar e incluiu um número relativamente limitado de amostras. Assim, continua a ser determinado se as mudanças no perfil de expressão PI e atividades aciltransferase estão correlacionados e se eles estão diretamente relacionados ao desenvolvimento do câncer de próstata

Vários IPs, incluindo PI. (18: 0/18: 1), PI (18: 0/20: 3) e PI (18: 0/20: 2) foram identificados como possíveis biomarcadores de células cancerosas da próstata. Nós especialmente focado na mudança de distribuição desta classe de moléculas, não sobre IP único, porque a função de IP é controlada por sua distribuição incompleta. A análise estatística multivariada, como a PCA ou OPLS-DA, é considerado como uma ferramenta poderosa para a avaliação holística dos estados metabólicos complexos, agrupando cada amostra, presumindo espectros adquiridos como dados multivariados [44] – [46]. O nosso algoritmo biomarcador para o cancro da próstata utilizando OPLS-DA foi capaz de distinguir regiões de cancro da próstata, mesmo no conjunto de validação, indicando que os perfis de expressão do PIS no análise FC-MALDI-IMS são potenciais marcadores para o diagnóstico do cancro da próstata.

Os perfis de expressão do PIS em tecidos de câncer não se correlacionaram com o seu valor pré-operatório PSA, pontuação de Gleason, ou estágio patológico (dados não mostrados). O número de pacientes era pequena e a maior parte das amostras de tecido foram obtidas a partir de pacientes com cancros localizados e bem ou moderadamente diferenciados. O algoritmo de classificação deverá ser verificada em uma coorte maior, incluindo controles normais e pacientes com doença mais agressiva. Além disso, as relações entre os perfis de expressão PI e os resultados clínicos ainda não foram determinados.

Nossos resultados mostram que HR-MALDI-IMS pode ser uma ferramenta poderosa descoberta de biomarcadores. O perfil dos PIs expressão pode ser um biomarcador candidato para câncer de próstata, embora este achado requer verificação em uma coorte de pacientes maior e correlação com os resultados clínicos. No geral, nossos resultados sugerem que o uso de HR-MALDI-IMS para identificar alterações moleculares de doenças específicas em amostras de tecido da próstata irá melhorar a patologia processo de tomada de decisão crítica no diagnóstico do câncer de próstata.

Informações de Apoio

Figura S1.

espectros MS /MS de espécies comuns m /z neste estudo. Os picos de ião do produto correspondendo aos grupos de cadeia acilo gordo e grupos de cabeça polares encontram-se descritos na Tabela S3. O eixo X mostra m /z. O eixo Y mostra a intensidade do sinal do espectro de massa. Abreviaturas: LPI, lysophosphatidylinositol. PA, ácido fosfatídico. PE, fosfatidiletanolamina. PI, fosfatidilinositol. Ins, inositol. SN1, ácido gordo em sn-1 posição. . SN2, ácidos graxos na posição sn-2

doi: 10.1371 /journal.pone.0090242.s001

(PPTX)

Figura S2.

Validação baseada em um modelo PLS-DA calibrado por meio de análise de permutação. Os parâmetros do modelo para a variação explicada (R

2) e a capacidade de previsão (Q

2) foram significativas (R

2X [cum] = 0,874; Q

2 [cum] = 0,535) . Os valores de ordenada para R

2 e Q

2 linhas foram 0,305 e -0,444, respectivamente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s002

(DOCX)

Tabela S1 . intensidade

Signal normarized a corrente de íons total nos 50 principais componentes detectados em amostras frescas congeladas e OCT-embedded compostos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s003

(DOCX)

Tabela S2.

m espécies /z comuns detectados entre as 100 melhores compostos em pelo menos 12 pacientes no conjunto descoberta

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s004

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Tabela S3.

Atribuição de espécies moleculares lipídicas no modo de iões negativos MS /MS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s005

(DOCX)

Tabela S4. algoritmo

biomarcador para o câncer de próstata, criada usando o conjunto de descoberta

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090242.s006

(DOCX)

Reconhecimentos

Agradecemos Koichi Tanaka, Taka-Aki Sato, e Noriko Iwamoto para ajudar na realização dos experimentos HR-MALDI-IMS e Miyuki Ono para uma excelente assistência técnica.