Sumário
O resveratrol (RV) é um componente natural do vinho tinto e uvas que foi mostrado ser um potencial agente anti-cancro e quimiopreventivo. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes anticancerígenos e quimioprotector efeitos do RV não são completamente compreendidos. Aqui, mostramos que o tratamento RV inibe o crescimento clonogénico de células de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) de um modo dependente da dose. Curiosamente, o efeito supressivo de tumor de baixo RV dose não foi associada com alterações significativas na expressão de PARP clivada e activado de caspase-3, sugerindo que a baixa dose de tratamento de RV pode suprimir o crescimento de células de tumor por meio de um mecanismo independente de apoptose. Estudos subsequentes revelaram que a baixa dose de tratamento RV induz um aumento significativo em associada à senescência β-galactosidase (SA-gal-β) coloração e elevada expressão de p53 e p21 em células NSCLC. Além disso, mostramos que a supressão induzida por RV do crescimento das células do cancro do pulmão está associada com uma diminuição na expressão de EF1A. Estes resultados sugerem que o RV pode exercer o seu anti-cancro e efeitos quimiopreventivos através da indução da senescência prematura. Mecanicamente, a senescência prematura induzida pela RV correlaciona com o aumento de DNA dupla rupturas dos filamentos (LAP) e espécies reativas de oxigênio produção (ROS) em células de câncer de pulmão. Inibição da produção de ROS por N-acetilcisteína (NAC) atenua LAP ADN induzida por RV e senescência prematura. Além disso, mostramos que o tratamento RV induz acentuadamente (Nox5) expressão NAPDH-5 oxidase em ambos os A549 e H460 células, sugerindo que a RV pode aumentar a geração de ROS em células de câncer de pulmão através upregulating expressão Nox5. Juntos, estes resultados demonstram que o baixo tratamento de dose RV inibe o crescimento de células de câncer de pulmão através de um mecanismo previamente unappreciated, ou seja, a indução de senescência prematura através de danos no DNA ROS mediada
Citation:. Luo H, Yang A, Schulte BA , Wargovich MJ, Wang GY (2013), o resveratrol induz senescência prematura em células de câncer de pulmão através de danos DNA ROS-Mediated. PLoS ONE 8 (3): e60065. doi: 10.1371 /journal.pone.0060065
editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América
Recebido: 30 de novembro de 2012; Aceito: 20 de fevereiro de 2013; Publicação: 22 de março de 2013
Direitos de autor: © 2013 Luo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH concede CA138313 e HL106451 (www.nih.gov). Este trabalho também foi apoiado em parte por uma Cancer Society Institutional Research Grant americano (# IRG-97-219-08). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que nenhum interesse competindo existem
Introdução
o cancro do pulmão é responsável por mais mortes por câncer nos Estados Unidos do que a mortalidade combinada de câncer colorretal, de mama e de próstata [1]. Mesmo com as abordagens terapêuticas avançadas mais recentes, a taxa de sobrevida global em 5 anos é inferior a 16% e não mudou significativamente ao longo de muitas décadas [1], [2]. Este mau prognóstico enfatiza a necessidade urgente para o desenvolvimento de novas estratégias para a prevenção e tratamento mais eficaz desta doença mortal. Produtos naturais (PN) são amplamente utilizados pelos americanos como medicamentos complementares e alternativas (CAM) para a prevenção e tratamento de várias doenças, incluindo cancros humanos [3], [4]. O uso de NPS como agentes antitumorais para a administração de cancros humanos é uma ideia atraente, porque eles são prontamente disponíveis e exibem pouca ou nenhuma toxicidade [3], [5] – [7]. O resveratrol (RV) é um de tais NPs e tem sido demonstrado que exibem tanto anti-cancro potenciais e quimiopreventivos [3], [8] – [10]. No entanto, os mecanismos moleculares exatos subjacentes efeito quimiopreventivo e anticancerígenos do RV não são completamente compreendidos. O objetivo deste estudo foi o de definir o papel da senescência prematura em efeitos antitumorais induzida por RV em células de câncer de pulmão.
A senescência celular é um estado de parada do ciclo celular permanente que pode ser desencadeada por uma variedade de tensões incluindo danos no DNA, o encurtamento dos telómeros e estresse oxidativo [11] – [13]. As duas principais categorias de senescência celular são senescência replicativa e senescência prematura induzida por estresse (SIPS). senescência replicativa foi descrita pela primeira vez por Hayflick e Moorhead em fibroblastos humanos, depois de células foram submetidos a replicação extensiva como consequência de passagens em série de cultura [14]. Subsequentemente, verificou-se que as células podem sofrer também SIPS em resposta a agentes que danificam o ADN, tais como radiação ionizante e agentes quimioterapêuticos anticancerígenos [11] – [13], [15]. As células submetidas a SIPS são morfologicamente indistinguíveis das células replicativamente senescentes e exibem muitas das características atribuídas à senescência replicativa, tais como o aumento da senescência associada β-galactosidase (SA-β-gal) a actividade e aumentou p53 e p21 expressão [11] – [13] , [15] – [17]. Embora o encurtamento dos telômeros foi pensado para ser a principal causa de envelhecimento replicativo, a senescência prematura pode ocorrer em um mecanismo independente de encurtamento dos telômeros telomerase- e [18], [19]. A senescência limita o tempo de vida e a capacidade proliferativa de células, por conseguinte, a indução da senescência é considerada como um importante mecanismo de prevenção do cancro [20] – [22]. Mais importante ainda, evidência emergente tem demonstrado que a senescência induzida pela terapia é um mecanismo fundamental através do qual diversos agentes anti-cancro inibir o crescimento de células de tumor [11], [12], [23]. Curiosamente, tem sido demonstrado que a senescência induzida pela terapia pode ser conseguida em doses muito mais baixas de quimioterapia do que as exigidas para induzir a apoptose, indicando que doses elevadas de agente anti-cancro pode causar apoptose, enquanto os tratamentos de baixo nível induzir principalmente a senescência em células cancerosas [12] . Comparada com as estratégias tradicionais indutora de apoptose, esta abordagem baixa dose pode reduzir significativamente os efeitos colaterais da terapia anticancro e, assim, melhorar a qualidade de vida de doentes com cancro. Portanto, é importante entender se baixo RV dose pode suprimir o crescimento de células de câncer de pulmão através da indução de senescência prematura.
RV é um composto polifenólico natural, não tóxico encontrado em abundância nas uvas, vinhos tintos, amoras e outros comestíveis plantas. Ensaios clínicos recentes têm indicado que o RV é bem tolerada e relativamente seguro para utilização em humanos [5] – [7]. RV tem sido demonstrado inibir a proliferação de uma variedade de células cancerosas através de inactivação de diferentes percursos de sobrevivência celular, incluindo a via de PI3-cinase /AKT [24]. RV, também tem sido demonstrado que exibem actividade quimiopreventiva potencial em diversos modelos de tumor induzida por carcinogénico, incluindo da mama, intestino, fígado, do esófago e do cólon [3], [25], [26]. Além disso, tem sido relatado que o tratamento de RV inibe o crescimento do cancro do pâncreas e aumenta os efeitos anticancerígenos de gemcitabina, possivelmente através da supressão da activação do NF-КB e regulação negativa da expressão de ciclina D1, a COX-2, ICAM-1, MMP-9 e survivina em tecidos tumorais [27]. Embora os estudos anteriores têm indicado que o RV, em doses elevadas, podem inibir a proliferação de células cancerosas através da indução de apoptose [28] – [31], um grande desafio para o uso deste CAM é que a concentração de VD necessária para induzir a apoptose nas células tumorais
in vitro
é grande demais para alcançar
in vivo
em um ambiente clínico [5] – [7], [32]. Dado que a indução da senescência requer uma concentração muito menor de agentes anticancro e, assim, produz menos efeitos secundários indesejados [12], procurou-se investigar se o tratamento de dose baixa RV poderia inibir o crescimento de células cancerosas através da indução da senescência prematura. No presente estudo, nós demonstram que a baixa de tratamento de dose RV leva a um aumento significativo na associada a senescência β-galactosidase (SA-β-gal) de coloração e elevada expressão de p53 e p21 em células NSCLC, sugerindo que o efeito anti-cancerígeno de RV é em grande parte atribuível à indução de senescência em células de câncer de pulmão. estudos sobre os mecanismos revelam que a senescência induzida por RV está associado ao aumento LAP ADN e produção de ROS em células de câncer de pulmão. Além disso, os nossos dados mostram também que a inibição da produção de ROS por NAC atenua DSB de ADN induzida por RV e senescência prematura. Em conjunto, esses resultados demonstram que o baixo tratamento de dose RV faz com que a senescência prematura em células de câncer de pulmão através de danos no DNA ROS mediada, que destacam uma contribuição significativa da indução de senescência para efeitos anticancerígenos da RV.
Resultados
RV inibe o crescimento de células de cancro de pulmão de um modo dependente da dose
estudos anteriores indicaram que doses elevadas de tratamento de RV pode inibir a proliferação de células de tumor por indução de apoptose [28] – [31], mas um grande desafio para esta estratégia que causam apoptose é que a concentração necessária para induzir a apoptose em células tumorais
in vitro
não está acessível
in vivo
[5] – [7], [32]. Portanto, é importante para determinar se a dose baixa de tratamento RV afecta o crescimento das células tumorais. Para este fim, nós tratamos A549 e H460 células de câncer de pulmão com diferentes doses baixas de RV (0-50 M) para examinar se o tratamento RV tem qualquer impacto sobre a formação de colónias de células NSCLC. ensaios de sobrevivência clonogénicas demonstrado que, mesmo tão baixas quanto 10 pM de tratamento RV pode suprimir significativamente a actividade de formação de colónias de células A549 e H460 (Figs. 1A, 1B e 1C). Os dados também mostram que a supressão induzida por RV de formação de colónias correlaciona-se bem com as concentrações de RV, sugerindo que o tratamento RV inibe o crescimento clonogénico de células NSCLC de uma forma dependente da dose.
ensaios de sobrevivência clonogénicos (A) mostram que o número de colónias derivadas de células cancerosas diminui com a dose de RV. (B) Os resultados de ensaios clonogénicos foram normalizados para a sobrevivência clonogénica de células A549 de controlo e são expressos como% do controlo. (C) Os resultados de ensaios clonogénicos foram normalizados para a sobrevivência clonogénica de células de controlo H460 e são expressos como% do controlo. **,
p
. 0,01 vs. controlo
RV dose baixa inibe o crescimento de células de câncer de pulmão através de um mecanismo independente de apoptose
Embora tenha sido mostrado que doses mais elevadas (100-200 uM) de tratamento de RV pode induzir a apoptose em células tumorais [28] – [31], era desconhecido se baixa dose de RV suprime o crescimento de células de cancro de pulmão através da indução de apoptose. Uma vez activada a caspase-3 e clivado da PARP são medições bem documentados de apoptose [33], [34], nós investigamos se a partir do tratamento de dose RV tem qualquer impacto sobre a expressão de PARP activada da caspase-3 e clivado em células A549 e H460. Como mostrado na Figura 2, os dados de mancha Western revelou que a baixa dose de tratamento de RV não causou quaisquer alterações significativas na expressão de PARP clivada e activado de caspase-3 em células H460 quer A549 ou. Em contraste, o tratamento camptotecina (CPT) resultou num aumento acentuado da PARP clivada e activado expressão da caspase-3 em ambas as células A549 e H460 (Figs. 2A e 2B). Estes resultados sugerem fortemente que a baixa dose de RV inibe o crescimento de células de cancro do pulmão através de um mecanismo independente de apoptose.
ensaios de Western blot (A) foram realizados para determinar a expressão de PARP activada caspase-3 clivada e em células A549. Actina foi utilizado como um controlo de carga. (B) Os ensaios de Western blot foram realizados para determinar a expressão da caspase-3 clivada e PARP activada em células H460. Actina foi utilizado como um controlo de carga.
RV induz senescência prematura em células de cancro do pulmão
Foi proposto que a indução da senescência prematura é um mecanismo importante através do qual a radiação ionizante e muitos agentes quimioterapêuticos exercem os seus efeitos anti-cancerígenos [11] – [13], [15], [17], [23]. Assim, buscou-se examinar se baixo tratamento de dose RV induz senescência prematura em células NSCLC. Uma vez que o aumento da actividade SA-β-gal é um biomarcador bem estabelecido de senescência [16], nós investigamos se a partir de tratamento de dose RV induz senescência prematura nas células A549 e H460 por coloração com SA-β-gal. Como mostrado na Figura 3A, os resultados indicam que o número de células senescentes positivos SA-β-gal é significativamente aumentada em RV-tratado versus controlo células A549 e H460. Além disso, a percentagem de SA-β-gal positivos células aumenta com a dose de RV, sugerindo que o tratamento induz RV senescência prematura em células de cancro de pulmão de um modo dependente da dose (FIGS. 3B e 3C).
coloração (A) SA-β-gal aumentada com doses RV em ambas as células A549 (painel superior) e células H460 (painel inferior). (B) A percentagem de células senescentes positivos SA-β-gal em células A549 tratadas com RV e de controlo são apresentados como média ± SEM. (C) A percentagem de células senescentes positivos SA-β-gal nas células tratadas com RV e de controlo H460 apresenta-se como média ± SEM. (D) Os ensaios de Western blot foram realizados para determinar a expressão de p53, p21 e EF1A em células A549. Actina foi utilizado como um controlo de carga. (E) Os ensaios de Western blot foram realizados para determinar a expressão de p53, p21 e EF1A em células H460. Actina foi utilizado como um controlo de carga. *,
p Art 0,05 vs. controlo; **,
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. 0,001 vs. controlo
Também examinamos os níveis de p53 e p21 expressão, dois importantes moléculas envolvidas na regulação da senescência [12], [15], [17], [35], em células NSCLC tratadas com RV. dados de transferência de Western demonstrou que os níveis de p53 e p21 foram significativamente aumentados de expressão em células tratadas com RV, em comparação com o controlo A549 e células H460 (Figs. 3D e 3E). Estes resultados sugerem que a via da p53-p21 está envolvido na senescência prematura induzida por RV em células de cancro de pulmão. Curiosamente, os nossos dados mostram também que o RV tratamento significativamente sub-regula a expressão de EF1A em células A549 e H460 (Figs. 3D e 3E), sugerindo que EF1A pode desempenhar um papel importante na regulação da senescência prematura induzida por RV em células NSCLC.
tratamento RV causa danos ao DNA e aumenta a produção de ROS em células de câncer de pulmão
Muitos agentes quimioterápicos e radiação matam as células tumorais através da indução de danos no DNA. H2AX fosforilada (γH2AX) é um marcador forte de DSB de ADN [36]. Para determinar se o dano ao DNA contribui para efeitos anticancerígenos induzida por RV, realizamos ensaios de focos γH2AX para examinar se o tratamento RV provoca LAP de DNA em células de câncer de pulmão. Como mostrado na Figura 4, os nossos dados demonstram que o tratamento de RV resulta em um aumento significativo na formação de focos γH2AX em ambas as células A549 e H460 (Figs. 4A, 4B e 4C). Como a formação de focos γH2AX é um substituto importante das DSB de ADN [36], estes resultados demonstram pela primeira vez que o efeito anti-cancerígeno de RV é atribuível, pelo menos em parte a danos no ADN induzida por RV em células NSCLC.
(A) DSB de ADN foram determinadas através de microscopia de imunofluorescência γH2AX como previamente descrito (16). imagens de imunofluorescência representativas de γH2AX focos em células A549 e H460 tratadas com RV são apresentados. (B) A percentagem de células positivas γH2AX focos detectados em células A549 tratadas com RV é apresentados como média ± SEM. (C) A percentagem de células positivas γH2AX focos detectados em células H460 tratadas com RV é apresentados como média ± SEM. (D) Os níveis de ROS foram medidas por coloração com DCF-DA e análises de citometria de fluxo às 24 horas após o tratamento de RV. Os níveis de ROS nas células A549 tratadas com RV são apresentados como a mudança de dobragem em comparação com os níveis em células de controlo. (E) Os níveis de ROS em células H460 tratadas com RV são apresentados como a mudança vezes, em comparação com os níveis em células de controlo. *,
p Art 0,05 vs. controlo; **,
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. 0,01 vs. controlo
Nós e outros demonstraram que ROS desempenham um papel fundamental na mediação de danos no DNA induzida pelo estresse genotóxico [37], [ ,,,0],38]. Portanto, temos a hipótese de que a RV pode causar DNA LAP via aumento da produção de ROS em células NSCLC. Para testar esta hipótese, investigamos se o tratamento RV tem qualquer impacto sobre a produção de ROS em células de câncer de pulmão. coloração DCF-DA e de citometria de fluxo ensaios mostraram que os níveis de ROS estavam acentuadamente aumentadas em células A549 e H460 tratadas com RV comparada com a das células de controlo (Fig. 4d e 4e). Estes resultados sugerem que RV pode induzir a senescência prematura de células de câncer de pulmão através de danos no DNA ROS mediada.
NAC atenua danos no DNA induzidos por RV e senescência prematura em células de câncer de pulmão
Embora nossos dados mostraram que o dano ao DNA induzido por RV está associada com aumento da produção de ROS em células NSCLC (Fig. 4), tem ainda a ser determinado se a inibição da produção de ROS usando antioxidantes pode prevenir danos ao DNA induzidos por RV e senescência prematura. Para este fim, as células com NAC pré-incubadas antes do tratamento RV para determinar se NAC pode atenuar a DSB de ADN induzida por RV e senescência prematura em células de cancro de pulmão. Como mostrado na Figura 5A, os nossos dados demonstram que o pré-tratamento com a NAC inibe significativamente a formação de focos γH2AX induzida por RV em células A549 e H460. Além disso, os resultados da coloração SA-β-gal mostram que a percentagem de células senescentes prematuros induzida por RV é substancialmente reduzida nas células tratadas com NAC (Fig. 5D e 5E). Tomados em conjunto, estas descobertas apoiam fortemente a hipótese de que o RV induz senescência prematura de células de cancro do pulmão através de danos de ADN mediada por ROS.
(A) DSB de ADN foram determinadas através de microscopia de imunofluorescência γH2AX como previamente descrito (16). imagens de imunofluorescência representativos de γH2AX focos em células A549 e H460 são apresentados. (B) Inibição de ROS por NAC (5 mM) diminui RV (30 uM) induzida por γH2AX focos em células A549. (C) Inibição de ROS por NAC (5 mM) diminui RV (30 uM) induzida por γH2AX focos em células H460. (D) Inibição da ROS pelo NAC atenua a senescência prematura induzida por RV em células A549. (E) A inibição da ROS pelo NAC atenua a senescência prematura induzida por RV em células H460. **,
p Art 0,001 vs. controlo.
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. 0,01 vs. RV
RV induz a expressão Nox5 em células de câncer de pulmão
Em seguida, buscou-se determinar os mecanismos pelo qual RV induz a produção de ROS em células cancerosas. Relatou-se que o aumento de AMP cíclico intracelular (AMPc) podem contribuir para acumulação de ROS mitocondrial [39]. Curiosamente, um estudo recente realizado por Park et al. demonstrou que o tratamento de RV aumenta os níveis de cAMP em células de ratinho C2C12 [40]. Para determinar se RV altera os níveis de cAMP e por sua vez induz a geração de ROS em células de câncer de pulmão, foram detectados níveis de cAMP em A549 e H460 células após diferente faz do tratamento RV. Os resultados mostram que o tratamento de EIA RV não tem nenhum efeito significativo sobre os níveis de cAMP em células A549 (Figura S1A). Mais interessante, os dados demonstram que o RV inibe os níveis de cAMP em células H460 (Figura S1B). Estes resultados sugerem que cAMP pode não ser um jogador-chave na mediação de geração de ROS induzidos por RV em células de câncer de pulmão.
As oxidases NADPH (Noxs) são uma família de enzimas transmembrana que geram superóxido e outros ROS [41] . Para entender melhor como RV induz a produção de ROS em células cancerosas, investigamos se o tratamento RV tem qualquer impacto sobre a expressão de Nox1, Nox2, NOX3, Nox4 e Nox5 em células NSCLC. resultados em tempo real de RT-PCR indicam que Nox1, 2 e 5 são abundantemente expresso em ambas as células A549 e H460, enquanto Nox 3 e 4 são apenas detectável em células de cancro do pulmão (Figura S2). Surpreendentemente, os nossos dados demonstram que o tratamento de RV aumenta selectivamente a expressão Nox5 em ambas as células A549 e H460 (Figs. 6A e 6C), sugerindo que a produção de ROS induzidas por RV em células cancerosas é provavelmente atribuível a um aumento da expressão Nox5. Dado o importante papel das enzimas antioxidantes, como superóxido mitocondrial dismutase (SOD) e tioredoxina (TXN) na modulação intracelular equilíbrio ROS [42], decidimos determinar se o tratamento RV afeta a expressão de SOD e TXN em células de câncer de pulmão. O tempo real de dados de PCR demonstram que o tratamento de RV só causa um aumento modesto (inferior a duas vezes) na expressão de SOD2 em células A549, mas não tem efeito sobre a expressão de SOD1, SOD2 e TXN ARNm em células H460 (Figs 6B. e 6D). Em conjunto, estes dados sugerem que o RV pode induzir a produção de ROS em células cancerosas através de up-regulação da expressão Nox5.
(A) células foram tratadas com 50? M de RV ou DMSO como controlo de veículo. Vinte e quatro horas após o tratamento de RV, os níveis de Nox1, Nox2, e Nox5 ARNm de expressão foram determinados utilizando em tempo real de RT-PCR. (B) Os níveis de expressão de SOD1, SOD2 e TXN em células A549 foram determinadas por em tempo real de RT-PCR. (C) Os níveis de expressão de Nox1, Nox2, e Nox5 em células H460 são apresentados como a mudança vezes (média ± SEM). (D) Os níveis de expressão de SOD1, SOD2 e TXN em células H460 são apresentados. **,
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Discussão
A senescência celular é um estado de parada do ciclo celular permanente que pode ser desencadeada por uma variedade de tensões, incluindo danos no DNA, o encurtamento dos telómeros e estresse oxidativo. A senescência limita o tempo de vida e a capacidade proliferativa de células, por conseguinte, a indução da senescência é considerada como um importante mecanismo de prevenção do cancro [20] – [22]. Mais importante ainda, evidência crescente demonstrou que a senescência induzida pela terapia é um mecanismo fundamental de acção de muitos agentes quimioterapêuticos e tratamento de radiação [11], [12], [15], [17], [23]. No entanto, a contribuição de indução de senescência para anticancerígeno de RV e os efeitos quimiopreventivos não foi bem elucidado. Aqui nós fornecemos dados experimentais que demonstrem que o baixo tratamento de dose RV inibe o crescimento de células de câncer de pulmão através de um mecanismo independente de apoptose. Os resultados revelam que o RV pode exercer a sua actividade anti-cancro e quimiopreventivos através da indução da senescência em células cancerosas. Consistente com as nossas observações, Rusin et ai. também relataram que o tratamento RV induz fenótipo senescência, como em células de câncer [43]. Esta é uma descoberta significativa pois a indução da senescência, em oposição à apoptose, requer concentração muito inferior de RV, sugerindo RV pode ser clinicamente útil. Além disso, estes estudos sublinham a importância de indução senescência na mediação quimiopreventivo de RV e os efeitos anti-cancerígenos.
Foi bem estabelecido que a indução de dano do ADN é um mecanismo central através do qual diversos agentes anti-cancro, incluindo radiação ionizante matar células tumorais [13], [15], [38], [44]. Dos vários tipos de danos no DNA, DSB de ADN são as mais citotóxicos por causa da sua grande potencial para causar a morte celular e /ou a paragem do ciclo celular. Assim, um aumento da capacidade do DNA reparação de danos nas células tumorais foi pensado para ser um importante contribuinte para terapia de resistência durante tratamentos de câncer [45]. Interessantemente, demonstrou-se que muitos dos agentes que danificam o ADN, tais como a radiação ionizante pode induzir lesões do DNA mediada por senescência prematura nas células cancerosas, sugerindo que estes agentes terapêuticos podem exercer os seus efeitos anti-cancerígenos através de ADN senescência prematura mediada por danos [13], [ ,,,0],15]. Embora os nossos dados demonstraram que o RV induz senescência prematura em células de cancro de pulmão de um modo dependente da dose, que foi em grande parte desconhecida em caso de danos de DNA está envolvido na senescência induzida por RV em células tumorais. Este estudo revelou que γH2AX focos, um importante substituto de DSB de ADN, estavam acentuadamente aumentadas em células NSCLC tratadas com RV, em comparação com células de controlo. Estes dados sugerem que a induzida por dano de DNA senescência prematura pode contribuir para os efeitos anticancerígenos de RV. Consistente com as nossas observações, verificou-se que o RV pode induzir quebras no ADN de plasmídeo na presença de Cu (II) e em condições oxidantes, [46]. Estes resultados suportam a hipótese de que o tratamento de dose baixa RV suprime o crescimento de células de cancro do pulmão através de senescência prematura induzida por dano de DNA.
A activação da via do p53-p21 por danos no ADN tem sido mostrado para ser um mecanismo fundamental subjacente SIPS [12], [15], [17], [18]. Aqui, mostramos que a senescência prematura induzida por RV está associada com aumento da expressão de p53 e p21 em células NSCLC, o que sugere que a activação da via do p53-p21 pode desempenhar um papel importante na modulação da senescência induzida por RV em células de cancro de pulmão. Mais importante, verificou-se igualmente que a senescência induzida por RV correlaciona-se bem com uma diminuição significativa na expressão EF1A em células A549 e H460. Estas novas descobertas demonstram, pela primeira vez, que a sub-regulação de EF1A está envolvido na senescência prematura induzida por RV em células de cancro de pulmão. Consistente com estas observações, um estudo recente sugeriu que a diminuição da expressão de EF1A é um biomarcador potencial de senescência prematura [47]. No entanto, serão necessários mais estudos para definir o papel exato do EF1A na modulação da senescência prematura induzida por RV em células cancerosas.
Muitos agentes anticancerígenos e radiação ionizante destruir células tumorais, em grande parte através da geração de ROS [48]. Além disso, o aumento da ROS pode provocar lesões oxidativas do ADN e causar DSB de ADN, conduzindo, assim, a senescência prematura [37]. Para determinar o papel das ROS na senescência prematura induzida por RV em células de câncer de pulmão, investigamos os níveis de ROS em A549 tratadas com RV e H460 células usando ensaios de coloração e de citometria de fluxo DCF-DA. Os dados mostram que a senescência induzida por RV está associada com o aumento da produção de ROS e DSB de ADN em células de cancro do pulmão, o que sugere que o RV pode induzir a senescência prematura em células de cancro do pulmão através de danos de ADN mediada por ROS. A contribuição importante de ROS a danos no DNA induzidos por RV e senescência prematura foi ainda confirmada pelas observações de que a inibição da produção de ROS por NAC atenua danos no DNA induzidos por RV e senescência em células NSCLC. Consistente com estas observações, foi também observado um efeito pró-oxidante do RV em células U937 de leucemia e foi caracterizado por o esgotamento de GSH e um aumento na produção de ROS [49]. Além disso, estudos anteriores por Hadi e colaboradores também mostrou que o RV pode aumentar a produção de ROS e danos no ADN induzida por ROS em linfócitos periféricos humanos [50], [51]. Juntos, estes resultados demonstram que a baixa dose de RV inibe o crescimento de células de câncer de pulmão através da indução de senescência devido a danos DNA ROS mediada.
Vale a pena notar que não há evidências de que a RV pode atuar como um eliminador de ROS em células normais para proteger contra ionizante estresse oxidativo induzido por radiação e lesão tecidual [52], sugerindo que a RV pode ter efeitos diferenciais sobre a produção de ROS em normal versus células cancerosas. Dado que os sistemas redox aberrantes são frequentemente observadas em muitas células tumorais [48], [53], [54], é possível que o RV pode suprimir selectivamente o crescimento de células tumorais com pouca ou nenhuma toxicidade para as células normais, devido à sua redox diferencial estado. De acordo com esta hipótese, os nossos dados mostram que o tratamento de RV não tem efeito significativo sobre a expressão de SOD1, SOD2 e TXN em H460 células de cancro do pulmão, apesar de ter sido relatado que o RV pode induzir um aumento substancial (mais de 6 vezes) em SOD2 expressão em células normais [55]. Mais importante, os nossos estudos demonstram pela primeira vez que a RV aumenta selectivamente a expressão Nox5 em células NSCLC, sugerindo que a RV pode induzir a geração de ROS em células cancerosas através upregulating expressão Nox5.
Materiais e Métodos
reagentes
O resveratrol (trans-3, 4 ‘, 5-trihydroxystilnene) e todos os outros produtos químicos foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e outros meios de cultura foram obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA). p53 anticorpo anti-humano de coelho e o anticorpo monoclonal de coelho anti EF1A-humana foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Danvers, MA). p21 anticorpo monoclonal anti-humano de ratinho foi obtido a partir de Santa Cruz Biotechnology. anticorpo monoclonal β-actina foi adquirido de Sigma. Um kit de coloração associada à senescência β-galactosidase (SA-β-gal) foi adquirido a Cell Signaling. O anticorpo monoclonal de ratinho anti-fosfo-histona H2AX (γH2AX) foi adquirido a partir da Millipore (Billerica, MA). reagente TRIzol e SuperScript III sistema de síntese de primeira posição foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). Cíclica kit AMP (cAMP) EIA foi comprado de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).
As linhas celulares e cultura
cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) linhas de células A549 e H460 foram adquiridos da American Type Culture Collection. As células A549 foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina e 100 microgramas /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). As células H460 foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina e 100 microgramas /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen).
sobrevivência clonogénica ensaio
ensaios clonogénicos foram realizada para determinar os efeitos do tratamento com RV-se na capacidade de formação de colónias de células NSCLC. Resumidamente, as células A549 e H460 do cancro do pulmão foram cultivadas a uma densidade baixa na presença de diferentes concentrações de RV ou DMSO como controlo de veículo em pratos de 60 mm para 10 a 12 dias, para permitir que as colónias de células formação. As colónias foram fixadas e coradas com violeta de cristal a 0,5% (Sigma) em metanol durante 30 min. O número de colónias (≥50 células) foi marcado usando um microscópio.
senescência-associado β-galactosidase (SA-gal-β) coloração
Na coloração in situ de SA-β-gal foi realizada utilizando um kit de coloração senescência β-galactosidase (Cell Signaling) como anteriormente descrito [56].
análise de transferência de Western
células A549 e H460 foram tratados com diferentes doses de RV ou DMSO como ao controle. proteínas celulares totais foram preparados 24 h após tratamento com tampão de lise celular (Cell Signaling) suplementado com um cocktail de inibidores de proteinase (Sigma). A análise Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [56]. Resumidamente, cinquenta microgramas de proteína de amostras foram resolvidas em géis de 10% Mini-Protean TGX (Bio-Rad) e transferidas para membrana de PVDF de 0,2 uM (Millipore). As manchas foram bloqueadas com leite não gordo a 5% durante 1-2 h à temperatura ambiente e depois sondadas com anticorpos primários e incubadas a 4 ° C durante a noite. Após extensa lavagem com TBS-T, as manchas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP apropriado durante 1 h a temperatura ambiente. bandas de proteínas foram detectadas utilizando um ocidental Sistema de Detecção de Blotting ECL Plus (GE Healthcare Life Science).
imunofluorescência análise microscópica de γH2AX focos
As células foram cultivadas em lâminas de câmara de 4 poços durante a noite e na próxima dia tratados com RV ou DMSO (controle do veículo). No final dos tempos desejados tratamentos, as células foram fixadas com gelada paraformaldeído a 4% durante 10 min e lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 /PBS em gelo durante 10 min. As lâminas foram bloqueadas com soro de cabra normal a 5% durante 30 min antes da incubação com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-fosfo H2AX (S139) durante 2 h a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Os núcleos foram contrastadas com DAPI.