Abstract

HER2 é sobre-expresso em 15-20% dos cancros da mama. Sobreexpressão de Her2 é conhecido por reduzir a apoptose mas os mecanismos subjacentes a esta associação permanecem obscuros. Para elucidar os mecanismos de sobrevivência mediada por receptor HER2, foi investigada a relação entre HER2 e p53 upregulated modulador da apoptose (PUMA), um indutor potente de apoptose. Os nossos resultados mostraram que interage com HER2 PUMA, que foi independente da activação de HER2. Além disso, observou-se que HER2 interagiu com PUMA tanto mitocondrial e compartimentos não mitocondriais. A seguir, analisou se HER2 fosforila PUMA. Notavelmente, a fosforilação da tirosina PUMA nunca foi relatada. Usando um ensaio intracelular, encontramos PUMA ser fosforilada em células de câncer de mama com HER2 activado. Via ensaio HER2 quinase livre de células, observou-se que PUMA foi diretamente fosforilada por HER2. A activação de HER2 diminuiu meia-vida de proteínas PUMA. Para identificar qual dos três tyrosines dentro PUMA são alvo de HER2, geramos três PUMA não-fosforilação mutantes cada um com uma única substituição de Tyr → Phe. Os resultados indicaram que cada mutante individual PUMA tinha perdido alguns, mas não todos fosforilação por HER2 indicando que os alvos HER2 todos os três tirosinas. Por conseguinte, foi criado um mutante de PUMA adicional com todos os três mutantes tirosinas (TM-Puma) que não pode ser fosforilada por HER2. Importante, TM-PUMA foi encontrado para ter uma meia-vida mais longa do PUMA. Foi observada uma associação inversa entre HER2 e PUMA em 93 amostras de carcinoma da mama invasivo. Descobrimos ainda que a MT-PUMA suprimiu o crescimento de células de cancro da mama para um grau maior do que PUMA. Além disso, TM-PUMA tinha uma propensão mais forte para induzir a apoptose de PUMA. Em conjunto, os nossos resultados demonstram, pela primeira vez, que a PUMA pode ser tirosina fosforilada e que a fosforilação mediada por proteína HER2 desestabiliza PUMA. A interação HER2-PUMA representa um novo mecanismo pelo qual PUMA é regulado e uma nova base molecular para o crescimento mediada por HER2 e sobrevivência das células cancerosas

Citation:. Carpenter RL, Han W, Paw I, Lo HW ( 2013) HER2 fosforila e desestabiliza pró-apoptóticos PUMA, levando a antagonizou apoptose em células cancerosas. PLoS ONE 8 (11): e78836. doi: 10.1371 /journal.pone.0078836

editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Agosto, 2013; Aceito: 24 de setembro de 2013; Publicação: 13 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Carpenter et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concessão K01-CA118423, e W81XWH-11-1-0600 dos Estados Unidos Departamento de Defesa, a Fundação Tumor cerebral pediátrico, a Fundação Beez e da Divisão de Intramural de Ciências cirúrgicas Dani P. Bolognesi, Ph.D. Adjudicação e Clarence Gardner, Ph.D. Award (para H-WL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As taxas de câncer de mama estão a diminuir, mas continua a ser uma ameaça significativa da saúde pública. As estimativas atuais indicam que haverá 300.000 novos casos e 40.000 mortes por câncer de mama em 2013 [1]. Estima-se que haverá mais novos casos de cancro da mama em mulheres do que qualquer outro tipo de câncer em 2013 [1]. HER2 é sobre-expresso em 15-20% dos cancros da mama humanos e este sobre-expressão está associada com os resultados dos pacientes pobres, incluindo diminuição da sobrevida global, o aumento da reincidência do tumor, e doença mais agressiva [2] – [4]. activação ocorre por heterodimerização de HER2 com outros receptores da família erbB, tais como heregulina que se ligam a HER3 que irá então heterodimerizar com HER2 para activar percursos a jusante HER2 [5].

A sobreexpressão de HER2 é conhecido por reduzir a apoptose. Pró-apoptóticos e anti-apoptóticos proteínas Bcl-2 controlar o circuito apoptótico intrínseca nas mitocôndrias. correlações positivas foram encontradas entre a expressão de HER2 e proteínas anti-apoptóticas, tais como Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-2 e [6] – [8]. Além disso, a expressão forçada de HER2 causou o aumento dos níveis de proteína das proteínas anti-apoptóticas, tais como Bcl-2 e Bcl-xL, enquanto que a inibição de HER2 reduzida Mcl-1 e uma maior expressão do Bax [6], [7], [9]. HER2 pode também activar PI3K-AKT e ERK1 /2 de sinalização, que pode regular a apoptose, controlando a expressão do gene, tais como a regulação positiva de survivina, e a regulação pós-tradução, tais como a fosforilação e inactivação de pró-apoptótica Bad [10], [11 ]. regulação HER2 de apoptose foi primariamente observado ser mediada pela sinalização a jusante enquanto a regulação direta de proteínas Bcl-2 por HER2 não foi avaliado.

O

gene PUMA

foi identificado pela primeira vez em 2001 [ ,,,0],12], [13] como uma tela para alvos de transcrição de p53. O

gene BBC3

foi identificado logo após pela levedura sistema de duplo híbrido e cDNA para este gene igualou a PUMA [14]. Esta descoberta posterior do

gene BBC3

também estabelecido que a expressão PUMA poderia ser induzida por estímulos apoptóticos independentes de p53 [14]. PUMA contém dois domínios funcionais no C-terminal, o domínio BH3 e o sinal de localização mitocondrial (MLS) [15], [16]. A actividade funcional de PUMA é iniciada pela proteína de direccionamento para a membrana externa da mitocôndria onde PUMA interage com membros da família Bcl-2, anti-apoptóticos inibindo a sua supressão de Bax e Bak [12], [17]. Inibição de anti-apoptóticos membros da família Bcl-2 conduz à activação de proteínas pró-apoptóticas Bax /Bak desencadeantes de permeabilização da membrana exterior mitocondrial (MOMP) e a libertação de citocromo C [12], [16], [17]. Citoplasmática citocromo C em última análise, a forma apoptossomo levando à activação de caspases efectoras 3/9 e apoptose. A perda de actividade PUMA tem sido associado a vários tipos de cancro. A deleção de uma porção do cromossoma 19, onde o

gene PUMA

está localizado, tem sido relatada em vários tipos de cancro [13], [18], [19]. Além disso,

PUMA

é um gene p53 e p53 induzível tem mutações em mais de 40% dos cancros do [20]. Por conseguinte, a indução PUMA prejudicada tem sido observada com a mutação p53 ou deleção [13], [21]. Além disso, as células cancerosas com a PUMA excluídos têm alta resistência a terapias de p53 induzível, tais como agentes que danificam o ADN, UV, radiação gama e entre outros [19]. No entanto, um número de estudos relataram que a expressão PUMA pode ser induzida por mecanismos independentes da p53 [19], [22] – [25].

A ligação directa entre HER2 e PUMA não foi investigado. Também é desconhecido se PUMA sofre fosforilação da tirosina. No presente estudo, nós descobrimos um novo achado que PUMA pode ser fosforilada em resíduos de tirosina directamente por HER2. Além disso, a fosforilação por PUMA HER2 leva a desestabilização PUMA e sobrevivência celular. Também mostram que um mutante PUMA que não pode ser fosforilada em resíduos de tirosina (TM-Puma) tem uma maior capacidade para induzir apoptose. Tomados em conjunto, nosso estudo revelou um romance HER2 → PUMA eixo que representa um novo mecanismo pelo qual a proteína PUMA e morte celular PUMA mediada são regulados sinalização. Nossos resultados também fornecem evidências implicando PUMA baixo regulação como uma nova base molecular para o crescimento e sobrevivência mediada por HER2.

Materiais e Métodos

Células e Cultura de Células

MDA-MB -453, MCF-7, BT-474 e SK-BR3 linhas celulares de cancro da mama humano foram obtidas de American Type Culture Collection, ATCC (Manassas, VA). As células MDA-MB-453 foram mantidas em Leibovitz L-15, meio suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) em dióxido de carbono 0%. As células MCF-7 foram mantidas em meio MEM suplementado com 10% de FBS, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, e 10 ug /ml de insulina bovina. As células BT-474 foram mantidas em meio DMEM suplementado com FBS a 10%. As células SK-BR3 foram mantidas em meio de McCoy 5A suplementado com 10% de FBS. Células MCF-7 /HER2 foram mantidas em meio MEM suplementado com 10% de FBS, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 0,1, 10 ug de insulina bovina /mL e 350 ug /ml de G418.

químicos e reagentes

Todos os produtos químicos foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO) a menos que indicado de outra forma. Ciclo-heximida foi comprado de Amresco (Solon, OH), MG132 foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA), foi adquirido a partir de anisomicina Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY), e lapatinib foi adquirido a LC Laboratories (Woburn, MA). anticorpos de tubulina, β-actina, e IgG foram adquiridos da Sigma. HA foi adquirido a partir de Roche (Indianapolis, IN), anticorpo de PARP-1 foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), anticorpo de COX IV foi comprado de Abcam (Cambridge, MA), e o anticorpo 4G10 foi comprado da Millipore ( Billerica, MA). PUMA, HER2 e fósforo-HER2 (Y1248) anticorpos foram adquiridos de sinalização celular Technologies (Danvers, MA).

Os plasmídeos

O plasmídeo pHA-PUMA foi gentilmente cedido pelo Dr. Bert Vogelstein via Addgene plasmídeo 16588 [13]. Geração de pumas mutante individual (Y58F-PUMA, Y152F-Puma, e Y172F-PUMA), bem como o mutante triplo (Y58F /Y152F /Y172F-PUMA) foi feito usando um kit QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Agilent Technologies, Santa Clara , CA) seguindo as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados para a mutagénese são os seguintes: Y58F-directo 5′-TGCCCGCTGCCTTTCTCTGCGCCCCCA-3 ‘, reverso 5′-Y58F-TGGGGGCGCAGA GAAAGGCAGCGGGCA-3′, Y152F-directo 5’-CTCAACGCACAGTTTGAGCGGCGGAGA-3 ‘, reverso 5’-Y152F-TCTCCGCCGCTCAAACTGTGCGTTGAG- 3 ‘, 5′-Forward Y172F-TCACCTGGAGGGTCCTGTTCAATCTCATCAT-3′, e Y172F-reverso 5’-ATGATGAGATTGAACAGGACCCTCCAGGGTGA-3 ‘. A mutação foi confirmada por sequenciação.

Imunoprecipitação /Transferência Western (IP /WB)

As células foram lisadas com tampão RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% NP- 40, 0,1% de SDS, 1% de desoxicolato de sódio) suplementado com inibidores de protease /fosfatase seguido por sonicação e recolha do sobrenadante. Os extractos celulares totais foram pré-limpo com IgG de coelho 1 mg e 20 uL de proteína-A-agarose durante 1 hora a 4 ° C. lisados ​​límpidos foram então incubadas com 1 ug de anticorpo IgG de coelho ou controlo de HER2 ou PUMA a 4 ° C durante a noite com agitação. Proteína A-agarose foi então adicionado e incubado a 4 ° C durante 60 minutos com agitação. pastilhas A-agarose de proteína foram recolhidos e lavados várias vezes com tampão RIPA a 4 ° C. peletes lavados foram fervidos e sujeitos a SDS-PAGE e immunoblotting tal como descrito previamente [26]. Determinação da PUMA fosforilação da tirosina foi determinada por imunoprecipitação de PUMA seguido por immunoblotting usando anti-fosfo-tirosina anticorpo 4G10 Platinum (Millipore).

livre-Cell HER2 Kinase Ensaios

proteína PUMA humana recombinante ( Origene, Rockville, MD) foi desfosforilado com proteína PTP1B humana recombinante a 30 ° C seguido de inactivação da PTP1B, a 65 ° C. Desfosforilado PUMA foi então incubado com proteína recombinante humano HER2 (Promega, Madison, WI) e ATP a 30 ° C. A amostra foi, em seguida, fervida e sujeitos a SDS-PAGE e imunotransferência utilizando anticorpos anti-fosfo-tirosina anticorpo 4G10 platina (Millipore).

Imunoprecipitação-cinase Ensaio

As células foram transfectadas com plasmídeos de PUMA marcadas com HA e os lisados ​​de células foram recolhidas como descrito acima. Imunoprecipitada foi feito com anticorpo HA, como descrito acima. Após lavagens, peletes de proteína A-agarose foram desfosforilado com PTP1B humana recombinante, seguido por incubação com HER2 humana recombinante, tal como descrito acima. As amostras foram, então, cozidos e sujeitos a SDS-PAGE e imunotransferência utilizando anticorpos anti-fosfo-tirosina anticorpo 4G10 platina (Millipore).

Ensaios de Formação de Colónias

A seguir à transfecção dos plasmídeos indicados células foram semeadas em seis placas de cultura de Bem para determinar o crescimento clonogênica dependentes de ancoragem como descrito anteriormente [27]. Após a transfecção, as células foram também semeadas em placas de 6 poços com agarose para determinar o crescimento clonogénico independente de ancoragem. Poços pré-revestidos com uma camada inferior de 0,5% de agarose e as células foram semeadas em camada superior com 0,35% de agarose. Após 2-4 semanas, as colónias com ou sem agarose foram coradas com solução de azul de violeta de cristal (Sigma) durante 1 hora e as colónias foram contadas sob um microscópio. As experiências foram realizadas em triplicado.

A avaliação da apoptose

As células foram transfectadas com os plasmídeos indicados, tratados com os compostos indicados, e colhidas com tripsina /EDTA. A apoptose foi então determinada utilizando FITC-anexina V /iodeto de propídio kit de detecção da BD Pharmingen (San José, CA) seguindo as instruções do fabricante. As células foram depois analisadas por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo BD FACSCalibur. A PARP-1 de clivagem foi determinado utilizando imunotransferência de lisados ​​de células a seguir à transfecção e tratamento indicado.

Determinação dos níveis de PUMA mitocondriais

mitocondrial fraccionamento foi realizada utilizando um kit de ensaio de Pierce /Thermo Scientific (Rockford, IL), de acordo com as instruções do fabricante como já descrito anteriormente [26]. Resumidamente, a proteína foi isolado a partir do extracto mitocondrial (ME) e o extracto não-mitocondrial (NME). O ME e NME foram então sujeitas a SDS-PAGE e imunotransferência. intensidades de bandas foram então medidas usando o software ImageJ NIH. A extensão da PUMA localização mitocondrial (Índice mtPUMA) foi calculado usando densidades de bandas com a seguinte equação:.% ME é o percentual do total ME carregado e% NME é o percentual do total NME carregado para immunoblotting

A imuno-histoquímica de amostras de tumor clínicos

As lâminas foram adquiridos a partir de US Biomax (Rockville, MD). Avaliação da intensidade HER2 (0-3 +) foi concluída por US Biomax. PUMA detecção foi realizada como descrito anteriormente [28]. As lâminas foram incubadas com anticorpo PUMA (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). pontuações histológicas (H-score) foram calculados a partir de tanto por cento de positividade (A%, A = 1-100) e intensidade (B = 0-3 +), utilizando a seguinte equação: H-Score = A × B. O teste do qui-quadrado foi utilizado para determinar relação entre a intensidade HER2 e Puma H-Score.

Análises Estatísticas

Os dados são apresentados como média ± SE. As diferenças foram determinados através de One-Way ANOVA com o teste post-hoc de Tukey ou t de Student quando apropriado. O teste do qui-quadrado foi realizado para os resultados IHC. Significância foi estabelecido em p . 0,05

Resultados

HER2 Fisicamente Associates com PUMA

Para investigar se HER2 tem qualquer interação com a PUMA, primeiro avaliado se HER2 pode interagir fisicamente com a PUMA usando imunoprecipitação /western blot (IP /WB). Nós usamos células de cancro da mama BT-474 SK-BR3 e como eles superexpressam HER2 devido à amplificação do gene HER2. Nós HER2 imunoprecipitada a partir destas células e descobriram que podia ser detectado PUMA com HER2 puxar para baixo em ambas as linhas celulares (Figura 1a). Isto indicou um romance descobrindo que HER2 interage fisicamente com PUMA. Vale a pena notar que nós não detectar uma interação entre HER2 e Bad ou Bmf, outras proteínas BH3-somente, sugerindo a interação com HER2 é específico para PUMA (Figura 1a). A seguir, avaliou se a atividade HER2 quinase foi necessário para a interação com a PUMA. Para isso, as células foram tratadas com ou sem heregulina como um meio de activar a actividade de HER2 quinase. De nota, HER2 não tem ligantes óbvias e depende de ligação a heregulina-bound HER3 para ativação; O HER3 não tem actividade de cinase [5]. Tal como mostrado na Figura 1b, de HER2 foi activada por heregulina mas esta não se alterou de forma significativa a interacção de HER2 com PUMA. As células foram então tratadas com ou sem lapatinib, que inibe a activação de HER2 [29]. Lapatinib diminuiu activação HER2, mas também não afectou significativamente a interacção de HER2 e PUMA (Figura 1C). Colectivamente, estes dados indicam que HER2 pode interagir fisicamente com a PUMA e esta interacção não é dependente da actividade da cinase de HER2.

a) e SKBR3 células BT-474 foram lisadas e a proteína total sujeitos a imunoprecipitação com qualquer IgG de controlo ou anticorpos HER2 seguido por imunotransf erência com anticorpos indicados. Os lisados ​​celulares totais foram também sujeitos a imunotransf erência com anticorpos indicados. b) as células MDA-MB-453 foram incubadas em meio isento de soro durante 16 horas seguida por tratamento com heregulina (100 ng /mL) durante 30 minutos. As células foram em seguida lisadas e a proteína total foi submetido a imunoprecipitação com, quer IgG de controlo ou anticorpos HER2 seguido por imunotransf erência com anticorpos indicados. Os lisados ​​celulares totais foram também sujeitos a imunotransf erência com anticorpos indicados. c) as células MDA-MB-453 foram incubados com lapatinib (10 uM) durante duas horas. As células foram em seguida lisadas e a proteína total foi submetido a imunoprecipitação com, quer IgG de controlo ou anticorpos HER2 seguido por imunotransf erência com anticorpos indicados. Os lisados ​​celulares totais foram também sujeitos a imunotransf erência com anticorpos indicados. d) A mitocondrial (ME) e o extracto não-mitocondrial (NME) foram isoladas a partir de células BT-474 e ambos os extractos foram sujeitos a imunoprecipitação com anticorpos indicados. ME e NME também foram sujeitos a imunotransf erência com anticorpos indicados.

PUMA localiza principalmente para a mitocôndria em que contém um sinal de localização mitocondrial [12], [16], mas PUMA também foi observado para promover a apoptose sem localização mitocondrial [15]. Além disso, HER2 está localizada principalmente na membrana plasmática mas, recentemente, tem sido encontrado para localizar a mitocôndria onde ele influencia o metabolismo celular e promove a resistência de trastuzumab [30]. Portanto, o próximo determinada onde PUMA e HER2 interagir fisicamente. Mitocondrial (ME) e os extractos não-mitocondrial (NME) foram isoladas a partir de células BT-474 e para imunotransferência α-tubulina e COX IV confirmou que houve isolamento eficaz de fracções mitocondriais e não-mitocondriais (Figura 1D). Figura 1d mostra que PUMA e HER2 foram detectados tanto na ME eo NME confirmando observações anteriores [30]. Apesar de carga de quantidades iguais de proteína (60 pg), parecia haver maiores níveis Puma e HER2 no ME do que o NME. No entanto, este desequilíbrio resulta é devido ao facto de que 60 mg é de 80% do ME colhidas mas apenas 2% do NME colhidas. Para determinar a interacção entre HER2 e PUMA, HER2 foi imunoprecipitada a partir de quantidades iguais de a ME e NME seguido por imunotransferência. Observou-se interação entre HER2 e PUMA, tanto no ME ea NME (Figura 1d). Estes são os primeiros dados que indicam HER2 interage fisicamente com PUMA e que essa interação ocorre dentro e para fora do compartimento mitocondrial.

HER2 fosforila diretamente PUMA

Após a detecção de uma interação direta entre HER2 e PUMA , o próximo determinado se PUMA pode ser fosforilada por HER2. Para o melhor de nosso conhecimento, PUMA fosforilação de tirosina não foi previamente relatado. Para avaliar primeiro se PUMA pode ser tirosina fosforilada intracelularmente, nós fome células-superexpressão de HER2 durante 16 horas e depois tratadas as células com ou sem heregulina para ativar HER2. Nós submetidos os lisados ​​celulares para IP /WB utilizando um anticorpo PUMA para IP e imunologicamente com anticorpos anti-fosfo tirosina. Tal como mostrado na Figura 2a, a PUMA tirosina-fosforilada foi facilmente detectado em células estimuladas com heregulina que expressava activados HER2 fosforilado (p-HER2). No entanto, as células MCF-7, que expressam níveis baixos de HER2, não respondeu a heregulina e não mostrou a fosforilação da tirosina PUMA significativa (Figura 2b). Em contraste, células MCF-7 com estável, forçado a sobreexpressão de HER2 (células MCF-7 /HER2) mostra a fosforilação da tirosina em resposta a PUMA heregulina (Figura 2c). Estes resultados são os primeiros a mostrar que PUMA pode ser fosforilada em resíduos de tirosina e esta ocorreu com estimulação de HER2 por heregulina.

MDA-MB-453 (a), ou MCF-7 (b), ou MCF- 7 /HER2 (c) As células foram incubadas em meio isento de soro durante 16 horas seguida por tratamento com heregulina (100 ng /mL) durante 30 min. As células foram em seguida lisadas e a proteína total foi submetido a imunoprecipitação com, quer IgG de controlo ou anticorpos PUMA seguido de imunotransf erência com anticorpos indicados. Os lisados ​​celulares totais foram também sujeitos a imunotransf erência com anticorpos indicados. -Tirosina fosforilada PUMA foi detectada com anticorpos fosfo-tirosina 4G10. PUMA proteína recombinante foi sujeito ao ensaio de quinase HER2 (tal como indicado nos Métodos Materiais ), na presença ou ausência de lapatinib (d) ou com o aumento dos níveis de proteína recombinante PUMA (e). f) recombinante foi imunoprecipitada HER2 na presença ou ausência de PUMA purificado seguido de imunotransf erência com anticorpos indicados.

próxima queria determinar se HER2 pode fosforilar directamente PUMA. Para este fim, utilizou-se proteínas de PUMA e HER2 recombinantes purificados, disponíveis comercialmente para realizar um ensaio de quinase isento de células. Como se mostra na Figura 2D, a PUMA foi fortemente fosforilada nos resíduos de tirosina, na presença de HER2. Como esperado, HER2 foram submetidos a auto-fosforilação. Na presença de lapatinib, fosforilação de HER2 foi perdido, e, consequentemente, não havia nenhuma fosforilação da tirosina de PUMA. Observou-se também um aumento dose-resposta na fosforilação da tirosina de PUMA com níveis crescentes de proteína PUMA na presença de HER2 (Figura 2E). Utilização de IP-WB, que mostram, ainda, que suspenso de HER2 recombinante também resulta em suspenso de PUMA purificada (Figura 2f), confirmando HER2 associa directamente com a PUMA no contexto do ensaio de quinase isento de células. Estes resultados mostram pela primeira vez que a PUMA pode ser fosforilada em resíduos de tirosina directamente por HER2.

HER2 fosforila PUMA em três resíduos de tirosina

Uma busca da sequência da proteína humana PUMA revelou a presença de três resíduos de tirosina, Y152, Y58 nomeadamente, e Y172 (Figura 3A). Todos os três resíduos de tirosina em PUMA foram encontrados para ser conservado em várias espécies de mamíferos (Figura 3A), indicando estes resíduos são potencialmente funcionalmente importante. Para determinar qual o resíduo de tirosina PUMA específico (s) que fosforila HER2, foi conduzida a mutagénese dirigida ao local de mutação cada tirosina (Tyr; Y) para fenilalanina (Phe; F), utilizando um vector de expressão transportando marcada com HA PUMA como molde. Fenilalanina tem o mesmo grupo R como tirosina sem o oxigénio para ligar o fosfato e, portanto, não podem ser fosforilados. Estes mutantes PUMA (Y58F-, Y152F-, Y172F-PUMA), juntamente com o tipo selvagem PUMA (WT-PUMA), foram expressos em células, imunoprecipitados utilizando um anticorpo HA-tag, e submeteu-se o ensaio de quinase HER2. Tal como mostrado na Figura 3B, a WT-puma foi fortemente fosforilada por HER2 recombinante, enquanto todos os mutantes apresentaram um baixo nível de fosforilação, indicando que todas as três podem ser tirosinas fosforiladas. Para compreender totalmente as consequências biológicas de PUMA fosforilação da tirosina que criado um mutante de PUMA adicional, um mutante triplo PUMA (TM-PUMA), em que todos os três tirosinas (Y58, Y152, Y172 e) foram mutados para fenilalanina. Utilizando o ensaio de quinase HER2 isento de células (Figura 3b), WT-PUMA mostrou bandas de fosfo-tirosina enquanto que nenhum foram detectados com TM-PUMA, indicando o TM-PUMA não é fosforilada por HER2. Para descartar a possibilidade de que TM-PUMA não pode ser tirosina-fosforilada, devido à sua incapacidade de interagir com HER2, o próximo determinado se TM-PUMA pode interagir fisicamente com HER2. IP /WB com um anticorpo HER2 (Figura 3c) demonstraram que interagiram com HER2 tanto a WT-PUMA e TM-PUMA igualmente indicando a falta de TM-PUMA fosforilação por HER2 não é devido a uma diminuição da interacção entre as duas proteínas. Tomados em conjunto, os resultados nas Figuras 2 e 3 são a primeira prova que mostra que a PUMA sofre fosforilação da tirosina de HER2 e que pode fosforilar directamente PUMA.

a) representação linear da proteína PUMA com cada tirosina, o domínio BH3, e sinal de localização mitocondrial (MLS) de domínio indicado (painel superior). Tirosinas 58, 152, e 172 na proteína PUMA é conservado em várias espécies de mamíferos, as quais são indicadas (painel inferior). b) proteína PUMA do tipo selvagem marcada com HA foi mutada de modo a que cada tirosina foi alterada para fenilalanina (Y58F, Y152F, Y172F) ou todas as tirosinas foram mutada (mutante triplo: TM). As células MCF-7 foram transfectadas com WT-puma ou cada mutante PUMA e lisado celular total foi sujeito a imunoprecipitação com, quer IgG de controlo ou anticorpos dirigidos HA. Após a imunoprecipitação, o produto foi submetido a um ensaio de quinase HER2, tal como indicado na secção de Materiais e Métodos. c) WT-puma ou TM-PUMA foram transfectados em células MDA-MB-453. As células foram lisadas e a proteína total sujeitas a imunoprecipi tacão e imunotransf erência com anticorpos indicados. lisados ​​de células inteiras também foram submetidas a immunoblotting com anticorpos indicados.

TM-PUMA tem uma meia-vida maior do que o WT-PUMA

A seguir, queria determinar se PUMA fosforilação por HER2 alteraram a estabilidade PUMA. Para este fim, foram avaliadas semi-vida da proteína usando ciclo-heximida, que inibe a síntese de proteínas que permita a detecção de quando as proteínas são degradados. Cicloheximida é um método comum para determinar a estabilidade da proteína como vários documentos relevantes têm utilizado este método nos últimos anos [31] – [34]. Assim, as células MDA-MB-453 que sobre-expressam HER2 foram tratadas com cicloheximida para até 16 horas na presença ou ausência de heregulina para activar HER2. Tal como mostrado na Figura 4a, heregulina induziu activação de HER2 nestas células e também como consequência uma degradação da proteína PUMA melhorada. Para examinar ainda mais a estabilidade da PUMA, avaliou PUMA meia-vida usando células MCF-7, que têm baixa expressão HER2, ou células /HER2 MCF-7, que têm superexpressão estável de HER2. A Figura 4b mostra que o PUMA é degradada mais rapidamente em células MCF-7 /HER2 células em comparação com células MCF-7, indicando sobreexpressão de Her2 reduz a estabilidade PUMA. A seguir, determinado se a meia-vida de TM-puma, a qual não pode ser tirosina fosforilada, que difere do de WT-puma. As células foram transfectadas quer com WT-puma ou TM-PUMA seguido por tratamento ciclo-heximida. Tal como mostrado na Figura 4C, os níveis de WT-puma diminuiu significativamente em 16 horas enquanto que os niveis de TM-puma não substancialmente diminuir. Seguindo quantificação de sinais de banda PUMA e traçando-los ao longo do tempo, descobrimos que a meia-vida para o WT-PUMA foi de aproximadamente 7 horas, enquanto que a de TM-PUMA foi mais longo do que 16 horas. Foi previamente mostrado que a PUMA pode ser orientada para o proteassoma para degradação [31]. Para determinar se a WT-puma ou TM-PUMA é regulada pelo proteassoma, foi realizada a experiência meia-vida na presença do inibidor de proteassoma MG132. Como mostrado na Figura 4D, observou-se que a WT-PUMA meia-vida pode ser alargado com a inibição do proteassoma confirmando os resultados anteriores [31]. Estes resultados sugerem que a fosforilação mediada por HER2 reduz a meia-vida de PUMA.

a) as células MDA-MB-453 foram incubadas em meio isento de soro durante 16 horas seguido de tratamento com heregulina (100 ng /ml) e ciclo-heximida (10 ug /mL). lisado celular total foi sujeito a imunotransf erência com anticorpos indicados. b) MCF-7 e MCF-7 /HER2 células foram incubadas em meio isento de soro durante 16 horas seguida por tratamento com heregulina (100 ng /ml) e ciclo-heximida (10 ug /mL). lisado celular total foi sujeito a imunotransf erência com anticorpos indicados. c, d) células MCF-7 foram transfectadas com HER2 e quer WT-PUMA ou TM-PUMA. As células foram incubadas em meio isento de soro durante 16 horas seguida por tratamento com heregulina (100 ng /ml) e ciclo-heximida (10 ug /ml) sem (c) ou com MG132 (10? M) de co-tratamento (d). lisado celular total foi sujeito a imunotransf erência com anticorpos indicados. e) as células MCF-7 foram transfectadas com WT-puma ou TM-PUMA e mitocôndrias foram isoladas. ME e NME foram sujeitos a imunotransf erência com anticorpos indicados. f) tabelas qui-quadrado para análise de amostras de cancro clínicos. Med-alta HER2 = 2-3 +. Low HER2 = 0-1 +. g) Amostra IHC imagens de amostras de cancro clínicos para alta HER2 + Baixo PUMA (caso 1) e Baixo HER2 + alta PUMA (caso 2).

A seguir, perguntou se TM-PUMA mantém a capacidade de sofrer translocalização para as mitocôndrias, onde PUMA promove a apoptose. Assim, WT-puma ou TM-PUMA foram transfectados em células seguido por isolamento do ME e NME imunotransferência com subsequente. Como a Figura 4e indica, TM-PUMA reteve a capacidade de submeter a localização mitocondrial. Além disso, observou-se maiores níveis de TM-PUMA em comparação com WT-PUMA no ME, o que foi confirmado pelo cálculo do Índice mtPUMA (ver Materiais e Métodos), resultando em 3,3 vezes mais TM-PUMA na mitocôndria do WT-PUMA. Um maior nível de TM-puma na mitocôndria é provavelmente o resultado de estabilidade proteica melhorada da proteína TM-puma na presença de HER2. Em conjunto, estes dados mostram que a estabilidade da proteína PUMA é diminuída com a activação HER2 e bloqueando a fosforilação de tirosina PUMA melhora a estabilidade PUMA e resulta em maiores níveis mitocondriais de PUMA.

Para avaliar se esta relação é mantida

In vivo

, foi realizada imuno-histoquímica em um conjunto de amostras de cancro clínicos (n = 93) para detectar HER2 e PUMA. Depois de marcar, dividimos as amostras em baixo HER2 (0-1 + intensidade) ou de médio a alto HER2 (2-3 + intensidade). PUMA foi dividida em alta PUMA (ou ≥150 H-Score ou ≥100 H-Score) ou baixa PUMA (ou 150 H-Score ou 100 H-Score). Em seguida, realizaram uma análise qui-quadrado para determinar a relação entre HER2 e expressão PUMA (Figura 4F). A análise de qui-quadrado usando barreira PUMA (150 H-100 H ou Pontuação Pontuação-) resultou em significância estatística (p = 0,045 e p = 0,027, respectivamente). Estes dados sugerem que os tecidos com alta expressão de HER2 tendem a ter menor expressão PUMA

in vivo

(Figura 4 g) apoiar os nossos dados a partir de linhas celulares que HER2 pode regular negativamente a expressão PUMA.

TM-PUMA tem um efeito mais forte do que o WT-PUMA na supressão do crescimento clonogênica

Figura 4 indicaram que TM-PUMA tiveram maior estabilidade da proteína e níveis de proteína maiores nas mitocôndrias, o que pode indicar que a MT-PUMA tem uma maior capacidade para promover a apoptose . Para examinar o efeito do TM-PUMA sobre a viabilidade celular, que expressa um vector vazio, WT-PUMA ou TM-PUMA em duas linhas celulares de cancro da mama HER2-superexpressão diferentes, ou seja, BT-474 (Figura 5e) e MDA-MB-453 (Figura 5F) células, e monitorizada a capacidade destas células para formar colónias.