Abstract

Cerca de 40% dos cancros rectais Harbor mutações ativadoras K-RAS, e estas mutações estão associadas com a resposta clínica pobre a quimioradioterapia. Nosso objetivo foi identificar inibidores de pequenas moléculas (PMI) que sinergia com radiação ionizante (IR) ( “radiosensitizers”) que podem ser incorporados nas estratégias atuais de tratamento para o cancro rectal localmente avançado (LARCs) que expressam mutante K-RAS. Nós primeira otimizado um ensaio de elevado débito para medir efeitos individuais e combinados do PMI e IR que produz resultados semelhantes ao ensaio de formação de colónia padrão ouro. Usando esta plataforma de triagem e linhas celulares de cancro rectal mutantes K-RAS, testamos PMI alvejando diversas vias de sinalização para radiossensibilizadora actividade e, em seguida, avaliou nossos top hits em experimentos de acompanhamento. Os dois radiossensibilizadores mais potentes eram os AZD7762 inibidor de Chk1 /2 e o inibidor de PI3K /mTOR BEZ235. O agente quimioterapêutico 5-fluorouracilo (5-FU), que é usado para tratar LARC, em sinergia com AZD7762 e reforçada por radiossensibilização AZD7762. Este estudo é o primeiro a comparar diferentes PMI em combinação com IR para o tratamento de K-RAS câncer retal mutante, e nossos resultados sugerem que Chk1 /2 inibidores devem ser avaliados em novos ensaios clínicos para LARC.

Citation : Kleiman LB, Krebs AM, Kim SY, Hong TS, Haigis KM (2013) Análise comparativa do radiosensitizers para cânceres K-RAS mutante retal. PLoS ONE 8 (12): e82982. doi: 10.1371 /journal.pone.0082982

editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América

Recebido: 29 Julho, 2013; Aceito: 29 de outubro de 2013; Publicação: 12 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kleiman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela American Cancer Society (MGO-114.877 para KMH e PF-11-260-01 a LBK) e por uma concessão do projeto piloto do programa Proton feixe Federal Share. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Estima-se que 1,2 milhões de pessoas em todo o mundo são diagnosticadas com câncer colorretal (CRC) a cada ano, e cerca de 600.000 pessoas morrem da doença [1]. opções de tratamento mais eficazes são urgentemente necessários. Os CRCs de baixo grau podem ser curado com cirurgia por si só, que os cancros nas fases posteriores são adicionalmente tratados com uma combinação de quimioterapia, IV, e de terapias específicas, dependendo do local anatómico e estadiamento do tumor. terapias direcionadas (PMI e anticorpos monoclonais (mAbs)) afetam as vias anormalmente ativados nas células cancerosas sinalização e estão fazendo lentamente seu caminho para a clínica para o tratamento de vários cancros, quer como monoterapias ou mais para melhorar as respostas a nível de cuidados tratamentos. Três dessas drogas (todos os mAbs) são aprovados para o tratamento metastático CRC: cetuximab e panitumumab, que inibem o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR, um membro da família ErbB de receptores tirosina-quinase) e mostram benefícios apenas para K-ras de tipo selvagem cancros, e bevacizumab, que inibe o factor endotelial vascular-promoção da angiogénese crescimento (VEGF) [2]. Estes mAbs até agora não demonstraram benefício para doença localmente avançada [3,4], e não há terapias direcionadas estão aprovados para não-metastático CRC.

Por causa de sua localização anatômica, ressecções cirúrgicas são mais difíceis para o cancro rectal em relação ao câncer de cólon, e, portanto, há um maior risco de recorrência local [5,6]. A radioterapia pré-operatória diminui a taxa de recorrência local e é utilizado em combinação com quimioterapia para o tratamento LARC [7,8]. No entanto, apenas 10% destes pacientes a alcançar uma resposta patológica completa (PCR) e um terço morrem dentro de 5 anos [9,10]. Estratégias para melhorar a resposta têm como objectivo aumentar o efeito citotóxico de IR para as células do tumor sem afectar de modo semelhante de tecido normal, a fim de minimizar os efeitos secundários do tratamento. Identificação de drogas chemoradiosensitizing é particularmente pertinente para a ~ 40% dos doentes com cancro rectal que abrigam mutações K-ras [8]. K-ras mutante foi extensivamente ligada à radiorresistência em linhas celulares de cancro humano [11-17]. Além disso, a resposta de pacientes a radioquimioterapia LARC é altamente variável, com alguns doentes exibem PCR e outros uma resposta mínima. mutações K-RAS são mais comuns em pacientes com non-PCR [18], que está associada com a diminuição da sobrevida livre de doença [10].

K-RAS é uma pequena GTPase que funciona a jusante de receptores de superfície celular , tais como EGFR, e alterna entre um estado inativo, ligada a GDP e um ativo, estado [19] GTP-bound. GTP-bound K-ras activa várias cascatas de sinalização, incluindo o canónica Raf-MEK-ERK (MAPK) e as vias de PI3K-Akt-mTOR, para regular processos celulares tais como a proliferação e sobrevivência. Mutações no K-RAS são mais frequentemente encontrados nos codões 12 e 13 e hidrólise compromisso GTP estimulada por proteínas de activação de GTPase (GAPs), resultando em hiperativo K-RAS e proliferação descontrolada [19].

IR produz diferentes lesões do ADN, com os intervalos sendo ADN de cadeia dupla mais proeminentes (LAP), e, muitas vezes prende células em G1-S ou G2-M transição do ciclo celular para permitir a reparação do ADN [20]. Se houver lesões substanciais ou irreparáveis, as células podem morrer por apoptose ou necrose ou submetidos a senescência celular [21]. A radioterapia pode ser melhorada através da modulação de reparação do ADN, os pontos de verificação do ciclo celular, ou vias de transdução de sinal, tais como as MAPK ou PI3K [22,23]. No entanto, a estratégia ideal para a incorporação de terapias-alvo em regimes de tratamento não é clara. Neste estudo, nós otimizamos uma tela radiossensibilização de alto rendimento para linhas celulares de cancro rectal e identificou sensibilizador medicamentos para K-RAS cancros rectais mutantes.

Materiais e Métodos

soluções

cultura de células e de drogas

células cancerígenas do cólon DLD-1 e HCT-116 foram obtidas a partir do laboratório Vogelstein (Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, Baltimore, MD). linhas celulares de cancro rectal e pancreáticos foram obtidos a partir do Centro de Therapeutics Molecular (Hospital Geral de Massachusetts, Boston, MA). As células DLD-1 e HCT-116 foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10%. linhas celulares de cancro rectal e pancreáticos foram cultivadas em DMEM /F-12 suplementado com 5% de FBS. Veja a Tabela S1 para obter informações linha celular e Tabela S2 para informação sobre a droga.

Droga e radioterapia

O dia depois de células semeadura, o meio foi substituído com meio contendo veículo ou de drogas e IR foi aplicada 2 horas mais tarde com uma JL Shepherd Mark I modelo 25 irradiador de CS-137. Sham irradiadas (0 Gy) controlos foram tratados exactamente o mesmo que as amostras irradiadas, excepto que não foi aplicada radiação. Sem poços borda de placas de 96 cavidades foram usadas para análise. meios contendo fármaco foi substituído em dias alternados, mas os resultados de radiossensibilização foram semelhantes quando a droga não foi substituído.

Colónia ensaio de formação de

As células foram semeadas em placas de 6 poços de modo a que cada poço continha pelo menos 20 colônias que foram minimamente tocar após 2-3 semanas. As células foram fixadas e coradas durante 30 minutos com uma mistura de 6% de glutaraldeído e 0,5% de violeta de cristal em água destilada. As placas foram digitalizados e colónias com pelo menos 50 células foram contadas utilizando ImageJ. A fracção sobrevivente (SF) na sequência de drogas e tratamentos IR foi definida como: (plaqueamento eficiência X número de colónias formadas) /(número de células plaqueadas), onde a eficiência de revestimento para uma dada linha de células foi definida para o tratamento de controle correspondente como: (número de colónias) /(número de células semeadas).

CyQUANT

o celular CyQUANT directa Ensaio de Proliferação (Life Technologies, Molecular Probes) foi realizada em placas de 96 poços, em conformidade com o as instruções do fabricante, excepto que a CyQUANT directa de ácido nucleico mancha foi utilizado a uma concentração final de 1: 1000 e o fundo CyQUANT directa Supressor I em 1: 200, e o período de incubação foi de 30 minutos. A fluorescência foi medida com um leitor de placas de fluoresccia SpectraMax M5 (Ex /Em = 485 /538nm). sinal de fundo a partir de poços com células de meios, mas não foi subtraída.

Hoechst coloração e análise

As células em placas de 96 poços foram fixados durante 10 minutos em paraformaldeído a 4% e coradas com ácido nucleico Hoechst manchar 33342 (Molecular Probes) diluída 1: 40000 em PBS durante 30 minutos. Para cada poço, as imagens foram obtidas com um microscópio Zeiss Axio Observer Z1 em quatro locais espaçados 100 um aparte e, posteriormente, analisadas com o software de análise celular Imagem CellProfiler2 (www.cellprofiler.org). Os núcleos de contagem média para as quatro imagens de cada poço foi usado para posterior análise.

contagem celular

As células foram semeadas em placas de 6 ou 12 poços e no final da experiência foram destacadas utilizando tripsina /EDTA e recolhidas em meio de crescimento. A suspensão de células foi diluída de 1: 1 em 0,2% de azul de tripano e a concentração de células e a viabilidade foram avaliadas utilizando um contador de células automático Nexcelom Cellometer T4. O número de células vivas foi usado para posterior análise.

CellTiter-Glo

O CellTiter-Glo Luminescent Ensaio de viabilidade celular (Promega) foi realizada em placas de 96 poços, em conformidade com as instruções do fabricante , excepto que 1/4 da quantidade recomendada de CellTiter-Glo Reagente foi usada por poço. sinal de fundo de poços com a mídia, mas não células foi subtraído.

Cálculo de sobreviver frações

FE são descritos como a fração de células remanescentes após o tratamento. As médias de experiências em triplicado foram representados graficamente e as barras de erro representam os desvios padrão. Os dados foram normalizados para veículo mais sham IR. Para parcelas de dados após o tratamento IR, para contabilizar os efeitos da droga por si só, a droga mais IR foi adicionalmente normalizados para drogas mais sham IR para cada concentração da droga (representada por uma linha tracejada no valor 1). A SF para a droga mais IR menos do que o SF de veículo mais IR sugere sinergia. testes t de Student foram utilizados para avaliar se os fundos estruturais médios para tratamentos e controles foram significativamente diferentes. Os valores de p £ 0,05 para a droga mais o tratamento de IV em comparação com controlo de veículo, mais de IV são indicados por asteriscos nas figuras.

Western blotting

transferência de Western foi efectuada utilizando tampão de lise RIPA e métodos convencionais. Para medições de PARP clivada, as células flutuantes foram recolhidas de cada vez que o meio foi mudado e no final da experiência, e após a lise combinada com lisado a partir das células aderentes. As membranas foram incubadas com anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio Odyssey durante a noite a 4 ° C, lavadas em PBS contendo 0,1% de Tween-20, e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpos secundários diluído 1: 10000 em tampão de bloqueio Odyssey. As membranas foram digitalizados usando uma câmara de infravermelhos LI-COR Odyssey e Odyssey 2.1 software foi utilizado para a quantificação. Ver Tabela S3 para obter uma lista dos anticorpos utilizados.

perfis do ciclo celular

As células foram semeadas em placas de 6 poços e após o tratamento foram lavadas em PBS, tripsinizadas e recolhidas em meio. Todos os passos subsequentes foram realizados em gelo ou em um conjunto de centrifugação a 4 ° C. As células foram centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos e lavadas em PBS, e depois foram ressuspensas em Mg2 + – e isenta de Ca2 + PBS. 95% de EtOH foi adicionado gota a gota enquanto vórtice a baixa velocidade, e as células foram armazenadas a -20 ° C até à sua utilização. As células foram então centrifugadas durante 5 minutos a 2000 rpm, lavadas duas vezes em PBS, ressuspensas em 1 mg /mL de ARNase, e, em seguida, transferidas para tubos FACS. iodeto de propídio (PI) diluída em PBS foi adicionada para uma concentração final de PI de 1 ug /ml. As células foram mantidas no escuro até serem analisadas em um LSR II quad-laser de citômetro executando o software FACSDiva (BD Immunocytometry). FlowJo versão 7.6 foi utilizado para analisar os dados com o Dean-Jett-Fox (DJF) modelo matemático.

Resultados

Otimização do ensaio de elevado débito (HTA)

Os efeitos da radiação em linhas de células cultivadas são tipicamente avaliada através de um ensaio de formação de colónias (CFA). Esta abordagem não é passível de análise de alto rendimento, no entanto, porque é demorado, caro, e requer optimização significativo para cada linha celular e tratamento. Como tal, o nosso objectivo inicial era para otimizar a HTA para medir as respostas às drogas e IR. Em primeiro lugar, gerado um conjunto de dados de referência, com o CFA, em que as células foram semeadas em placas de 6 poços, uma gama de doses de IV foram aplicadas no dia seguinte, e o número de colónias foi avaliada 2 semanas mais tarde. Em seguida, as células foram semeadas em placas de 96 poços, foi aplicado IV no dia seguinte, e o número de células viáveis ​​foi avaliado pelo ensaio de CyQUANT depois de 3 a 8 dias (Figura S1). O ponto de tempo de uma semana para placas de 96 poços produziram resultados semelhantes às do CFA.

Nós descobrimos que o tratamento de algumas linhas celulares de cancro retal com IR e /ou PMI causada núcleos e células para ampliar e achatar. Nestes casos, CyQUANT e outros ensaios de proliferação comum que estão baseados no teor de ADN (por exemplo, Syto-60) produziu uma leitura imprecisa do número de células que claramente em desacordo com o que foi observado por inspecção visual. Este efeito foi particularmente notável para-IV tratados RCM-1 células (Figura S2a), mas não para células SW837. Decidimos para corar os núcleos em placas de 96 poços com Hoechst, as placas de imagem, e, em seguida, estimar o número de células em cada poço através da segmentação dos núcleos com o software CellProfiler. Este ensaio produziu resultados qualitativamente semelhantes às células contando uma semana pós-IR (baixo rendimento) e do CFA para ambas as linhas celulares (Figura S2B). O protocolo ( “ATS”) usado para a tela de radiossensibilização é mostrado na Figura S3.

radiossensibilização tela

As drogas seleccionadas para o ecrã afetar diversas vias de sinalização, tais como aqueles com um papel conhecido em radiossensibilização, bem como aqueles que se pensa ser hyperactivated no cancro mas sem uma função estabelecida em resposta a radiação. Foram incluídos drogas em dutos oncologia nas principais empresas farmacêuticas com dados pré-clínicos ou clínicos promissores. Em alguns casos, várias drogas que alvejam o mesmo caminho foram incluídos para comparar as suas potências e para abordar o papel dos efeitos fora do alvo. A selecção final das drogas composto 28 PMI (Tabela 1). Utilizou-se as concentrações de fármaco variando entre ~ 10 nM a 1 uM, uma vez que estes são tipicamente concentrações clinicamente praticáveis. doses IR variou de 2 Gy a 8 Gy já que os pacientes LARC muitas vezes recebem doses fracionadas de 1,8 Gy IR, mas às vezes recebem doses mais elevadas.

Drogas

primária target

GefitinibEGFRAZD8931pan-ErbBGDC-0941PI3KBKM120pan-PI3KBEZ235PI3K/mTORGDC-0980PI3K/mTORPerifosineAKT/mTORSorafenibRaf/VEGFR/etc.PLX4032Raf (V600E) Raf265Raf /VEGFRCI-1040MEKAZD6244MEKGSK1120212MEKPD325901MEKSP600125JNK IILY2228820p38DovitinibFGFR/PDGFRAbt888PARPAT-406IAPsAZD1480JAK1/2PD0332991CDK4/6AZD7762Chk1/2KU-55933ATMVorinostatHDACAUY922Hsp90AZD1152Aurora kinaseSunitinibmultiple targetsMidostaurinmultiple targetsTable 1. Drogas avaliadas como agentes individuais e combinados com a radiação na tela.

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As linhas mutante de células de cancro rectal K-RAS SW837 e RCM-1 foram utilizados para a tela, e os resultados são mostrados na Figura S4. O PMI teve uma ampla gama de potências, com inibidores de MEK em geral, sendo o mais forte por conta própria (Figura S5A). Foram utilizadas duas medidas para caracterizar quantitativamente radiossensibilização. Primeiro, foi calculado o grau de radiossensibilização comparando as diferenças de FE resultantes do tratamento SMI com e sem IR (por exemplo Figura S5B). Em segundo lugar, nós usamos a independência Bliss (BI) para determinar se os efeitos são antagônicos, aditivo ou sinérgico. BI assume que as atividades da SMI e IR são mutuamente exclusivos. O esperado efeito combinado (F

Cexp) é o produto fraccionada dos efeitos dos tratamentos individuais. A diferença entre F

Cexp eo efeito combinado observada (F

espigas) determina se os dois tratamentos são antagônicos (F

Cexp F

espigas), aditivo (F

Cexp = F

espigas) ou sinérgica (F

Cexp F

espigas). Não foi detectado qualquer antagonismo (valor de BI negativa) entre qualquer SMI e IR. Os valores da IB para os seis radiossensibilizadores mais fortes encontram-se ilustrados na Figura 1. Apenas a PI3K /BEZ235 inibidor de mTOR e o ponto de verificação quinases 1 e 2 (de Chk1 /2) inibidor de AZD7762 em sinergia com 2 Gy RI em ambas as linhas celulares.

Os valores da IB correspondem a (F

Cexp – F

espigas) x 100 e foram calculados com base nos dados brutos do ecrã mostrado na Figura S4. As concentrações do fármaco variou de 10 nM para 1.25μM. Radiossensibilização não foi considerado se a fracção sobrevivente (SF) a seguir ao tratamento de droga por si só era inferior a 0,125, uma vez que um efeito sinérgico da combinação com IR pode não ser detectável. Embora CI-1040, Raf265 e GDC-0980 foram ligeiramente radiosuscetível, eles não foram incluídos nos estudos de acompanhamento, desde outros inibidores das mesmas vias (AZD6244 e BEZ235) exibiram mais potente sinergia.

para os cinco inibidores utilizados que têm como alvo a via PI3K /Akt /mTOR, SW837 células eram mais sensíveis à droga por si só, enquanto que as células MCR-1 foram mais fortemente radiosensitized. Todas estas drogas radiosensitized pelo menos ligeiramente células MCR-1 a 8 Gy de IV, mas apenas foi BEZ235 radiossensibilizadora fortemente com 2 Gy IR. Por outro lado, todos os quatro inibidores de segmentação de MEK foram mais potentes na sua própria em células MCR-1 e mostrou uma tendência para a ligeira radiossensibilização de células SW837 RCM-1, mas não.

BEZ235 e AZD7762 radiossensibilizar

radiossensibilização foi confirmada para BEZ235 e AZD7762 pelo CFA (Figura S6). Estes PMI radiosensitized sobre uma gama de doses de IR tão baixas como 0,5 ou 1 Gy (Figura S7). Desde 1,8 Gy IR é tipicamente administrado durante cinco dias consecutivos para várias semanas durante o curso de tratamento para LARC, foi perguntado se a PMI são ainda radiossensibilizadora com doses fraccionadas de IR. Em primeiro lugar, avaliou os efeitos da aplicação de 2 Gy IR em quatro dias consecutivos, mas este deixou muito poucas células restantes para análise radiossensibilização (Figura S8A-B). No entanto, os nossos resultados sugerem que as drogas que são radiosuscetível com uma aplicação de IR também são radiossensibilizadora usando este protocolo (dados não mostrados). Para ser capaz de avaliar os efeitos de dias consecutivos de IR, foram aplicados 0,5 ou 1 Gy durante quatro dias consecutivos. Detectamos radiossensibilização semelhante por BEZ235 e AZD7762 como quando IR foi aplicada uma vez (Figura S8C-D).

A maioria dos cancros pancreáticos abrigar mutações K-RAS [19], e esses tumores são frequentemente tratados com radioterapia. Para investigar o escopo de nossas descobertas, estudos de acompanhamento foram realizadas com as únicas duas outras linhas estabelecidas de câncer retal celulares (SW1463 e carro-1) e com linhas celulares de cancro do pâncreas. Todas estas linhas de abrigar mutações K-ras, excepto para as células Car-1. BEZ235 radiosensitized fortemente todas as linhas celulares de cancro retal, mas apenas fracamente radiosensitized uma linha de células de câncer pancreático (PANC-1) a 2 Gy IR (Figura 2A). AZD7762 radiosensitized todas as linhas celulares de cancro retal, mas apenas os MiaPaCa-2 células de câncer pancreático em 2 Gy IR (Figura 2B). AZD7762 foi avaliada principalmente para câncer pancreático em combinação com gemcitabina, e as células MiaPaCa-2 são mais frequentemente utilizados nestes estudos pré-clínicos [24,25]. Radiossensibilização também foi detectado em células PATU8988T a 5 Gy IR (Figura 3), uma dose que está a ser avaliado em ensaios clínicos. No entanto, linhas celulares de cancro do pâncreas exibiram uma resposta mais variável para AZD7762 na presença de IR em comparação com linhas celulares de cancro retal, e os nossos dados sugerem que BEZ235 e AZD7762 pode mais universalmente radiossensibilizar cancros rectais.

Efeitos de BEZ235 ( A) ou 250 nM AZD7762 (B) 1 semana pós-IR. Diferentes concentrações de BEZ235 foram usadas, dependendo da sensibilidade de cada linha de células a um tratamento BEZ235 na ausência de IR (as linhas pancreáticos foram mais sensíveis à BEZ235): 250 nM para SW837, RCM-1, e células SW1463, 50 nM para o carro-1 e células Capan-1, 25 nM para células PANC-1, e de 1 nM para as células e PATU8902 PATU8988T. A ATS foi usada para as linhas celulares de cancro rectal e células Capan-1, e a contagem de células foi utilizado para as restantes linhas.

Esquerda

, Os dados estão normalizados para veículo mais sham tratamento IV (efeitos da PMI, na ausência de IR).

Right

, dados são normalizados para correspondentes controles não irradiadas. valores de p ≤ 0,05 para IR mais o tratamento SMI em relação ao controle IR plus veículo são indicadas por asteriscos.

O ensaio CellTiter-Glo foi realizada uma semana pós-IR.

Esquerda

, Os dados estão normalizados para veículo mais sham tratamento IV (efeitos da PMI, na ausência de IR).

direito, os dados são normalizados para correspondentes controles não irradiados; barras a cheio representam os efeitos de IR sozinho. valores de p ≤ 0,05 para IR mais o tratamento SMI em relação ao controle IR plus veículo são indicadas por asteriscos.

5-FU synergizes com AZD7762 e aumenta radiossensibilização

A SMI incorporadas a uma ensaio clínico para pacientes LARC seria administrado concomitantemente com IR e a quimioterapia baseada em 5-FU [3]. Anti-metabolitos tais como 5-FU e gemcitabina inibir a replicação do DNA e resultar numa paragem da fase S. tratamento AZD7762 foi sinérgica com 5-FU nas linhas celulares de cancro rectal, na ausência de IR (Figura 4A (ver dados para 250nM AZD7762) e S9), mas não foi detectada uma sinergia para BEZ235 e 5-FU (figura S10). Além disso, o 5-FU reforçada radiossensibilização por AZD7762, mas não por BEZ235 (Figura 4B (ver dados para 50nM AZD7762) e S10). Nós, portanto, focada em AZD7762 como o chemoradiosensitizer mais promissor.

resultados de ATS para SW837 células são mostrados. Veja a Figura S10 de dados sobre células RCM-1 e tratamento BEZ235. (A) Os dados são normalizados para veículo mais sham IR. (B) Os dados são normalizados para os controlos correspondentes não-irradiadas. valores de p ≤ 0,05 para IR mais o tratamento SMI em relação ao controle IR plus veículo são indicadas por asteriscos.

O tratamento combinado de AZD7762 e IR promove danos ao DNA e apoptose

IR-induzida LAP são detectados pela proteína serina /treonina quinases ataxia telangiectasia mutada (ATM) e relacionados com ATM e 3 Rad quinase (ATR), que fosforilam muitos substratos intracelulares, incluindo de Chk1 /2, H2AX e p53 [26]. Chk1 e Chk2 são serina /treonina cinases que desempenham um papel essencial na resposta de LAP por manter o S- e os pontos de verificação em fase G2 e regulação reparação recombinação homóloga [26,27]. ATR fosforila Chk1 em S317 e S345, que cataliticamente ativa Chk1 e leva a autofosforilação em S296, e ATM fosforila Chk2 em T68, levando a Chk2 homodimeriza�o e autofosforilação em T383, T387 e S516 [28,29]. inibidores de cinase Chk1 aumentar a fosforilação de Chk1 S345 devido à ativação ATR e desfosforilação diminuída por PP2A [30,31]. Da mesma forma, Chk2 inibidores da quinase aumentar a fosforilação de Chk2 T68, que é ATM-dependente e regulado por várias proteínas fosfatases [32].

Nossos resultados nas linhas celulares de cancro rectal são consistentes com estes efeitos bem estabelecidos de Chk1 /2 e inibidores de AZD7762. Chk1 e Chk2 actividade (pS296 Chk1 e Chk2 pS516) foram inibidas por AZD7762 na presença e ausência de IV (Figuras S11A e S12A), indicando que o fármaco bloqueou eficazmente os seus objectivos. A fosforilação de cinases Chk1 e Chk2 dos sites /ATR-mediadas ATM (pS345 Chk1 e Chk2 pT68) aumentaram após o tratamento AZD7762 (Figuras S11B e S12B). Fosforilação de Chk1 em S345 é conhecida por promover Chk1 degradação proteolítica [33], e descobrimos que AZD7762 diminuição dos níveis de Chk1 (Figura S11C).

As células cancerosas muitas vezes perdem o seu posto de controle G1, por exemplo através de mutação do tumor supressor p53, e são mais dependentes do checkpoint G2 e 2 atividade Chk1 /[22]. Chk1 /2 depleção ou inibição, particularmente em células deficientes em p53, ab-roga o ponto de controlo G2 induzida por agentes genotóxicos e impede que a reparação do ADN, conduzindo eventualmente a catástrofe mitótica ou senescência e a apoptose [20,28]. A falta de reparação do ADN é geralmente detectado por fosforilação prolongada da histona H2AX variante em S139, que é rapidamente fosforilada pela ATM, ATR ou ADN-PK, em resposta a LAP [34]. De fato, descobrimos que o tratamento AZD7762 revogada a prisão G2 induzida pelo IR (Figura S13) e levou ao aumento da fosforilação da H2AX (γH2AX) e apoptose em linhas celulares de cancro retal (Figuras 5 e S14).

Western resultados borrar para células RCM-1 são mostrados. Veja a Figura S14 para a quantificação e dados sobre células SW837 e SW1463. O número de dias pós-IV é indicada. (A) DSB de ADN, tal como indicado pelos níveis de γH2AX. (B) A apoptose como indicado por níveis de PARP clivada.

AZD7762 é um radiossensibilizador mais potente do que outros ATM-Chk1 /2 inibidores

Nós descobrimos que outras drogas alvo ATM-Chk1 /2 não são tão bons como AZD7762 em radiossensibilizadora linhas celulares de cancro rectal. AZD7762 radiosensitized em torno de uma concentração 40 vezes menor do que o inibidor da ATM KU-55933 (Figura 6). Vários inibidores de Chk1 e Chk2 estão em desenvolvimento pré-clínico e ensaios clínicos iniciais [26]. Nós comparamos AZD7762 para dois outros que são comercialmente disponíveis (SCH900776 e LY2603618) [35]. AZD7762 é igualmente potente contra Chk1 e Chk2 in vitro (IC

50 = 5 nM e 10 nM, respectivamente), ao passo que SCH900776 é selectivo para Chk1 (IC

50 = 3 nM) ao longo Chk2 (IC

50 = 1.5μM) e LY2603618 é relatado para ser um inibidor de Chk1 seletiva, mas não existem dados publicados [20]. AZD7762 radiosensitized e a actividade de Chk1 inibida em 10 vezes a concentração mais baixa do que SCH900776 e LY2603618 (Figura 7), apesar de, pelo menos, AZD7762 e SCH900776 têm afinidades de ligação semelhantes in vitro para Chk1.

O ensaio CellTiter-Glo foi realizada com células SW837 uma semana pós-IR. Os dados são normalizados para os controlos correspondentes não-irradiadas. valores de p ≤ 0,05 para IR mais o tratamento SMI em relação ao controle IR plus veículo são indicadas por asteriscos.

(A) O ensaio CyQUANT foi realizada com células SW837 uma semana pós-IR. SCH900776 LY2603618 e são inibidores de Chk1. Os dados são normalizados para os controlos correspondentes não-irradiadas. valores de p ≤ 0,05 para IR mais o tratamento SMI em relação ao controle IR plus veículo são indicadas por asteriscos. (B) As células SW837 foram tratados com veículo ou SMI duas horas antes de IR, e lisados ​​de proteína foram colhidas três horas pós-IR. sites de Chk1 e Chk2 autofosforilação foram medidos por Western blot.

Discussão

O objetivo deste estudo foi identificar novas opções de tratamento para pacientes LARC com mutações K-RAS, otimizando um alto ensaio -throughput e rastreio de um painel de PMI alvejando diversas vias de sinalização para radiossensibilização. O nosso pressuposto subjacente a este trabalho é que um SMI com um efeito sinérgico sobre as células cancerosas, quando combinada com a terapia de radiação é mais desejável do que uma que tem um efeito altamente citotóxico sobre o seu próprio. Foram identificados seis PMI que radiossensibilizar células cancerosas retais mutantes K-RAS: BEZ235 (PI3K /inibidor de mTOR), AZD7762 (Chk1 /2 inibidor), AZD8931 (inibidor do receptor pan-ErbB), AT-406 (inibidor da proteína de apoptose (IAP) inibidor da família), AZD6244 (inibidor da MEK), e Abt888 (inibidor de PARP). Embora outros inibidores de receptores ErbB e proteínas anti-apoptóticas têm sido mostrados para ser radiossensibilizadora [23], AZD8931 e EM-406 não foram previamente relatado para ser radiossensibilizadores. BEZ235 AZD7762 e foram os mais potentes e radiossensibilizadores que incidiu sobre estes dois fármacos.

BEZ235 foi mostrado para radiossensibilizar tumores de vários tecidos, incluindo glioblastomas, fibrossarcomas, e linhas de células albergando NCSLC mutações K-ras [36- 38]. BEZ235 também normaliza a vasculatura do tumor em experimentos de xenotransplante, levando a melhor perfusão do tumor, oxigenação e respostas à radioterapia [36]. Diferentes mecanismos têm sido propostos para explicar o efeito radiosuscetível visto com BEZ235, mesmo dentro da mesma linha de células (H460 células): revogação da induzida IR G

2 prisão e a apoptose [37], e aumentou a G

2 prisão e senescência [39]. Comum a todos os documentos que descrevem efeito sensibilizador de BEZ235 está atrasado reparação de danos no DNA. Aqui, demonstramos pela primeira vez que BEZ235 actua como um potente radiossensibilizador de linhas celulares de cancro rectal e pancreáticas. As células com PIK3CA mutações de activação ou a perda do gene supressor de tumor PTEN, são mais sensíveis à BEZ235 do que as células sem estas mutações [40], e a elevada sensibilidade de PATU8902 e células PATU8988T para BEZ235 pode ser explicada pela sua deficiência de PTEN (Tabela S1). A inibição da PI3K e mTOR por BEZ235 parece ser uma abordagem terapêutica promissora, especialmente em combinação com IR para o cancro rectal. Não houve ensaios clínicos com BEZ235 para CRC ou combinado com IR (www.clinicaltrials.gov).

AZD7762 foi mostrado para radiossensibilizar várias linhas celulares de cancro in vitro e em modelos de xenotransplante mediante a anulação do checkpoint G2 e inibindo reparo do DNA. AZD7762 foi avaliada principalmente para o cancro do pâncreas, mas também foi mostrado para radiossensibilizar da próstata, do pulmão, da mama, e células cancerígenas do cólon [24,25,41-43]. fibroblastos humanos normais e células epiteliais do intestino delgado não são radiosensitized por AZD7762 [25,42].

Não há estudos anteriores têm comparado radiossensibilização por AZD7762 e outros inibidores, e descobrimos que ele é um melhor radiossensibilizador de células de câncer retal do que os inibidores de outras proteínas envolvidas na resposta a agentes genotóxicos, bem como outros inibidores da ATM-Chk1 /2 via. AZD7762 tem efeitos muito diferentes em comparação com o ponto de verificação inibidores de cinase SCH900776 LY2603618 e na medida em que é o único que diminui a viabilidade da sua própria em 1 uM (através de LAP e apoptose; dados não apresentados) e que é mais forte do radiossensibilizador. A explicação mais simples para estas diferenças é que AZD7762 inibe Chk2 enquanto as outras duas drogas não, e que Chk2 desempenha um papel importante na radiossensibilizadora células de câncer de reto. No entanto, diversos estudos (baseados principalmente na siRNA knockdown) sugeriram que a quimioterapia e radiossensibilização são mediadas por cinases Chk1 e, em muito menor grau Chk2, e que os efeitos de AZD7762 são devidos à sua inibição de Chk1 [20,24,44- 46]. Não está claro se os inibidores específicos de Chk2 possuem quimioterapia significativo e atividade radiosuscetível [47-49]. Além disso, mostramos que AZD7762 é um inibidor mais forte do que de Chk1 e SCH900776 LY2603618. Assim, a mais forte radiossensibilização por AZD7762 é provavelmente devido aos seus efeitos melhorados em Chk1, e, em menor grau, a sua inibição de Chk2.

Descobrimos que AZD7762 em sinergia com 5-FU e que o 5-FU reforçada radiossensibilização por AZD7762.