Abstract

carcinoma do ovário (OC) é a neoplasia maligna ginecológica mais letal. Apesar dos avanços no tratamento da OC com regimes combinatórias, incluindo cirurgia e quimioterapia à base de platina, os pacientes geralmente apresentam prognóstico reservado devido à elevada resistência à quimioterapia. Aqui, testamos a hipótese de que o DNA danos resposta (DDR) vias estão envolvidas na resistência dos pacientes OC à quimioterapia platina. sinais DDR seleccionados foram avaliados em duas linhas do ovário humano de células de carcinoma, um sensível (A2780) e uma resistência (A2780 /C30) para tratamento de platina, bem como em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes OC, sensível (

N

= 7) ou resistentes (

n

= 4) à quimioterapia subsequente. PBMC de voluntários saudáveis ​​(

n

= 9) foram estudados em paralelo. dano ao DNA foi avaliada pela técnica de imunofluorescência γH2AX e ensaio do cometa. Maiores níveis de danos no DNA intrínseca foram encontrados em A2780 do que em células A2780 /C30. Além disso, os níveis de danos de ADN intrínsecas foram significativamente mais elevados em pacientes OC relativamente aos voluntários saudáveis, bem como em pacientes sensíveis à platina quando comparada às resistente a platina (All

P

0,05). A seguir ao tratamento carboplatina, células A2780 mostrou uma eficiência mais baixa do que a reparação do ADN células A2780 /C30. Além disso, após o tratamento de carboplatina de PBMC

ex vivo

, a eficiência de reparação do ADN era significativamente maior em voluntários saudáveis ​​do que em pacientes resistente à platina e menor em mais sensíveis à platina (t

1/2 para perda de γH2AX focos: 2,7 ± 0,5 h, 8,8 ± 1,9 h e 15,4 ± 3,2H, respectivamente, utilizando o teste do cometa, t

1/2 da induzida por platina reparação de danos: 4,8 ± 1,4H, 12,9 ± 1,9 h e 21,4 ± 2.6h, respectivamente; todos

P Art 0,03). Além disso, a taxa de apoptose induzida por carboplatina era superior em A2780 do que em células A2780 /C30. Em PBMC, as taxas de apoptose foram inversamente correlacionada com a eficiência de reparo do DNA dessas células, sendo significativamente maior em platina-sensíveis do que em pacientes de platina-resistente e menor em voluntários saudáveis ​​(todo o

P Art 0,05). Conclui-se que as perturbações de vias de reparação de ADN como medido em CMSPs de pacientes OC correlaciona com a sensibilidade de droga dessas células e refletem a resposta à quimioterapia individualizada à base de platina

citação:. Stefanou DT, Bamias A, H Episkopou , Kyrtopoulos SA, Likka H, ​​Kalampokas T, et al. (2015) danificar o DNA aberrante Pathways resposta pode prever o resultado de platina quimioterapia no cancro do ovário. PLoS ONE 10 (2): e0117654. doi: 10.1371 /journal.pone.0117654

Editor do Academic: Goli Samimi, Garvan Institute of Medical Research, AUSTRÁLIA

Recebido: 16 de julho de 2014; Aceito: 12 de novembro de 2014; Publicação: 06 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Stefanou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Os dados estão disponíveis a partir do Repositório Helios digital:. https://helios-eie.ekt.gr/EIE/handle/10442/14421

Financiamento: Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão Universidade de Atenas Medical School ELKE 097, e pela ECNIS (Câncer Ambiental, Nutrição e individual Susceptibilidade) Rede de Excelência da União Europeia (contrato n. 513943). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário (OC) é o quinto tipo de câncer mais comum em mulheres e a principal causa de mortalidade por neoplasias malignas ginecológicas, com carcinoma epitelial sendo a variedade mais frequente [1,2]. OC é tipicamente diagnosticada em estágios avançados e muitas vezes carrega um prognóstico sombrio, embora as estratégias atuais de tratamento, incluindo citorredução cirúrgica agressiva e quimioterapia platina-paclitaxel parece ter melhorado significativamente a sobrevivência relativa desses pacientes a uma taxa de sobrevida em 5 anos de mais de 40% [3]. fatores prognósticos estabelecidos para OC incluem palco, subtipo histológico, o grau do tumor e volume de doença residual após a cirurgia cytoreductive [4,5].

Três compostos de platina diferentes, ou seja, cisplatina, carboplatina e oxaliplatina, são actualmente utilizados na prática clínica, com inúmeras indicações, que cobrem um amplo espectro de tumores sólidos [6]. A sua acção citotóxica é exercida por meio de reacção com o DNA e o desenvolvimento de danos no ADN pela formação de ligações cruzadas, Pt-D [GpG] (1,2-intracadeia ligações cruzadas, 65%), pinta-d [ApG] ( 1,2-intracadeia ligações cruzadas, 25%) e em menor medida em Pt-d [GpNgG] (1,3-intracadeia ligações cruzadas), intercadeias ligações cruzadas (ICLs, o mais citotóxico) e single-nucleotide danos guanina [7]. reparação de excisão de nucleotídeos (NER) é o principal processo pelo qual crosslinks platina intracadeia e danos single-nucleotide da guanina são reparados [8,9]. Por outro lado, a reparação de ICL é complexo e requer uma combinação de NER, via de reparação de Fanconi anemia, translesão síntese e recombinação homóloga [10-12]. É interessante notar que, rendimentos de reparação ICLs através da formação de rupturas de DNA de cadeia dupla (DSB) que representam a forma mais letal de danos no ADN [13]. A formação de LAP é sempre seguido pela fosforilação da histona H2AX, uma variante da família de proteínas H2A, que é um componente do octâmero histona em nucleossomas. A histona H2AX é fosforilado por cinases, tais como a ataxia telangiectasia mutada (ATM) e relacionados com o MTA-Rad3 (ATR) da via PI3K [14]. Esta nova proteína fosforilada, γH2AX, é o primeiro passo no recrutamento e na localização de proteínas de reparação do ADN.

O genoma dos mamíferos é protegido contra insultos genotóxicos por uma rede de resposta a danos no ADN (DDR) vias, que são desencadeadas pela detecção de lesões do ADN através de sensores específicos [15]. O passo subsequente é a iniciação de uma cascata de transdução de sinal, o qual activa várias vias genoma de protecção. Desde DDR é um processo de sinalização completa que determina o destino das células por reparação de danos no ADN ou em apoptose, o seu papel tem sido implicada no processo da doença e para o sucesso da quimioterapia. Com efeito, foi demonstrado que alterações nas vias de reparação do ADN desempenham um papel importante na transformação maligna de CO [16]. Além disso, a expressão de proteínas de reparo do DNA, tais como cancro da mama 1 (BRCA1) e reparação de excisão grupo cruz complementação 1 (ERCC1) foram correlacionados com pior sobrevida no OC avançada e foram encontrados para ser marcadores de resistência a medicamentos à base de platina [17- 19]. Além disso, os nossos estudos anteriores focada sobre os níveis de danos ao DNA em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de doentes com mieloma múltiplo têm mostrado que o dano do DNA pode prospectivamente distinguir entre pacientes com diferentes graus de resposta terapêutica, proporcionando a base para a pré-triagem e a seleção dos pacientes mais susceptíveis de beneficiar deste tratamento [20-24].

Aqui, realizamos um estudo para testar a hipótese de que a DDR, um mecanismo crucial para a sobrevivência da célula, está envolvido na resistência à quimioterapia platina . Descobrimos que os pacientes OC são caracterizadas por dano de DNA maior intrínseca em comparação com voluntários saudáveis, e que a eficiência da reparação do ADN como medido em PBMCs de pacientes OC se correlaciona com a sensibilidade de droga dessas células e reflecte a resposta individualizada para quimioterapia à base de platina.

Materiais e Métodos

Os pacientes

Todos os pacientes incluídos nesta análise foram geridos em uma única instituição (Alexandra Hospital, Atenas, Grécia). Amostras de sangue foram obtidas a partir de dezoito (

n

= 18) pacientes submetidos à cirurgia para câncer de ovário suspeita (idade média de 62 anos, intervalo 34-77) (Tabela 1) antes de qualquer tratamento terapêutico. Nove (

n

= 9) indivíduos saudáveis, idade e aos pacientes (todos do sexo feminino, com idade média de 60 anos, intervalo 29-73) foram servido como controles pareados por sexo. Todos os pacientes foram classificados de acordo com o sistema de estadiamento FIGO. A quimioterapia foi iniciada dentro de um mês da cirurgia. O paclitaxel em 175 mg /m

2 mais de 3 horas imediatamente seguido por carboplatina AUC 5-6 ao longo de 60 minutos, foram administradas a cada 3 semanas. Seis ciclos de quimioterapia foram administrados. Sete pacientes não receberam quimioterapia pós cirurgia: 3 tiveram tumores borderline, um paciente morreu no pós-operatório, enquanto 3 pacientes recusou qualquer tratamento após a cirurgia. sensibilidade Platinum para os 11 pacientes que receberam quimioterapia de primeira linha foi avaliada de acordo com os critérios Comissão Intergrupo do Câncer Ginecológico (GCIC) [25]. Por estes critérios, foram 4 resistente a platina e 7 pacientes sensíveis à platina. pacientes sobreviventes devem ter um mínimo de seguimento de 2 anos. Todos os participantes deram consentimento informado por escrito de acordo com a Declaração de Princípios Helsínquia, eo estudo foi aprovado pelo Conselho de Alexandra Hospital Institutional Review.

tratamento celular

O A2780 sensível à platina e as linhas celulares A2780 /C30 platina-resistentes [26] foram gentilmente cedidas pelo Dr. George Koukos (Ovarian Cancer Research Center, University of Pennsylvania School of Medicine, Filadélfia, Pensilvânia, EUA). As células foram cultivadas em monocamada, utilizando meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de vitelo, 100 ug /ml de estreptomicina, 100units /ml de penicilina, 0,3 mg /ml e glutamina 0.3unit /ml de insulina em uma incubadora a 37 ° C continuamente gaseificada com 5% de CO

2. As células foram tratadas com cisplatina (0-100μg /ml durante 0-24 h), seguido por incubação em meio isento de droga para 0-24 h ou carboplatina (0-300μg /ml durante 0-24 h), seguido por incubação em pós-droga forma -livre de 0-24h.

PBMC foram isoladas do sangue periférico extraído recentemente usando métodos padrão [23]. Em seguida, as células foram estimuladas em proliferação utilizando 10 ug /ml de fito-hemaglutinina (PHA) durante 48 h a 37 ° C em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS, 50 mg /l de penicilina, 50.000lU /l de estreptomicina e subsequentemente tratadas com cisplatina (0-300μg /ml por até 3H), seguido por incubação em meio isento de droga para 0-24 h ou carboplatina (0-1800μg /ml durante até 24 horas), seguido por pós-incubação em meio isento de droga para 0-24 h.

citotoxicidade ensaio

Após o tratamento de drogas, as células viáveis ​​foram contadas por corante de exclusão de azul tripano [27]. Resumidamente, após a incubação com a droga, as células foram lavadas e ressuspensas em meio completo. Um volume igual de 0,4% de reagente de azul de tripano foi adicionado à suspensão de células e a percentagem de células viáveis ​​foi avaliado. Os ensaios foram realizados em triplicado.

electroforese em gel de uma única célula (comet assay)

O ensaio de electroforese em gel de célula única foi realizada sob condições alcalinas, como descrito previamente [28]. Resumidamente, 5×10 alíquotas de

4 células tratadas com droga não tratados ou de platina foram suspensas em agarose de baixo ponto de fusão (1%) em PBS (135mmol /l de NaCl, 2,5 mmol /l de KCl, pH 10) a 37 ° C, e a propagação sobre lâminas de microscópio totalmente fosco pré-revestidas com uma camada fina de 1% de agarose de fusão normal (Biozyme, Hameln, Alemanha). A suspensão celular foi imediatamente coberta com uma lamela e as lamelas foram mantidas a 4 ° C durante 1 h para permitir a solidificação da agarose. Depois de retirar a lamela, as células foram expostas a tampão de lise (2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 10, 1% de Triton X-100) a 4 ° C durante 1h. Em seguida, as lâminas foram colocadas numa câmara de electroforese em gel horizontal. A câmara foi preenchida com tampão de electroforese frio (EDTA 1 mM, NaOH a 300 mM, pH 13) e as lâminas foram mantidas a 4 ° C durante 40 minutos para permitir que o DNA para relaxar. A electroforese foi realizada durante 40 min (1 v /cm, 255mA). Após a electroforese, as lâminas foram lavadas com tampão de neutralização (Tris-HCl 0,4 M, pH 7,5) durante 10 min e, em seguida, com H

2O durante 10 min. Todos os passos preparativos foram realizados no escuro para evitar danos de ADN adicional. As lâminas foram coradas com 20 � de 1 ug /ml DAPI e analisadas com um microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse 400) equipado com uma câmera de vídeo CCD-4230A. As imagens digitais foram obtidas utilizando um sistema de análise de imagem (análise cinética, Wirral, UK). Momentos Olive cauda [OTM = (cauda média-Head Média) x (% do DNA) /100] de 100 células /condição tratamento foram avaliados.

antígeno Imunofluorescência coloração e confocal de varredura a laser análise microscópica

aliquotas de 2×10

4 células tratadas com droga não tratados ou de platina foram aderidas a lamela revestida com 1M de HCl e 50 mg /ml de poli-D-lisina antes da utilização, fixadas por adição de uma solução de paraformaldeído a 4% durante 6 min à temperatura ambiente e armazenado a -70 ° C até que a análise de Patm (serina-1981, Santa Cruz), patr (serina-428, Cell Signaling), pChk1 (serina-345, Santa Cruz), pChk2 (treonina-68, Abcam) e γH2AX (serina-139, Cell Signaling) [29]. As células foram lavadas com PBS frio e bloquearam-se com 0,5 ml por poço de tampão de bloqueio (0,1% de Triton X-100, 0,2% de leite desnatado seco em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente numa caixa humidificada. células bloqueadas foram incubadas com anticorpos contra a Patm, patr, pChk1, pChk2 ou γH2AX em tampão de bloqueio, a 4 ° C durante a noite. Após lavagem com tampão de bloqueio, as células foram incubadas com anticorpo de cabra anti-ratinho, marcado com FITC, emparelhado com cabra anti-coelho, TRITC marcado, para a dupla marcação (Invitrogen) a uma diluição de 1: 4000 em tampão de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente no escuro. Lamelas foram aplicadas, e as bordas foram seladas com unhas polonês claro. As imagens foram visualizadas com uma Leica TCS SP-1 a laser confocal microscópio de varredura. Focos foram contadas manualmente na condição de 200 células /tratamento e os resultados são expressos como a% de células positivas γH2AX (média ± DP) de três experiências independentes; As células positivas são definidas como células com mais de 5 focos por célula.

Ensaio de Apoptose

A apoptose foi avaliada usando o kit de morte celular de detecção ELISA Plus (Roche Applied Sciences), de acordo com o fabricante do instruções. Em resumo, as células foram tratadas com várias doses de carboplatina (linhas celulares, 0-300μg /ml; PBMC, 0-1800μg /ml) durante 24 horas seguido de incubação em meio isento de drogas durante 24 horas. Em seguida, as células foram recolhidas para preparar as fracções citosólicas que continham fragmentos de ADN. Volumes iguais destas fracções citosólicas foram incubadas em poços revestidos com anticorpo anti-histona (placas de 96 cavidades), e as histonas dos fragmentos de ADN foram deixadas a ligar-se aos anticorpos anti-histonas. Os anticorpos monoclonais de ratinho de ADN marcados com peroxidase foram utilizados para localizar e detectar o ADN fragmentado ligado usando detecção fotométrica, com 2,29-azino-di (3-etilbenztiazolina-sulfonato) como o substrato. O ensaio quantifica a apoptose como as vezes de aumento (expresso como Factor de Enriquecimento, EF) no nível de apoptose nas amostras tratadas com as amostras não tratadas. Calculou-se o enriquecimento específico de mono- e oligo-nucleossomas libertados no citoplasma, utilizando a seguinte fórmula: (EF) = [(absorvância de células tratadas) /(absorvância das células sem tratamento com fármaco)]. Finalmente, a taxa de apoptose indivíduo foi expressa como a dose de carboplatina suficiente para provocar a indução de um certo factor de enriquecimento (EF = 3).

A análise estatística

A eficácia da reparação do ADN e a indução de apoptose foram comparados entre grupos de indivíduos que usam testes não paramétricos. Especificamente, a análise Kruskal Wallis foi utilizado para as comparações entre os três grupos, eo teste de soma Wilcoxon classificação para as comparações sábios par. As correlações entre os valores dos vários parâmetros relacionados com a RRC dentro das linhas celulares ou PBMCs dos pacientes diferentes OC foram avaliadas pelo coeficiente de correlação de Spearman (todos os grupos combinados). Para avaliar a relação linear entre a danos no ADN e a dose da droga de platina, apoptose e dano do ADN, assim como a apoptose e coloração pan-nuclear, foi realizada regressão linear destes parâmetros. A

P

-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para ter em conta as comparações múltiplas foi utilizada a correção Bonferonni.

Resultados

reparação do ADN de danos induzidos-platina em linhas de células de carcinoma de ovário correlaciona-se com a sensibilidade de droga dessas células

para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na sensibilidade ao fármaco da quimioterapia platina, alterações nas moléculas chave da via DDR celular (Patm, patr, pChk1, pChk2, γH2AX) foram avaliados em duas linhas celulares de carcinoma do ovário: uma platina-sensível (A2780) e resistente a platina um (A2780 /C30) [26]. As células foram tratadas com várias doses de cisplatina (0-100μg /ml) durante 0-24 h, seguido de incubação em meio isento de droga para 0-24 h. Ambas as linhas de células mostraram um aumento dependente da dose na formação de todos os principais moléculas em estudo (Fig. 1A, D). níveis máximos destas moléculas foram observados em pós-tratamento 6h, mantendo-se estável ou ligeiramente diminuindo posteriormente (Fig. 1B). Curiosamente, γH2AX apresentaram as maiores taxas de indução entre as moléculas-chave examinadas. A concentração de cisplatina mais baixa na qual a indução γH2AX podia ser detectada era 2,5 ug /ml durante 1 hora (Fig. 1C). Além disso, as células foram tratadas com carboplatina (0-300μg /ml) durante 0-24 h seguido por pós-incubação em meio isento de droga para 0-24 h. resultados semelhantes aos obtidos a partir dos experimentos cisplatina foram encontrados. Isto é, em ambas as linhas celulares de um aumento dependente da dose na formação de todas as moléculas-chave foi observada (Fig. 1E, F). Além disso, foram observados niveis máximos de essas moléculas no final do tratamento de 24 horas, diminuindo em seguida. Novamente, o γH2AX apresentaram as maiores taxas de indução entre as moléculas-chave examinadas. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a imunofluorescência quantificação de γH2AX focos é uma abordagem poderosa para avaliar os danos ao DNA induzidos por drogas de platina.

A2780 /células C30 (representativos das duas linhas celulares OC) foram tratados (A) com cisplatina (0-100μg /ml) durante 3 h, ou (B) com 100 ug /ml de cisplatina, subsequentemente incubadas em meio isento de droga para vários períodos de tempo (0-24h), ou (c) com doses relativamente pequenas (0- 15 � /ml) de cisplatina durante até 3 h, e analisadas no final do tratamento, utilizando microscopia confocal. As células positivas: células com mais de 5 focos por célula. As barras de erro representam o desvio padrão. Em (D) imagens típicas mostrando as principais moléculas em estudo usando análise de microscópio de A2780 /células C30 tratadas com 100 ug /ml de cisplatina durante 3 horas; imagens superiores, antígeno imunofluorescência; imagens de fundo, núcleos de células marcadas com DAPI. (E) A2780 /células C30 foram tratados com carboplatina (0-300μg /ml) durante 24 h ou (f) com 100 ug /ml de carboplatina para vários períodos de tempo (0-24h) e analisadas utilizando microscopia confocal. As barras de erro representam o desvio padrão. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

Os níveis de danos no ADN induzida por platina em ambas as linhas celulares também foram avaliados utilizando o ensaio de cometa alcalino. Esta versão do teste do cometa detecta migração DNA causado por rupturas dos filamentos, locais instáveis ​​alcalinas, e os locais de reparação transitórias [30]. Após o tratamento das células com cisplatina 0-150μg /ml durante 3 horas (Fig. 2A, C) ou carboplatina 0-300μg /ml durante 24 h (Fig. 2B, C), um aumento dependente da dose linear dos níveis de danos de ADN foi obtida em ambas as linhas celulares, indicando que o método tem a sensibilidade e precisão para detectar e quantificar os danos no ADN induzida por platina.

A2780 /células C30 (representativos das duas linhas de células OC) foram tratados com (a) a cisplatina ( 0-150μg /ml) durante 3 horas ou (B) carboplatina (0-300μg /ml) durante 24 h, e analisadas no final do tratamento usando comet assay. As barras de erro representam o desvio padrão. Em (C) típicas imagens ensaio cometa de A2780 células /C30 não-tratadas (NT), tratado com 50 ug /mL de cisplatina (cis-50), 100 ug /mL de cisplatina (cis-100), 150μg /ml de carboplatina (carbo-150 ) ou 300 � /ml de carboplatina (carbo-300). Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

Além disso, utilizando as duas abordagens acima poderosos validados, os níveis de danos ao DNA intrínseca foram avaliadas em linhas de células não tratadas. Ambos imunofluorescência γH2AX e ensaio cometa alcalino mostrou diferenças significativas entre as duas linhas celulares, com o dano ao DNA intrínseca sendo maior no A2780 do que em A2780 células /C30. Particularmente, utilizando coloração de imunofluorescência γH2AX, células A2780 exibiu 28,8 ± 3,4% de células positivas (isto é, células com mais de 5 focos por célula) e A2780 /C30 17,4 ± 3,4% de células positivas (

P

= 0,01; Quadro 2 ). Além disso, usando o teste do cometa, células A2780 apresentou valores OTM de 33,9 ± 5,5 unidades arbitrárias, enquanto as células /C30 A2780 mostrou 14,4 ± 2,9 unidades (

P Art 0,001; Tabela 2).

para expor a eficiência de reparação do ADN nestas duas linhas de células, as células foram tratadas com carboplatina (0-300μg /ml) durante 24 h seguido por pós-incubação em meio isento de droga para 0-24 h e o dano no DNA induzido ( ou seja, danos de DNA total normalizado pelo dano do ADN intrínseca) foi analisada no final do tratamento medicamentoso. Ambos imunofluorescência γH2AX e ensaio cometa mostrou diferenças significativas entre as duas linhas celulares. Isto é, em ambas as linhas de células de danos no ADN atingiu níveis mais elevados no final do tratamento medicamentoso, com danos no DNA ser significativamente maior do que em células A2780 em A2780 /C30 células (dados não apresentados). Depois disso, os níveis de danos no DNA induzida por carboplatina foram reduzidos ea extensão da reparação foi significativamente menor no A2780 do que em A2780 /células C30 (

P Art 0,03). Particularmente, usando microscopia confocal os focos γH2AX foram removidas com t

1/2 = 5,2 ± 0,7H em A2780 células /C30 e 11,7 ± 2.6h em células A2780. Usando teste do cometa, a t

1/2 valores para reparação de danos induzida por carboplatina em células A2780 /C30 e A2780 foram 9,9 ± 1,3H e 16,7 ± 3,4H, respectivamente.

Além disso, a Área Sob a Curva (AUC) de danos no ADN induzida por carboplatina, um parâmetro que reflecte a carga global de dano de ADN resultante da formação de danos e reparação de ADN inicial foi calculado (Tabela 2). Usando γH2AX imunofluorescência coloração, as células A2780 mostraram valores de AUC [expressos em (% de células coloração positiva γH2AX) x (dose carboplatina)] de 17200 ± 3650 e A2780 células /C30 12400 ± 2140 (

P

= 0,01). Além disso, teste do cometa confirmou as conclusões anteriores com células A2780 mostrando os valores da AUC [expresso como (OTM x dose de carboplatina)] de 14900 ± 3280, enquanto as células A2780 /C30 mostrou valores da AUC de 9400 ± 1150 (

P = 0,01

).

Além disso, ambos os tipos de células foram tratadas com várias doses de carboplatina (0-300μg /ml) durante 24 h e a indução de apoptose foi medida 24 horas pós-tratamento. Descobrimos que as taxas de apoptose foram maiores nas células A2780 do que em A2780 /células C30 (

P

= 0,001; Tabela 2). Em particular, as células A2780 mostrou evidência de apoptose em doses tão baixas como carboplatina 43,8 ± 5.6μg /ml, enquanto que as células /C30 A2780 necessária uma dose de 78,5 ± 9.2μg /ml, indicando que a sensibilidade ao fármaco das células inversamente correlacionadas com o seu DNA capacidade de reparação (Tabela 2).

uma descoberta notável foi que após o tratamento carboplatina, uma fração de células mostrou difusa, brilhante γH2AX coloração pan-nuclear. Estudos anteriores demonstraram que γH2AX coloração pan-nuclear representa um sinal de pré-apoptótica associada com ATM- e apoptose dependente de JNK durante a replicação [31]. Em linha com os resultados das experiências de eficácia de reparação de ADN, observou-se níveis mais elevados de coloração pan-nuclear γH2AX [expressa como AUC (% de células coradas pan-nucleares) x (dose de carboplatina)] em células A2780 (13400 ± 2850) de em A2780 /células C30 (7500 ± 1760) (

P

= 0,001, Tabela 2).

reparo do DNA deficiente do dano induzido por platina em PBMC de pacientes OC se correlaciona com melhor resultado clínico

Virando-se para PBMC, de acordo com estudos anteriores [32], descobrimos que foram observados após o tratamento de não-dividindo PBMC com drogas de platina, taxas muito baixas ou nulas de indução das principais moléculas em estudo. Por isso, em primeiro lugar tratado a partir de PBMC nove voluntários saudáveis, com várias doses de PHA durante até 72 h para induzir a proliferação das células. Os melhores resultados foram obtidos após a incubação de PBMC 48h com 10 ng /ml de PHA (dados não mostrados). Em seguida, os PBMCs foram tratados com cisplatina (0-300μg /ml durante até 3H), seguido por incubação em meio isento de droga para 0-24 h ou com carboplatina (0-1800μg /ml durante até 24 horas), seguido por incubação em pós- meio isento de droga para 0-24h. Em conformidade com os resultados das experiências de linhas de células, por qualquer um dos fármacos de platina, uma indução dependente da dose de todas as moléculas-chave foi observada (Fig. 3A, C), com o γH2AX mostrando novamente os índices de indução mais elevados (Fig. 3B , D). Além disso, os níveis de danos no ADN induzida por platina em CMSPs de os mesmos nove voluntários saudáveis ​​foram medidos utilizando o ensaio de cometa alcalino. Nós também descobrimos que o

ex vivo

tratamento de PBMC com cisplatina (Fig. 3E) ou carboplatina (Fig. 3F) mostrou um aumento dose-dependente dos níveis de danos no DNA. Tomados em conjunto, os resultados de ambas as linhas celulares e PBMC experiências indicam que a quantificação de imunofluorescência e ensaio de focos γH2AX cometa alcalino duas abordagens poderosas para a quantificação dos danos no DNA induzidos por platina em amostras clínicas.

PBMC a partir de nove saudável voluntários eram

ex vivo

tratados (a) com cisplatina (0-300μg /ml) durante 3 horas ou (B) com 150μg /mL de cisplatina, subsequentemente incubadas em meio isento de droga para vários períodos de tempo (0- 24 h), e depois analisados ​​utilizando microscopia confocal. Além disso, as mesmas CMSPs a partir de voluntários saudáveis ​​foram tratados (C) com carboplatina (0-1800μg /ml) durante 24 h ou (D) com 1400μg /carboplatina ml durante vários tempos (0-24h) e analisada no final do tratamento usando microscopia confocal. As barras de erro representam o desvio padrão. Finalmente, as PBMC foram tratadas com (E) a cisplatina (0-150μg /ml) durante 3 horas ou (F) carboplatina (0-1800μg /ml) durante 24 h e depois analisados ​​utilizando o ensaio de cometa. Os diagramas de caixa mostrar distribuição estatística dos níveis de danos no DNA. As linhas horizontais dentro das caixas representam os valores médios e as linhas verticais que se estendem acima e abaixo da caixa de indicar os valores máximos e mínimos, respectivamente. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

Em seguida, utilizando estes ensaios Foram examinados os níveis intrínsecas de danos no DNA em PBMC não tratados provenientes dos três grupos de indivíduos (em voluntários saudáveis, os pacientes sensíveis e pacientes resistentes à quimioterapia platina ). Ambos γH2AX imunofluorescência coloração e teste do cometa mostrou diferenças significativas entre os três grupos de indivíduos (todos os

P Art 0,05; Tabela 3), com a danos no DNA intrínseca sendo maior em pacientes de OC do que em voluntários saudáveis. Curiosamente, em linha com os resultados a partir das linhas celulares de carcinoma do ovário experiências, níveis mais elevados de danos no ADN intrínseca foram observados em PBMC de pacientes sensíveis em comparação com os que são resistentes à quimioterapia subsequente platina (γH2AX,

P

= 0,05; cometa ensaio,

P

= 0,003; Tabela 3; Figura 4A-D).. Particularmente, utilizando coloração de imunofluorescência γH2AX, pacientes sensíveis à platina apresentaram número de células positivas de 16,8 ± 2,3%, os pacientes resistentes à platina-8,9 ± 2,4%, enquanto os voluntários saudáveis ​​apresentaram 3,9 ± 1,2% de células positivas (Quadro 3; Fig. 4A). Usando teste do cometa, pacientes sensíveis à quimioterapia platina apresentaram valores OTM de 20,1 ± 5,5 unidades arbitrárias, resistente à platina 7,8 ± 2,5, enquanto voluntários saudáveis ​​mostrou 2,4 ± 1,1 unidades (Tabela 3; Fig. 4C). Curiosamente, para confirmar que as diferenças entre os sinais de DDR são realmente reflectora de sensibilidade de platina, em vez de o tipo de tumor, pacientes que tenham a mesma histotipo foram divididos em sensíveis e resistentes à terapia de platina e as intrínsecas os níveis de danos de ADN foram comparadas. Embora cada subgrupo contem um pequeno número de amostras, os resultados mostraram que as diferenças nos níveis de danos de ADN intrínsecas são reflexo de sensibilidade de platina. Por exemplo, em apenas tumores serosos, usando coloração γH2AX, pacientes sensíveis (

n

= 6) apresentaram maiores níveis de danos no DNA intrínseca (valor, células positivas de 16,6% média; gama, 13,1-23,2%) do que resistente paciente (

n

= 1; 7,5%). Além disso, no cancro do ovário células claras somente, doente mais sensível (

n

= 1) apresentaram número de células positivas de 18,5%, enquanto os pacientes resistentes (

n

= 3) apenas 9,4% (variação de 6,3 -13,7%). Resultados semelhantes foram obtidos utilizando o ensaio de cometa.

(A) Os diagramas de caixa, mostrando a distribuição estatística dos níveis de danos ao DNA intrínseca em PBMC não tratados utilizando quantificação de imunofluorescência γH2AX. HV, voluntários saudáveis; Sens: pacientes OC sensíveis à terapia de platina subsequente; Res: pacientes OC resistentes à terapia de platina subsequente. (B) imagens típicas da análise de microscópio confocal de varrimento laser de PBMC dos três grupos; imagens superiores, coloração γH2AX; imagens de fundo, núcleos de células marcadas com DAPI. parcelas (C) caixa mostrando distribuição estatística dos níveis de danos ao DNA intrínseca em PBMC não tratados utilizando ensaio cometa alcalino. (D) a partir de imagens típicas cometa PBMC não tratadas dos três grupos de indivíduos. Os diagramas de caixa, mostrando a distribuição estatística dos níveis de danos no DNA em PBMCs estimuladas em proliferação utilizando PHA e tratados com carboplatina (0-1800μg /ml) durante 24 h, utilizando (E) imunofluorescência quantificação de γH2AX e ensaio de cometa (F) alcalina. As linhas horizontais dentro das caixas representam os valores médios e as linhas verticais que se estendem acima e abaixo da caixa de indicar os valores máximos e mínimos, respectivamente. Todos os ensaios foram realizados em triplicado.

Para examinar a eficácia de reparação do ADN nos três grupos de indivíduos, após incubação de 48 horas com PBMCs de 10 ug /ml de PHA, as células foram tratadas com carboplatina (0 -1800μg /ml) durante 24 h, pós-incubadas em meio isento de droga para 0-24 h e o dano no DNA induzido foi analisada. Ambos γH2AX imunofluorescência coloração e teste do cometa mostrou resultados semelhantes. Isto é, em todos os indivíduos analisados ​​danos no ADN atingiu níveis mais elevados no final do tratamento medicamentoso, com danos no DNA ser maior em pacientes OC do que em voluntários saudáveis; pacientes sensíveis à platina mostraram níveis mais elevados de danos no ADN do que os de platina-resistente (dados não mostrados). Depois disso, os níveis de danos no DNA foram eliminados e a extensão da reparação foi maior em voluntários saudáveis ​​do que em pacientes. Curiosamente, em linha com os resultados das experiências de linhas celulares, os doentes sensíveis à platina mostrou significativamente menor eficiência do que as reparação resistente a platina (

P

0,03). Particularmente, usando microscopia confocal os focos γH2AX foram removidas com t

1/2 = 2,7 ± 0,5 h nos controles saudáveis, 8,8 ± 1,9 h em resistente à platina e 15,4 ± 3,2H em doentes sensíveis à platina.