Abstract

cromossomo 8q24 é comumente amplificado em muitos tipos de câncer, particularmente câncer de pulmão. Polimorfismos nesta região estão associados com risco de diferentes tipos de câncer. Para investigar a relação entre três polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) (rs1447295, rs16901979 e rs6983267) em 8q24 eo risco de câncer de pulmão, foi realizado um estudo de associação em duas populações Han chineses: uma população era da província de Zhejiang (576 casos e 576 controle indivíduos), ao passo que o outro era da província de Fujian (576 casos e 576 controles). Descobrimos que rs6983267 foi significativamente associada com um risco aumentado de câncer de pulmão em ambas as populações. Em comparação com o genótipo TT, o genótipo GG foi associado com uma significativa 1.555 vezes maior risco de câncer de pulmão [95% intervalo de confiança (IC) de 1,218-1,986,

P

= 4.0 × 10

-4 ]. Este efeito foi mais pronunciado em nunca fumaram [odds ratio (OR) = 2,366, IC 95% 1,605-3,488,

P

= 1,4 × 10

-5]. As análises estratificadas por histologia revelou que o genótipo rs6983267 GG foi mais associado com pacientes com outros tipos histológicos (OR = 3,012, IC 95% 1,675-5,417,

P

= 2,3 × 10

-4). O genótipo AA de rs1447295 foi associado com aumento do risco de adenocarcinoma em comparação com o genótipo CC (OR IC = 2.260, 95% 1,174-4,353,

P

= 0,015). Além disso, o genótipo GG do rs6983267 foi associada com pior sobrevida na população Zhejiang (taxa de risco (HR) = 1,646, IC 95% 1,099-2,464,

P

= 0,016). Nenhuma associação foi observada para rs16901979. Estes resultados sugerem que as variações genéticas em 8q24 podem desempenhar papéis significativos no desenvolvimento e progressão do câncer de pulmão

Citation:. Zhang X, Chen Q, Ele C, Mao W, Zhang L, Xu X, et al. (2012) Polimorfismos em 8q24 estão associadas a Lung Cancer Risk and Survival na chineses han. PLoS ONE 7 (7): e41930. doi: 10.1371 /journal.pone.0041930

editor: Georgina L. Segure, University of Aberdeen, Reino Unido

Recebido: 10 de maio de 2012; Aceito: 29 de junho de 2012; Publicação: 27 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção da Agência Taizhou Ciência e Tecnologia (111ky07-7). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte relacionada ao câncer em homens e mulheres em todo o mundo. Na China, o cancro do pulmão representaram 536,407 novos casos de cancro e 475,768 mortes registradas em 2005 [1]. Nas últimas décadas, as taxas de incidência e mortalidade do cancro do pulmão têm aumentado devido ao envelhecimento da população e aumento contínuo do consumo de tabaco na China [1], [2], [3], [4]. Embora o tabagismo é a principal causa de câncer de pulmão e contribui para mais de 80% dos casos [5], apenas uma pequena fração dos fumantes desenvolvem câncer de pulmão. Essa descoberta indica que os fatores genéticos também afetam o risco de câncer de pulmão. Embora tenham sido feitos esforços para identificar os fatores genéticos para câncer de pulmão, o conhecimento atual para avaliar o risco de cancro do pulmão continua a ser limitado.

Recentemente, alguns estudos de associação do genoma (GWAS) descobriram que variantes no cromossomo 8q24 estão relacionados para o risco de vários cancros, incluindo mama, próstata, bexiga, colo-rectal, e cancro do ovário, entre várias populações de estudo [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12 ], [13], [14], [15], [16], [17]. Além disso, as variantes em 8q24, foram encontrados para serem associados com a susceptibilidade ao cancro gastrointestinal superior [18], [19], [20], osteossarcoma [21], o cancro da tiróide [22], [23], [24], e câncer no cérebro [25]. Esta região abrange cerca de 600 kb e é considerado como uma região do gene-pobre, com relativamente poucos genes previstos, incluindo DQ486513, CB104826, e DQ515897, bem como POU5F1P1 pseudogene. O v-myc proto-oncogene mielocitomatose homólogo oncogene viral (aviária) (MYC) foi determinado a ser o gene relacionado ao câncer mais próximo da região associada com o câncer em GWAS. potenciadores da transcrição da região foram demonstradas para interagir fisicamente com o promotor MYC [26], [27] e, potencialmente, ser afetada por variantes associadas a cancro [28].

Três blocos genómicas adjacentes (regiões 1-3 ) em 8q24 têm sido associados com o risco de cancro da próstata [29]. Os polimorfismos de nucleotídeo único mais significativos (SNPs) são rs1447295 na região 1, rs16901979 na região 2, e rs6983267 na região 3 [29]. Estes SNPs e variantes 8q24 adicionais foram validadas por estudos de associação subseqüentes. Além disso, estes SNPs foram encontrados para ser associado com outros tipos de cancro [8], [9], [18], [19], [20], [21], [30]. Uma vez que a região cromossómica 8q24 é geralmente amplificado em tecidos de cancro do pulmão [31], [32], [33], [34], variantes genéticas em 8q24 pode estar associada a susceptibilidade a cancro de pulmão. Além disso, SNPs em 8q24 pode afetar os níveis de genes relacionados com o cancro [26], [27], [35], que se crê desempenhar um papel na carcinogênese do cancro do pulmão de expressão. No presente estudo, foram selecionados um SNP de cada região para avaliar a associação potencial desses SNPs com câncer de pulmão em chineses han.

Resultados

características da população

As características dos pacientes com câncer de pulmão e os controles incluídos neste estudo estão resumidos na Tabela 1. Mais homens do que as mulheres foram incluídos entre os pacientes casos e controles, mas as diferenças de sexo entre estes grupos não foram significativas (

P Art 0,05), sugerindo a sua correspondência adequada. A idade média da população era de 58,2 anos, e não foi encontrada diferença significativa na idade entre os controles e pacientes com câncer de pulmão (

P Art 0,05). tipo histológico de câncer de pulmão entre dois grupos de pacientes não diferiram significativamente (

P Art 0,05), mas diferenças significativas no estágio e grau foram detectados (todo o

P Art 0,05).

análise Associação de rs1447295, rs16901979 e rs6983267 em 8q24

as distribuições genotípicas dos SNPs rs1447295, rs16901979 e rs6983267 estavam em Hardy-Weinberg (HWE) em ambos os casos e controlos. No conjunto de teste, a freqüência do genótipo GG rs6983267 foi marcadamente maior em pacientes com câncer de pulmão (24,9%) do que nos controles (20,5%) (Tabela 2). O genótipo GG foi associado com um risco aumentado modestamente [odds ratio (OR) = 1.532, intervalo de confiança de 95% (CI) 1,090-2,153,

P

= 0,014]. Do mesmo modo, no conjunto de validação, o genótipo GG rs6983267 foi associado com um aumento de 1.591 vezes no risco de cancro do pulmão (

P

= 0,010). Apesar de não ser estatisticamente significativa, o genótipo rs6983267 GT também aumentou o risco de cancro do pulmão (

P

= 0,062). No entanto, não houve diferenças significativas entre os dois SNPs restantes (rs1447295 e rs16901979) e cancro do pulmão em ambas as populações. A análise final reunidas mostrou que o genótipo GG rs6983267 (OR = 1,555, IC 95% = 1,218-1,986,

P

= 4.0 × 10

-4) eo genótipo GT (OR = 1.311, 95% IC = 1,066-1,613,

P

= 0,01) foram associados com aumento significativo do risco de câncer de pulmão. Após os genótipos GG e GT foram combinados, a diferença manteve-se estatisticamente significativa (OR = 1,386, IC 95% = 1,141-1,684,

P

= 0,001). Além disso, as associações permaneceu significativa mesmo após a correção de Bonferroni (ou seja,

P Art 0,05 /3 = 0,0167).

conjuntos de caso-controle As análises estratificadas por histologia utilizando a reunião mostrou que o genótipo AA rs1447295, bem como o GG rs6983267 e genótipos GT foram associados com um aumento fraco, mas significativo no risco de adenocarcinoma ajustado para idade, sexo e tabagismo (OR = 2,260, IC 95% 1,174-4,353,

P

= 0,015; OR = 1,330, IC 95% 1,003-1,763,

P

= 0,048; OR = 1,327, IC 95% 1,049-1,679,

P

= 0,018, respectivamente) (Tabela 3). O genótipo rs6983267 GG foi associado com o risco de carcinoma de células escamosas (OR = 1.775, 95%

CI

1,201-2,625,

P

= 0,004). Além disso, os indivíduos com a GG rs6983267 ou genótipo GT foram significativamente em risco de outros tipos de câncer de pulmão (OR = 3,012, IC 95% 1,675-5,417 aumentou,

P

= 2,3 × 10

-4 ; OR = 1,986, IC 95% 1,157-3,408,

P

= 0,013, respectivamente), incluindo carcinoma adeno e carcinoma indiferenciado. No entanto, não foi observada associação para rs16901979.

Foram examinados ainda mais a associação entre os três SNPs e câncer de pulmão estratificada por fumar comportamento em todos os indivíduos (Tabela 4). O genótipo rs6983267 GG foi significativamente associada com maior risco de câncer de pulmão em nunca fumaram, mas nenhuma associação foi observada em antigos e actuais fumadores. Além disso, houve uma pequena, mas significativa diferença na frequência do genótipo GT rs6983267 entre casos e controles na atual-fumantes (OR = 1,446, IC 95% 1,032-2,027,

P

= 0,032). No entanto, não houve interação significativa entre tabagismo e do genótipo na suscetibilidade ao câncer de pulmão. Uma vez que o número de ex-fumantes neste estudo foi pequeno e a freqüência do genótipo rs1447295 AA foi baixa, combinamos os grupos de AA e genotípicas AC em um. análise logística revelou que AA e AC combinadas tiveram um menor risco de câncer de pulmão do que o genótipo CC (OR = 0,478, IC 95% 0,254-0,898,

P

= 0,022). Não foi observada nenhuma outra associação significativa entre rs16901979 eo risco de câncer de pulmão, estratificada por tabagismo.

Associação de rs1447295, rs16901979 e rs6983267 com a sobrevivência

Foram incluídos todos os pacientes com câncer de pulmão na análise de sobrevivência. Para rs6983267, uma associação com a sobrevivência do cancro do pulmão foi observada na população Zhejiang. Indivíduos com o genótipo GG teve um tempo médio de sobrevivência (MST) de 17,6 meses, aqueles com o genótipo GT teve uma MST de 18,6 meses, e aqueles com o genótipo TT tinha uma MST de 24,4 meses (-rank teste log,

P

= 0,036) (Figura 1A). No modelo de riscos proporcionais de Cox, descobrimos que a taxa de risco (HR) foi significativamente maior para os indivíduos com o genótipo GG comparado com aqueles com o genótipo TT depois de ajustado para idade, sexo, status, estágio do tumor, histologia e grau histológico (fumar HR = 1,646, IC 95% 1,099-2,464,

P

= 0,016) (Tabela 5). A sobrevivência era pobre especialmente para pacientes com estágio III ou IV tumor (HR = 1,993, IC 95% 1,128-3,521,

P

= 0,018) (Figura 1B). Nenhum outro SNP foi encontrado para ser associado com a sobrevivência. Nenhuma associação com a sobrevivência na população Fujian foi observada

A:. Todos os pacientes com câncer de pulmão. B:. Pacientes com tumores no estadio III-IV

Discussão

No presente estudo, examinamos se SNPs no cromossoma 8q24 relacionados à suscetibilidade ao câncer de mama, próstata, bexiga , colorectal, tireóide e câncer de ovário [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16 ], [23] também estão associados com risco de câncer de pulmão em populações chinesas Han. Descobrimos que o genótipo GG do rs6983267 foi significativamente associada com o aumento do risco de câncer de pulmão e diminuição da sobrevivência no chineses han.

8q24 aberração é um evento frequente no cancro do pulmão [31], [32], [33] , [34]. MYC, localizada em 8q24.1, é um oncogene bem estabelecida envolvida no crescimento celular, a proliferação, a diferenciação e a apoptose. a sobre-expressão desregulada de MYC é responsável por uma ampla gama de cancros humanos. O rs6983267 está localizado 335 kb a montante do gene MYC. Estudos recentes demonstraram que os mapas rs6983267 a factor de transcrição 7-like 2 (TCF7L2) motivo e formas interacções de longo alcance com MYC [27], [36]. Comparado com o alelo T do rs6983267, o alelo G foi reportado ter mais forte de ligação in vitro e in vivo TCF7L2 e para aumentar a actividade de Wnt [36], [37]. Além disso, vários estudos têm demonstrado que o genótipo GG de rs6983267 está associada com um risco significativamente mais elevado de vários cancros [9], [30], [38]. Park et ai. [20] relataram nenhuma associação entre rs6983267 (OR = 1,02,

P

= 0,80) e câncer de pulmão, mas descobriram que o genótipo GG aumentou o risco de cancro do pulmão em nunca fumantes (OR = 1,45,

P

= 0,024). Wokolorczyk et ai. [38] examinou 738 pacientes com câncer de pulmão e 1910 indivíduos controle e descobriram que o genótipo rs6983267 GG não foi significativamente associada com o risco de câncer de pulmão em comparação com o genótipo TT (OR = 0,98,

P

= 0,9). No entanto, essa associação não foi avaliada em chinês. Neste estudo, examinamos três SNPs (rs1447295, rs16901979 e rs6983267) e descobriu que apenas rs6983267 foi significativamente associada com um risco aumentado de câncer de pulmão em chineses han. Esses achados foram diferentes dos estudos anteriores em que não houve correlações significativas entre rs6983267 e câncer de pulmão [20], [38]. Uma vez que o efeito de um gene de susceptibilidade de baixo penetrância em risco de doença podem ser modificados por outros genes, bem como por factores ambientais, as diferenças étnicas na origens genéticas diferentes e factores de risco pode explicar, em certa medida, os resultados discrepantes. Além disso, rs6983267 foi mais significativamente associada a outros tipos histológicos de câncer de pulmão, seguido de carcinoma de células escamosas, e fracamente, mas significativamente associado com adenocarcinoma. Estes resultados indicaram que diferentes mecanismos possam existir na patogénese molecular dos vários tipos histológicos de cancro do pulmão.

A exposição a carcinogénios do tabaco pode induzir danos no ADN grave e, assim, promover a formação do tumor. Neste estudo, verificou-se que o aumento do risco de câncer de pulmão com o genótipo GG rs6983267 foi mais pronunciada entre os não-fumantes, ao passo que não há correlações significativas foram encontradas em observação de correntes e ex-fumantes. Uma possível explicação para isso é que nunca fumaram podem ser mais prováveis ​​de terem sido expostos a fatores de risco desconhecidos associados com o cancro do pulmão, tais como poluentes ambientais. Podem existir diferentes mecanismos de carcinogênese entre Nunca e observação de correntes /fumantes former-. Nosso resultado é diferente do estudo anterior, em que rs6983267 GG era um fator de risco em constante fumador [20]. Diferentes populações de estudo e abordagens analíticas poderia explicar os resultados contraditórios. Além disso, encontramos uma associação significativa do alelo A rs1447295 com um baixo risco de câncer de pulmão em ex-fumantes. No entanto, Park et al descobriram que esse alelo foi associado com um maior risco de câncer de fígado em todos os tempos-fumantes [20]. Uma vez que o número de ex-fumantes nessa população era muito pequeno para um estudo de associação de caso-controle, nossas conclusões sobre o alelo de rs1447295 têm mais probabilidade de falso positivo devido a múltiplas comparações. Devem ser tomadas precauções na interpretação deste resultado, embora seja estatisticamente significativa. Novos estudos com maior número de indivíduos são necessários para confirmar estes resultados.

amplificação MYC foi mostrado para ser correlacionada com mau prognóstico de pacientes com câncer de pulmão [31], [32], [34]. Uma vez que os alelos de risco rs6983267 L tem sido demonstrado que possuem uma afinidade mais forte para TCF7L2 e pode induzir uma maior expressão MYC [27], [36], rs6983267 pode ser associada com a sobrevivência em pacientes com cancro do pulmão. Neste estudo, descobrimos que rs6983267 genótipo GG foi associada com marcadamente pior sobrevida na população Zhejiang. Este efeito foi mais pronunciado em pacientes com estágio III ou IV tumor. Este resultado está de acordo com as consequências funcionais deste polimorfismo. Em contraste, não foi encontrada associação entre rs6983267 e sobrevivência na população Fujian. Parte desta disparidade pode ser explicada pelas diferentes percentagens de fase da doença e o grau histológico, bem como as diferentes abordagens de tratamento utilizados. Cicek et ai. examinou 393 pacientes com câncer de cólon e não encontrou nenhuma associação entre rs6983267 e sobrevivência [39]. No entanto, Dai et al. examinou 170 pacientes com câncer colorretal e descobriu que alelo T esteve associada com pior sobrevida [40]. Estes resultados sugerem que uma relação mais complexa ou específico de tumores pode existir. Como o nosso estudo foi limitado a chineses han com câncer de pulmão, os resultados não podem ser generalizados a outras etnias. Além disso, o tamanho da amostra para análise de sobrevida foi relativamente pequeno, levando, assim, a interpretação cuidadosa dos nossos resultados. Mais pesquisas em um grupo de população maior é necessária para esclarecer essa relação.

Em resumo, os resultados do nosso estudo sugerem que os SNPs em 8q24 estão associadas com a susceptibilidade ao câncer de pulmão na chineses han. Além disso, rs6983267 genótipo GG foi associado com pior sobrevida na população Zhejiang. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que investigou as associações potenciais entre SNPs em 8q24 e câncer de pulmão na população de East China. grandes estudos adicionais são necessários para melhorar a nossa compreensão das contribuições de fatores genéticos para câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Assuntos

Neste estudo, foi realizado um estudo de associação em dois conjuntos independentes de assuntos. O conjunto de teste incluiu 548 pacientes com câncer de pulmão e 556 controles. Os pacientes casos tinham um diagnóstico de câncer de pulmão confirmado na histologia e foram recrutados a partir Hospital Central Taizhou, Zhejiang, entre 2003 e 2010. Os indivíduos do grupo controle sem câncer foram os visitantes do hospital que vieram à clínica exame de saúde para um check-up anual entre 2007 e 2010. O conjunto de validação consistiu de 453 pacientes com câncer de pulmão e 507 indivíduos controle da província de Fujian. Os pacientes casos foram pacientes consecutivos com câncer de pulmão confirmado histologicamente matriculados a partir de Fuzhou Pulmonar Hospital entre 2008 e 2010. O controle indivíduos eram indivíduos sem câncer selecionados de um grupo de voluntários saudáveis ​​que visitaram o hospital durante o período de 2008-2010. Os dados epidemiológicos foram coletados por entrevistadores treinados que não estavam cientes dos trabalhos de grupo utilizando um questionário padronizado específico para obter informações detalhadas sobre os participantes fatores demográficos, hábitos pessoais, história médica, história familiar de câncer, bem como história de exposição ocupacional e ambiental . Os sujeitos do estudo foram classificados em três grupos com base em seu status de fumar. Nunca fumaram foram aqueles que indicaram que eles haviam fumado menos de 100 cigarros em sua vida e não foram actuais fumadores. Os fumantes foram classificados em ex-fumantes e fumantes atuais. Ex-fumantes eram aqueles que relataram fumar pelo menos 100 cigarros durante a sua vida e não eram atuais fumantes, enquanto actuais-fumantes eram aqueles que relataram que eles ainda estavam fumando no momento do seu diagnóstico de câncer de pulmão. Os indivíduos conhecidos por ter uma história familiar de câncer, foram excluídos uma história de qualquer tipo de câncer que não seja o cancro do pulmão ou câncer metástase de outros ou desconhecidas origens. Os indivíduos do grupo controle foram frequência correspondente aos pacientes casos com base no sexo e idade (± 5 anos). Todos os pacientes casos e controles eram independentes chineses Han étnicas. Este estudo foi aprovado pelos comitês de ética do Hospital Central Taizhou e Fuzhou Pulmonar Hospital e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes de entrar no estudo.

Nosso ponto final foi a sobrevivência global a partir do diagnóstico histológico inicial. Os pacientes que estavam vivos ou perdidos para follow-up foram censurados na data do último contato. Aqueles que morreram de outras causas foram censurados na data da sua morte. Além disso, os pacientes perdidos para follow-up no primeiro ano foram excluídos da análise.

A genotipagem

As amostras de sangue foram coletadas de todos os participantes do estudo. O DNA genômico foi extraído usando Universal Genomic DNA Extraction Kit versão 3.0 (Takara, Dalian, China) de acordo com o protocolo do fabricante, e as amostras de DNA foram armazenadas a -20 ° C.

Foi selecionado o mais forte single-associação SNPs a partir de cada região cromossómica: rs1447295 da região 1, rs16901979 da região 2, e a partir da região rs6983267 3. A genotipagem foi realizada por reacção de detecção de reacção de ligação em cadeia da polimerase (PCR-LDR) método. Os iniciadores foram concebidos por software de Primer 3 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm). Os três pares de iniciadores são os seguintes: 1) rs1447295: 5′-GCCTACGCCTACTCCTGGTCT-3 ‘(directo) e 5′-CTCCCAGATTTTCCCATACCC-3′ (inverso); 2) rs16901979: 5’-AGTGTGGGGTCTTTGTTGTGG-3 ‘(directo) e 5′-CAGCAGTCTCCCTGTCTTTGG-3’ (inverso); 3) rs6983267: 5’ATGAAGGCGTCGTCCAAATGA -3 ‘(avançar) e 5′- TTGGCTGGCACTGTCTGTATA -3’ (reverso). reacções de amplificação foram realizadas num volume de reacção final de 15 uL contendo 0,3 mmol /L de cada trifosfato de desoxinucleótido, 10 mmol /L de Tris-HCl, 50 mmol /l de KCl, 2 mmol /L de MgCl2, solução Q 20% (Qiagen, Hilden, Alemanha), 0,16 umol /L de cada iniciador, 10 ng de DNA genómico, e 1 U de Taq (Takara, Dalian, China). Os parâmetros dos ciclos foram: 94 ° C durante 3 min, seguido de 10 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 64 ° C durante 30 s com um C decremento 0,5 ° da temperatura de recozimento por ciclo a 72 ° C durante 30 s, seguido por 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 59 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s, e um passo de extensão final a 72 ° C durante 5 min. Após a amplificação, os produtos de PCR foram incubadas com 2 L phosophatase alcalina de camarão (Fermentas, Vilnius) e 4 U de exonuclease I (Fermentas, Vilnius) a 37 ° C durante 1 h, e depois desnaturadas a 95 ° C durante 10 min .

Os iniciadores LDR foram: 1) rs1447295: 5′-GTGCCATTGGGGAGGTATGTAAAAA-3 ‘(um iniciador específico), 5′-TTTGTGCCATTGGGGAGGTATGTAAAAC-3′ (iniciador específico C) e 5’-GTGCTATGGAAAAAAAGCAACAGGA-FAM-3 ‘(FAM comum marcado iniciador 3′-end); 2) rs16901979: 5’-TTTTTGTTAATGATTTAGCATTACTTATA-3 ‘(um iniciador específico), 5′-TTTTTTTTGTTAATGATTTAGCATTACTTATC-3′ (iniciador específico C) e 5’-TCTGGCAAATGGTATTTTTGAGATATTT-FAM-3 ‘(FAM comum marcado iniciador da extremidade 3′); 3) rs6983267: 5’-TTTTTTTTTCCTTTGAGCTCAGCAGATGAAAGG-3 ‘(iniciador específico L), 5′-TTTTTTTTTTTTCCTTTGAGCTCAGCAGATGAAAGT-3′ (iniciador específico T) e 5’-CACTGAGAAAAGTACAAAGAATTTTTTTTTTT-FAM-3 ‘(FAM comum marcado iniciador da extremidade 3’). Uma mistura contendo 7,5 pmol de cada comum LDR FAM marcado iniciador foi fosforilado numa mistura reaccional de cinase contendo 15 ul de um tampão de ligase de T4 × e 10 U de T4-cinase (Takara, Dalian, China). A mistura foi incubada a 37 ° C durante 1 h, seguido de 10 min a 65 ° C e armazenagem a 4 ° C. LDRs foram realizadas num volume final de 20 uL, incluindo 9? L de produto de PCR purificado, 1 × tampão de ligase de ADN de Taq, 250 fmol de cada iniciador LDR, 8 U de Taq ADN ligase (New England Biolabs, Beverly, Massachussets, EUA). Os parâmetros do LDR foram as seguintes: 30 ciclos de 30 s a 94 ° C e 4 min a 55 ° C. Os produtos LDR foram analisados ​​na ABI 3730 analisador de DNA (Applied Biosystems, CA, EUA).

Noventa seis selecionados aleatoriamente amostras foram reavaliados por sequenciamento de DNA para confirmar a precisão do método de genotipagem reacção de detecção PCR-ligadura, o cujos resultados foram consistentes com os genótipos identificados por sequenciação directa. Além disso, 96 amostras selecionadas aleatoriamente foram genotipados em duplicado e produziu os mesmos resultados (100% de reprodutibilidade).

A análise estatística

As médias das variáveis ​​quantitativas foram comparadas com Student

t

teste. Qui-quadrado exato de Fisher foi utilizado para comparar as variáveis ​​categóricas entre os casos e controles. HWE foi calculada pelo teste do qui-quadrado para adequação do ajustamento em dois grupos de pacientes e controle. Correcção para múltiplos testes foi realizada utilizando o método de Bonferroni. Para avaliar a relação entre 3 SNPs e o risco de cancro do pulmão, as RUP e os seus 95% CIs foram estimadas por análise de regressão logística multivariada, ajustada por idade, sexo e tabagismo, para avaliar a relação entre cada um dos três SNPs e o risco de câncer de pulmão. A análise de sobrevida foi realizada utilizando o método de Kaplan-Meier com o teste de log-rank. Cox modelos de riscos proporcionais também foram usados ​​para ajustar para a idade, sexo, tabagismo, estágio do tumor, histologia e grau histológico.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os testes foram em frente e verso, e todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS 17.0 pacote de software (SPSS Inc, Chicago, EUA).