Abstract

O objetivo do estudo foi investigar o padrão de expressão e significado clínico-patológico de TRIM24 em pacientes com não-pequenas cancro do pulmão (NSCLC). O perfil de expressão de TRIM24 NSCLC em tecidos e tecidos pulmonares não cancerosas adjacentes foi detectado por imuno-histoquímica. TRIM24 foi encontrado para ser sobre-expresso em 81 de 113 (71,7%) amostras de câncer de pulmão humano e correlacionados com o estágio p-TNM (p = 0,0006), falta de diferenciação (p = 0,004), índice de Ki67 (p 0,0001), ciclina D1 ( p = 0,0096) e a expressão de p-Rb (p = 0,0318). Além disso, esgotando expressão TRIM24 por pequeno ARN interferente inibiu o crescimento e invasão em linhas celulares de pulmão. Além disso, a depleção induzida TRIM24 paragem do ciclo celular G1 na fronteira /S e a apoptose induzida. análise de transferência de Western revelou que knockdown de TRIM24 diminuiu os níveis de proteína da ciclina A, ciclina B, ciclina D1, ciclina E e P-Rb e o aumento da expressão P27. Estes resultados indicam que TRIM24 desempenha um papel importante na progressão NSCLC

citação:. Li H, Sun G, Tang Z, G Fu, Xu Y, Z Li, et ai. (2012) sobre-expressão de TRIM24 se correlaciona com a progressão do tumor em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (5): e37657. doi: 10.1371 /journal.pone.0037657

editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Índia |

Recebido: 02 de janeiro de 2012; Aceito: 23 de abril de 2012; Publicado em: 30 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das principais causas de tudo mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo e a incidência de câncer de pulmão está a aumentar [1], [2]. Maioria dos casos diagnosticados de câncer de pulmão são cancros do pulmão de pequenas células não-(NSCLCs). Embora três modalidades terapêuticas (ressecção cirúrgica, quimioterapia e radioterapia) foram estabelecidos, a sobrevivência a longo prazo para pacientes com câncer de pulmão ainda é geralmente pobres [3]. Uma variedade de complexo genética, epigenética, e factores micro-ambientais desempenham um papel importante na sobrevivência e colonização de células tumorais em novos locais [4], [5]. Uma melhora na compreensão dos processos moleculares envolvidos na carcinogênese pulmonar levou a novas opções de tratamento com pequenas moléculas e vacinas direcionados demonstrando incentivar potencial. Portanto, definir melhor a patogênese do câncer de pulmão, procurando biomarcadores úteis, e explorar novos alvos terapêuticos são tarefas exigentes.

TRIM24 foi originalmente chamado de fator de transcrição intermediário 1-alfa (TIF1α), que foi identificado como um co -regulator de retinóide sinalização [6] – [8]. expressão aberrante de TRIM24 pode promover o desenvolvimento do tumor por mecanismos múltiplos. TRIM24 é um alvo de translocações cromossómicas para formar proteínas de fusão oncogénicos na leucemia promielocítica aguda, carcinoma da tiróide papilar e síndrome mieloproliferativa [9] – [11]. TRIM24 poderia ubiquitylate e negativamente regular os níveis de p53, o que fez TRIM24 um alvo terapêutico para restaurar a supressão do tumor de p53 [12]. TRIM24 também se liga ao receptor da cromatina e estrogênio para ativar genes estrogênio dependentes que foram associadas com a proliferação celular e desenvolvimento do tumor [13], [14]. expressão elevada de TRIM24 poderia promover a progressão do câncer de próstata e negativamente correlacionada com a sobrevivência de pacientes com câncer de mama [14], [15]. Estes achados sugerem que TRIM24 era um oncogene no desenvolvimento do tumor. No entanto, estudos recentes mostraram que a perda de TRIM24 em ratos levou ao desenvolvimento de carcinoma hepatocelular e TRIM24 interagiu com TRIM28 e TRIM33 para formar complexos reguladores que suprimiram carcinoma hepatocelular murino, sugerindo o seu papel como um supressor tumoral no carcinoma heptocellular [16]. Além disso, a calcificação arterial e expressão de alvos de receptores de vitamina D foram aumentados em ratinhos sem TRIM24, mostrando que TRIM24 poderia prevenir a calcificação das artérias, diminuindo a actividade da via de sinalização da vitamina D [17]

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A expressão de proteínas ainda não foram examinadas de TRIM24 em câncer de pulmão primário e sua relação com fatores clínico-patológicos. Além disso, os papéis biológicos de TRIM24 em células de cancro do pulmão não são ainda claras. A fim de abordar as questões acima, examinamos a expressão TRIM24 in-não-pequenas células do cancro do pulmão tecidos por imuno-histoquímica. Além disso, nós também explorou a associação de TRIM24 com a proliferação e capacidade de invasão em várias linhas celulares de cancro do pulmão.

Resultados

A superexpressão da proteína TRIM24 nas células não pequenas do pulmão Cancer tecidos

Foi analisada a expressão de TRIM24 em 113 espécimes NSCLC e seus correspondentes tecidos normais por imuno-histoquímica. TRIM24 expressão foi observada em compartimentos nucleares de células de tumor (Figura 1 C-L), enquanto o epitélio brônquico normal e exibiram pneumócitos negativo ou baixa coloração (Figura 1 A, B). A intensidade de coloração do epitélio respiratório normal adjacente ao tumor pode ser avaliada em várias secções que contêm tumores malignos e tecidos normais da mesma corrediça. Enquanto que nenhum de coloração fraca para TRIM24 foi detectada nos tecidos pulmonares normais, uma forte coloração de TRIM24 foi detectado em células tumorais adjacentes (Figura 1 C). Foi investigada a relação entre a expressão TRIM24 total e os parâmetros clínicos. Como mostrado na Tabela 1, não foi encontrada diferença estatística entre a sobreexpressão TRIM24 e as características de idade (p = 0,4697), sexo (p = 0,1814), o estado do tumor (p = 0,1812), estatuto nodal (p = 0,0825) e tumoral tipo (p = 0,6327). No entanto, os pacientes com expressão elevada TRIM24 mostraram fraca diferenciação (p = 0,004) e tinha avançado estágio de NSCLC (I vs II + III + IV, p = 0,0006). Foi examinada a expressão de Ki-67 para investigar a relação entre a positividade TRIM24 e atividade proliferativa de tecidos de câncer por imuno-histoquímica. Os casos que tinham níveis elevados de expressão TRIM24 tendiam a ter elevado índice de proliferação indicado por Ki-67 rotulagem (p 0,0001). A análise por imunofluorescência dupla foi realizada e de co-localização de Ki-67 e TRIM24 foi observado (Figura 2A, B). A imunocoloração de p53, receptor alfa do ácido retinóico (RARa), ciclina D1, p-Rb, e p27 foram também realizados e sua associação com a expressão TRIM24 foi analisado (Figura 2 C-H). Como mostrado na Tabela 1, TRIM24 superexpressão correlacionada com alta ciclina D1 (p = 0,0096) e p-Rb expressão (p = 0,0318), enquanto que não foi encontrada diferença estatística entre a sobreexpressão TRIM24 e p53 (p = 0,9028), RARa (p = 0,1025) e status p27 (p = 0,6335).

A. coloração negativa no epitélio brônquico normal no tecido pulmonar não-cancerosas. B. coloração negativa em pneumócitos normais nos alvéolos de tecido pulmonar não-cancerosas. C. TRIM24 imunocoloração foi negativo em epitélio brônquico adjacente ao adenocarcinoma de pulmão. D. TRIM24 negativo coloração em um caso de Stagel, moderadamente diferenciado carcinoma de células escamosas. E. coloração negativa em Stagel, bem diferenciadas adenocarcinoma do pulmão. coloração F. positiva TRIM24 em um caso de Estágio II, carcinoma de células escamosas pouco diferenciado. coloração G. positiva TRIM24 em um caso de Fase III, adenocarcinoma moderadamente diferenciado. H. Controlo negativo utilizando imunoglobulina de coelho.

imunofluorescência mostrou co-localização de TRIM24 e Ki-67 no adenocarcinoma (A) e carcinoma de células escamosas (B). coloração imuno-histoquímica para TRIM24 (C) e RARa (D), cyclinD1 (E), p-Rb (F), p27 (L) e p53 (H) coloração no caso de um NSCLC.

TRIM24 depleção inibe a proliferação, invasão e induz a apoptose em linhas celulares de cancro de pulmão

Expressão de TRIM24 foi analisado por western blot num painel de linhas celulares de cancro de pulmão (Figura 3). Encontrámos o nível de expressão em células H1299 TRIM24 e A549 foi mais elevada do que outras linhas celulares. Uma vez que o papel de TRIM24 está intimamente associada com a p53 e RARa em alguns tipos de tumor, também examinámos a expressão de p53 e RARa em linhas celulares de cancro do pulmão. Não houve associação óbvia entre esses fatores. A fim de explorar a função biológica de TRIM24 no cancro do pulmão, foram empregados siRNA para knockdown expressão TRIM24 tanto H1299 e linhas de células A549. siRNA específico-TRIM24 reduzida consideravelmente tanto ARNm, bem como os níveis de expressão de proteína TRIM24 após 48 horas de tratamento de siARN (Figura 3). A nossa análise de proliferação celular demonstraram que o esgotamento de TRIM24 em H1299 e células A549 levou a uma redução significativa da taxa de proliferação celular (A549 redução de 39% no dia 5, p 0,05; redução H1299 23% no dia 5, p 0,05) e números de focos bem como tamanhos (controlo A549 vs TRIM24si: 400 ± 38 vs 130 ± 20, p 0,05; H1299 de controlo vs TRIM24si: 235 ± 25 vs 85 ± 18, p 0,05), sugerindo que TRIM24 modula a proliferação do cancro do pulmão células (Figura 4). Análise do ciclo celular mostrou que em células knockdown TRIM24 a percentagem de S e fase G2 foi muito mais baixo do que as células de controlo e a percentagem de fase G1 foi aumentada (Figura 5A). Assim TRIM24 knockdown inibiu a progressão do ciclo celular.

A. Os níveis de expressão de TRIM24, p53 e RARa foram analisados ​​por Western blot num painel de linhas celulares de cancro de pulmão. blot B. ocidental de TRIM24 eficiência esgotamento em células cancerosas. analisa C. PCR em tempo real de TRIM24 eficiência esgotamento em células cancerosas.

A. ensaio de MTT foi realizado depois de tratamento TRIM24 siARN. Observou-se uma redução da absorção (p 0,05 no dia 5 para ambos A549 e H1299). B. Avaliação de potenciais clonogénicas das células cancerosas com depleção de TRIM24. Números de colónias foram contadas. O número de colónias formadas pelas células tratadas com siRNA TRIM24 era muito menos do que a de células de controlo (p 0,05). Colunas, quer dizer; Barras, DP. * P . 0,05

A percentagem de fase G1 foi aumentada em células com TRIM24 knockdown (H1299 e A549, p 0,05), ao passo que as percentagens de fase S (H1299, p 0,05) e fase G2 (H1299 e A549, p 0,05) foram reduzidas nestas células em comparação com células de controlo (a). TRIM24 knockdown também induziu apoptose em células A549 e ambas as linhas de células H1299 (B, P 0,05). * P . 0,05

Além disso, anexina V kit foi utilizado para caracterizar a função de morte de células H1299 e A549 com TRIM24 knockdown (Figura 5B). Claramente, uma população significativa de apoptose precoce e tardia (H1299: 7,22%; A549: 10,45%) foi observada em células com TRIM24 knockdown em comparação com controles de encriptação (H1299: 3,76%; A549: 8,43%), demonstrando que TRIM24 resultados knockdown no a apoptose das células de cancro do pulmão, especialmente em células H1299 que têm uma expressão elevada TRIM24 endógena.

para determinar se TRIM24 contribui para a invasão de células não-pequenas de cancro do pulmão de células, foram realizados ensaios de invasão de Matrigel. Como mostrado na Figura 6A, TRIM24 invasão celular knockdown inibida (controlo A549 vs TRIM24si: 91 ± 15 vs 68 ± 11, p 0,05; H1299 controlo vs TRIM24si: 62 ± 4 vs 38 ± 8, p 0,05).

tratamento TRIM24 siRNA têm um efeito de bloqueio mensurável sobre a invasão celular em ambas as linhas celulares. Os números de células invasoras sobre a superfície inferior do filtro foram contadas, foi observada uma diferença significativa (A, P 0,05). Colunas, quer dizer; Barras, DP. Não houve alteração significativa dos níveis de MMP2 e MMP9 expressão após TRIM24 knockdown (B). * P . 0,05

Para explorar melhor os mecanismos pelos quais TRIM24 promove a invasão de células NSCLC, exploramos a expressão de MMP-2 e MMP-9 de expressão, antes e após transfecção de siRNA. Como mostrado na Figura 6B, os níveis de ARNm de MMP-2, MMP-9 foram examinados por quantitativo em tempo real de RT-PCR. No entanto, não observamos mudanças notáveis ​​de sua expressão.

O esgotamento dos TRIM24 subregulado CyclinA, B, D1 e E Expressão e P27 upregulated em células de câncer de pulmão

O ciclo celular foram realizadas análises em as células cancerosas, com ou sem TRIM24 knockdown, e descobriram que a percentagem da fase G1 foi aumentada em células com TRIM24 knockdown, ao passo que a percentagem da fase S foi diminuída nestas células em comparação com células de controlo (Figura 5). Estes resultados indicam que a depleção de TRIM24 induz a paragem do ciclo celular em G1 /S limite. Além disso, a proporção de células em fase G2 foi diminuída. Para investigar o mecanismo subjacente a paragem do ciclo celular, testou-se o efeito do knockdown TRIM24 sobre ciclina A, ciclina B, ciclina D1, ciclina D3, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6, P-Rb, os níveis de P21 e P27. Como mostrado na Figura 7A, a análise de transferência de Western revelou que knockdown de TRIM24 diminuiu os níveis de proteína de Ciclina A, B, D1, E, p-Rb e aumento da expressão de P27. Juntos, estes resultados sugerem que a inibição da expressão TRIM24 induz a paragem do ciclo celular na transição G1-S e suprime o crescimento de células de cancro de pulmão. Para medir directamente a actividade transcricional de p53, um plasmídeo repórter de luciferase responsivo p53 foi utilizada para examinar a relação entre TRIM24 e actividade da p53 em linhas celulares de cancro do pulmão. Não houve qualquer alteração significativa da actividade de p53 celular após TRIM24 knockdown (Figura 7B).

análise de Western blot de uma série de factores relacionados com o ciclo celular mostraram os níveis de proteína de Ciclina A, B, D1, E e P- Rb foram diminuídas e expressão de P27 foi aumentada após o silenciamento TRIM24 em H1299 e as células A549 (a). Não houve alteração significativa da actividade da luciferase p53 após o tratamento siRNA em ambas as linhas celulares (B).

Discussão

Up-regulação da expressão TRIM24 tinha sido implicado em vários cancros humanos tais como leucemia promielocítica aguda, carcinoma de tireóide papilar e câncer de mama [9] – [11], [14]. Além disso, TRIM24 superexpressão correlacionada com a sobrevivência de pacientes com câncer de mama [14], [15]. No entanto, o padrão de expressão de TRIM24, bem como a sua correlação com fatores clínicos e patológicos ainda não foi definido no cancro do pulmão humano. Neste estudo, foi demonstrado que a expressão da proteína TRIM24 em tecidos de cancro de pulmão era maior do que na correspondente tecidos pulmonares normais. Houve uma correlação estreita entre TRIM24 up-regulação e estágio pTNM e diferenciação.

Uma pesquisa anterior sobre o seu padrão de expressão mostraram que TRIM24 foi sobre-expresso em cancros da mama em ambos os níveis de mRNA e proteína e sua sobre-expressão foi correlacionada com a ER, estatuto PR e mau prognóstico [15]. Nosso estudo encontrou uma correlação entre TRIM24 superexpressão e estágio pTNM e pobres diferenciação no cancro do pulmão, o que estava de acordo com os dados anteriores, sugerindo TRIM24 pode desempenhar um papel importante na progressão do câncer de pulmão. Para validar o papel potencial da TRIM24 no desenvolvimento do câncer de pulmão, se checar seu nível de expressão em várias linhas celulares e pegou A549 e H1299 com nível relativamente elevado TRIM24 para um estudo mais aprofundado. Nós empregamos siRNA para knockdown expressão TRIM24 nestas duas linhas celulares. Encontramos uma capacidade de proliferação e colônia capacidade formação deficiente de ambos A549 e as células H1299 após TRIM24 knockdown. Além disso, o ensaio de invasão de Matrigel mostraram diminuição invadindo capacidade das células tratadas siARN. Assim, o nosso estudo sugere que TRIM24 funcionava como um oncogene no desenvolvimento do câncer de pulmão.

Relatório anterior indicou que TRIM24 pode p53 diretamente ubiquitinar e negativamente regular o nível de proteína p53 em linhas celulares de cancro da mama, o que implica o seu papel na proliferação e apoptose [12]. A maioria dos factores de crescimento de células proliferativas influenciar por acção sobre a progressão do ciclo celular. Então, usamos a análise do ciclo celular e descobriram que as células knockdown TRIM24 apresentaram níveis mais elevados de fase G1 e inferior fase S do que as células de controlo. Assim TRIM24 G1 knockdown inibiu a S transição na progressão do ciclo celular, o que pode explicar o mecanismo de TRIM24 na proliferação de células do cancro do pulmão. TRIM24 knockdown também induziu apoptose em células H1299 e A549, que pode, parcialmente, devido ao bloqueio da transição G1 /S. Além disso, mostrámos que TRIM24 ARNip bloqueado invasão celular. Para explorar ainda mais o mecanismo, nós exploramos a expressão de MMP2 relacionadas com a invasão e MMP9. Não foram observadas mudanças notáveis ​​a estas moléculas. Pode-se argumentar que há outros aspectos funcionais do TRIM24 que contribuem para o regulamento, que precisa de uma investigação mais aprofundada.

Para descobrir o mecanismo potencial de TRIM24 na regulação do ciclo celular, que examinou o efeito de TRIM24 knockdown em um número de moléculas relacionadas com o ciclo celular. Nós verificamos a expressão de cyclinA, B, D1, D2, D3, E, H, CDK2 /4/6, p-Rb, p21 e P27. Nós descobrimos que os níveis de cyclinA, B, D1, E e P-RB foram diminuiu após TRIM24 knockdown, enquanto que o nível de expressão de P27 foi elevada. A ciclina D1 interage com Cdk4 /6 para formar um complexo de fosforilação de Rb, que regula a proliferação celular por meio do controle a progressão através do ponto de restrição na G1-fase do ciclo celular [18]. A ciclina D1 foi sobre-expresso numa variedade de cancros e associada com a proliferação de células de cancro [19] – [21]. A ciclina A é necessária para que as células progridem através da fase S [22]. A ciclina B é uma ciclina mitótica e a sua acumulação única se encontra na zona de transição G2-M [23]. O supressor de tumor p27 proteína actua como um inibidor da progressão do ciclo celular. Em associação com complexos CDK2, P27 serve para inibir a actividade de quinase e da progressão através do bloco G1 /S [24], [25]. Assim, a nossa resultados que apresentavam menor nível de ciclina A, B, D1, E, p-Rb e aumento de proteína p27 correlaciona com o facto de diminuição do nível de S e as células em fase G2 e aumento das células em fase G1 após TRIM24 knockdown, sugerindo TRIM24 desempenha um importante papel no controle do ciclo celular de células de câncer de pulmão. Além disso, a sobre-expressão TRIM24 foi associada com altos níveis de ciclina D1 e p-Rb em espécimes de cancro do pulmão.

Alguns dados mostraram que o papel de TRIM24 foi associado com p53 e o receptor alfa do ácido retinóico. Nós examinamos esses dois fatores em amostras clínicas e linhas celulares. No entanto, não encontramos relação significativa entre TRIM24 e esses fatores. Além disso, não foi observada nenhuma alteração evidente da actividade de p53 celular após TRIM24 knockdown em A549 (p53 de tipo selvagem) e linhas de células H1299 (p53 null) utilizando o sistema repórter de luciferase, sugerindo o papel de TRIM24 na regulação do ciclo celular era independente da actividade de p53.

em conclusão, o presente estudo investigou o padrão de expressão e significado clínico-patológico de TRIM24 em NSCLC e dirigiu-se ao papel biológico e potencial mecanismo de TRIM24 na progressão do câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

pacientes e espécimes

Este estudo foi realizado com a aprovação do conselho de revisão institucional local na China Medical University. 113 casos de amostras de NSCLC foram obtidos a partir do primeiro hospital afiliado da China Medical University durante o período de 2007 a 2009. O diagnóstico histológico e grau de diferenciação dos tumores foram definidos pela avaliação das secções de tecido hematoxilina e corados-eosina, de acordo com as diretrizes da Organização Mundial de Saúde de classificação. Todos os 113 espécimes foram reavaliados em relação aos seus subtipos histológicos, estado de diferenciação, e os estágios tumorais. Para amostras de NSCLC, carcinoma de células escamosas e adenocarcinoma foram identificados em 42 e 71 dos 113 casos, respectivamente. Metástases linfonodais foram observadas em 46 pacientes. O sistema taging p-TNM da União Internacional Contra o Câncer (7th Edition) foi utilizada para classificar as amostras como estágios I (n = 49), II (n = 35), III e IV (n = 29).

linhas celulares

NHBE, A549, linhas de células H1299, H157, H460, H1299 e foram obtidos de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). SPC, LTE e LK2 linhas celulares foram adquiridos a partir de Xangai Cell Bank da Academia Chinesa de Ciências. linha de células BE1 foi um presente do Dr. J Zheng (Departamento de Patologia da Universidade de Pequim, Pequim). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina (Sigma, St. Louis, MO, EUA), e 100 ug /ml de estreptomicina ( Sigma). As células foram cultivadas em placas de cultura de tecidos estéreis e foram passadas a cada 2 dias, utilizando 0,25% de tripsina (Invitrogen).

A imuno-histoquímica

espécimes de tumores excisados ​​cirurgicamente foram fixadas com 10% de formalina neutra, embebidos em parafina e foram preparadas 4 mm de espessura. A imunocoloração foi realizada utilizando o método do complexo avidina-biotina peroxidase (Ultra Sensível TM, Maixin, Fuzhou, China). Os cortes foram desparafinados em xileno, re-hidratadas em série de álcoois graduados e fervidas em tampão de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 2 minutos numa autoclave. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando peróxido de hidrogénio (0,3%), que foi seguido de incubação com soro de cabra normal para reduzir a ligação não específica. As secções de tecido foram incubadas com anticorpo policlonal TRIM-24 de coelho (diluição 1:150) (Proteintech, Chicago, IL, EUA). Imunoglobulina de coelho foi usado como controlo negativo. colorações do Ki67 (1:200 diluição) (Maixin, Fuzhou, China), RARa (1:200 diluição) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), p53 (1:200 diluição) (DO-7, Santa Cruz Biotechnology), ciclina D1 (1:100 diluição) (tecnologia de sinalização celular, Boston, MA, EUA), p-Rb (1:200 diluição) (tecnologia de sinalização celular, Boston, MA, EUA) e p27 (1: foram também realizados 150 de diluição) (Santa Cruz Biotechnology). Coloração para todos os anticorpos primários foi realizada à temperatura ambiente durante 2 horas. IgG de soro de cabra anti-ratinho biotinilado, IgG de cabra biotinilado anti-soro de coelho (pronto a utilizar) (Maixin, Fuzhou, China) foi usado como o anticorpo secundário. Após a lavagem, as secções foram incubadas com conjugado de peroxidase de rábano-estreptavidina-biotina, seguido de 3, 3′-tetracloridrato de diaminobenzidina a desenvolver a reacção de peroxidase. Contracoloração das secções foi feito com hematoxilina, que foram então desidratadas em etanol antes da montagem.

Dois investigadores independentes examinaram todos os slides tumorais aleatoriamente. Cinco pontos de vista foram examinados por lâmina, e 100 células foram observadas per view em 400 × ampliação. Imunocoramento TRIM24 foi marcado seguindo uma escala semi-quantitativa, avaliando em áreas tumorais representativas, a intensidade ea porcentagem de células que mostram imunocoloração maior do que as células controle. coloração nuclear de células tumorais foi considerado como imunocoloração positiva. A intensidade da coloração nuclear TRIM24 foi também pontuada como 0 (sem coloração), 1 (fraca), 2 (marcado). contagens percentuais foram designados como 1- 1-25%, 26-50% 2-, 3- e 4- 51-75% 76-100%. Os escores de cada amostra de tumor foram multiplicados para dar uma pontuação final de 0-8 e a expressão total de TRIM24 foi determinada como qualquer expressão negativa ou baixa (-): pontuação 4 ou superexpressão (+): pontuação ≥4. A coloração imuno-histoquímica para o Ki-67 foi avaliada e pontuada como a percentagem de células cancerosas com imunorreactividade nuclear com um total de 500 células de tumor examinados por lâmina. O valor médio desta série (35% de células positivas) foi usado como um valor de limiar para distinguir os tumores com baixo ( 35%) versus o alto índice (≥35%) da proliferação das células. De acordo com os critérios anteriores para avaliar a ciclina D1, p53, a expressão de pRb, determinou-se o seu nível de expressão elevado ou baixo /negativo [26]. expressão de p27 foi determinada como positivo ou negativo de acordo com o relatório anterior [27]. De acordo com os critérios anteriores, expressão RARa foi determinada como expressão elevada ou baixa expressão [28].

Imunofluorescência

seções 4 mícrons foram desparafinados em xileno, reidratadas em série álcool graduado e cozidos em 0,01 M de tampão de citrato (pH 6,0) durante 2 minutos numa autoclave. A análise por imunofluorescência dupla foi realizada utilizando o anticorpo monoclonal de ratinho para Ki67 (Maixin), e anticorpo policlonal de coelho para TRIM24. De cabra anti-coelho (Alexa Fluor 488 marcado; Molecular Probes) e de cabra anti-ratinho (marcado com Alexa Fluor 594; Molecular Probes) foram utilizados como anticorpos secundários. sinais de fluorescência foram analisados ​​por gravar imagens coradas utilizando Olympus FV1000 Laser Scanning Microscópio Confocal.

Quantitative PCR em tempo real (SYBR Método verde)

Quantitative PCR em tempo real foi realizada utilizando mestre SYBR Green PCR mix (Applied Biosystems) num volume total de 20 uL em 7900HT rápido real-Time PCR System (Applied Biosystems) como se segue: 95 ° C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 30 segundos . Um passo de dissociação foi realizada para gerar uma curva de fusão para confirmar a especificidade da amplificação. β-actina foi utilizado como o gene de referência. Os níveis relativos de expressão de genes foram representados como referência ΔCt = Ct-Ct do gene, e a mudança de dobragem da expressão do gene foi calculada pelo método 2-ΔΔCt. As experiências foram repetidas em triplicado. As sequências dos iniciadores são como seguidores: TRIM24 para a frente, 5 ‘CGCCACCCAAGTTGGAGT 3’, TRIM24 reversa, 5 ‘GCTGGGAACCTCAGTAGTGTCCT 3’; β-actina para a frente, 5 ‘ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC 3’, β-actina reversa, 5 ‘CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG 3’. MMP2 para a frente, 5′-TGTGTTCTTTGCAGGGAATGAAT-3 ‘; MMP2 reverso, 5’-TGTCTTCTTGTTTTTGCTCCAGTTA-3 ‘; MMP9 para a frente, 5’-CCTCTGGAGGTTCGACGTGA-3 ‘; MMP9 reverso, 5’-TAGGCTTTCTCTCGGTACTGGAA-3 ‘;

Análise Western Blot

Total de proteínas a partir de linhas de células foram extraídas em tampão de lise (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) e quantificada utilizando o Bradford Método. Cinquenta microgramas de proteína foram separadas por SDS-PAGE (12%). Após a transferência, a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EUA) foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos seguintes -TRIM24 (1:1000; Proteintech, Chicago, IL, EUA), p53 (DO- 7, 1:500), RARa (1:500), beta-actina (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ciclina A (1:1000), ciclina B (1:1000), ciclina D1 (1:1000), ciclina D2 (1:1000), ciclina D3 (1:1000), ciclina E (1:800), CDK2 (1:1000), CDK4 (1:1000), CDK6 (1:1000) , p-Rb (1:2000), P21 (1:800), P27 (1:800) (tecnologia de sinalização celular, Boston, MA, EUA). Após incubação com acoplado com peroxidase anti-rato /IgG de coelho (Santa Cruz Biotechnology) a 37 ° C durante 2 horas, as proteínas ligadas foram visualizadas utilizando ECL (Thermo Fisher Scientific) e detectados utilizando sistemas bioimaging (UVP Inc., Upland, CA, EUA). Os níveis de proteína relativos foram calculados com base em β-actina como o controle de carregamento.

pequeno RNA de interferência Tratamento

On-TargetPlus SmartPool siRNA para TRIM24 (M-005387-03-0005) e ON -TARGETplus Non-targeting siRNA # 1 (D-001810-01-20) foram adquiridos de Dharmacon. Para transf ecções, as células foram semeadas numa placa de 24 poços 24 h antes do experimento. As células foram transfectadas com ARNsi utilizando o DharmaFECT 1 (0,20 uL /​​poço; ThermoFisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. A seguir à transfecção, o ARNm e os níveis de proteína foram avaliadas 48 horas mais tarde.

Teste de Proliferação de Células e Ensaio de Formação de Colónias

ensaio de proliferação celular foi realizada utilizando solução de contagem celular Kit-8 (Dojindo, Gaithersburg, MD) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas a uma concentração de 5 × 10

3 células /100 uL /​​poço em placas de 96 poços de cultura e tratadas com 10 ul /poço de celular de contagem Kit-8 solução durante as últimas 4 horas de cultura . A densidade óptica dos poços foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. Para o ensaio de formação de colónias, as células foram semeadas em três pratos de cultura de células de 6 cm (1,000 por prato para A549 e linhas de células H1299) e incubou-se durante 12 dias. As placas foram lavadas com PBS e coradas com Giemsa. O número de colónias com mais de 50 células foram contadas.

ciclo celular Análise

As células (500.000) foram semeadas em pratos com 6 cm de cultura de tecidos. Doze horas mais tarde, as células foram transfectadas com quantidades indicadas de siRNA. As células foram sincronizadas após um jejum de soro de 20 horas e, em seguida, os pontos de tempo feita às 24 h após a aplicação do meio de soro a 10% para medir os efeitos sobre o ciclo celular. As células foram colhidas, fixadas em paraformaldeído a 1%, lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e coradas em 5 mg /ml de iodeto de propidio em PBS suplementado com ARNase A (Roche, Indianapolis, IN) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os dados foram coletados por meio de sistemas de BD.

Matrigel Invasion Ensaio

ensaio celular invasão foi realizada utilizando um de 24 poços câmara de Transwell com um tamanho de poro de 8 um (Costar, Cambridge, MA). As pastilhas foram revestidas com 20 ul de Matrigel (01:03 diluição, BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas e 3 × 10

5 células em 100 ul de meio isento de soro foi transferido para a câmara de Matrigel superior e incubou-se durante 16 horas. Meio suplementado com 10% de FBS sozinho ou contendo 100 ng /ml de EGF (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi adicionada à câmara inferior, como o quimioatractor. Após a incubação, as células não invadidos na superfície superior da membrana foram removidos com uma ponta de algodão, e as células que passaram através do filtro foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com hematoxilina. O número de células foi contado invadidas em 10 campos de alta potência seleccionados aleatoriamente sob o microscópio. Esta experiência foi realizada em triplicado.

Análise de Apoptose

Para a detecção de apoptose, as células aderentes foram ambos recolhidos e ressuspensos em PBS frio para análise. As células foram coradas com anexina V-FITC Apoptosis Kit (BD Pharmingen, EUA) para monitorar as células da apoptose e iodeto de propídio (PI) para detectar as células mortas. Os dados foram coletados por meio de sistemas de BD.

Transient transfecção e luciferase Reporter Assay

transfecção gene repórter e atividade luciferase células de ensaio em 80 confluentes que crescem em uma placas de 24 poços foram co-transfectadas com a luciferase de pirilampo repórter da p53 contendo um promotor TA (pp53-TA-Luc, Beyotime Biotecnologia, China) (0,2 ug) juntamente com o repórter luciferase de Renilla (Promega Co.) (0,02 g) durante 12 h utilizando um reagente attractene (QIAGEN) de acordo com a os protocolos fornecidos pelo fabricante.

A actividade de luciferase foi medida nos extractos celulares utilizando um kit de luciferase relatado ensaio de gene duplo (Promega, CA, EUA). A atividade relativa do gene repórter foi calculado dividindo-se sinais de repórter luciferase p53 por sinais obtidos repórter forma Renilla luciferase.

Análise Estatística

SPSS versão 16.0 para Windows foi utilizado para todas as análises. O teste do qui-quadrado foi usado para examinar possíveis correlações entre a expressão TRIM24 e fatores clínico-patológicas. O teste t de Student foi utilizado para comparar outros dados. valor p baseou-se na análise estatística dos dois lados, e p . 0,05 foi considerado para indicar significância estatística

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Qingchang Li, pela excelente assistência técnica .