Abstract

Fundo

Numerosas análogos de vitamina D apresentaram taxas de resposta pobres, altas toxicidades sistémicas e hipercalcemia em testes em humanos para tratar o câncer. Identificou-se a primeira anti-cancro vitamina D MT19c análogo não-hipercalcémico, alterando o anel A ergocalciferol. Este estudo descreve a eficácia terapêutica e mecanismo de ação do MT19c tanto em

in vitro

e

in vivo

modelos.

Metodologia /principal achado

antitumoral eficácia de MT19c foi avaliada em células do cancro do ovário (SKOV-3) xenoenxertos em ratinhos nus e um modelo do cancro do ovário de ratos singénicos. níveis séricos de cálcio de MT19c ou calcitriol animais tratados foram medidos. In silico de simulação de ancoragem molecular e um ensaio de repórter VDR base de células revelou interação MT19c-VDR. análise de mRNA genoma de tumores MT19c tratados identificados alvos de drogas que foram verificados por immunoblotting e microscopia. Quantificação de malonil-CoA celular foi realizada por HPLC-MS. Um estudo de ligação com o receptor de PPAR-Y foi realizada. MT19c reduziu o crescimento do câncer de ovário em modelos de xenotransplante e animais singeneicos sem causar hipercalcemia ou toxicidade aguda. MT19c é um antagonista fraco do receptor de vitamina D (VDR) que interrompeu a interação entre VDR e SRC2-3 coativador. a análise do mRNA de todo o genoma e transferência de Western e microscopia de MT19c tratados tumores de xenoenxerto mostraram inibição da actividade da sintase dos ácidos gordos (FASN). MT19c reduziu os níveis celulares de malonil-CoA em células SKOV-3 e actividade EGFR inibido /fosfoinositol-3kinase (PI-3K) independentemente da proteína PPAR-gama.

Significância

efeitos antitumorais de não- hipercalcêmico agente MT19c fornecer uma nova abordagem para a concepção de vitamina D de moléculas anticancerígenas base e uma base racional para o desenvolvimento de MT19c como um agente terapêutico para tumores ovarianos malignos, visando oncogênico

de novo

lipogênese.

citação: Moore RG, Lange TS, Robinson K, Kim KK, Uzun A, Horan TC, et al. (2012) Eficácia de um não-hipercalcêmica vitamina D2-Derived Anti-Cancer Agent (MT19c) e inibição da síntese de ácido gordo em um Modelo de Xenoenxerto cancro do ovário. PLoS ONE 7 (4): e34443. doi: 10.1371 /journal.pone.0034443

editor: Olivier Gires, Universidade Ludwig-Maximilians, Alemanha |

Recebido: 06 de julho de 2011; Aceito: 02 de março de 2012; Publicação: 03 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Moore et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. RKS e LB são listados como co-inventores sobre um pedido de patente pendente. Heterociclos e seus derivados e métodos de fabrico e utilização terapêutica US 2009/0221529 A1. A patente foi atribuída a Mulheres e Crianças Hospital de RI, a presente empregador do autor RKS, TSL, KKK, RGM, NK, TCH, KR, JFP, MDP, SC, e NH. Nenhuma outra consultoria, produtos em desenvolvimento relacionadas com este agente existe. Nenhum dos fatos mencionados acima alterar adherance dos autores a todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha dos dados e materiais.

Introdução

cancro do ovário

epitelial (EOC) é a principal causa de morte de doenças malignas ginecológicas. cancros em início de carreira são na sua maioria assintomática, ea maioria dos diagnósticos na apresentação detectar estabelecida metástases regionais ou distantes [1]. A maioria dos pacientes experimentarão recorrência da doença, bem como a resistência a agentes quimioterapêuticos. A baixa taxa de sobrevivência de câncer de ovário estágio avançado fez a detecção precoce, a compreensão da etiologia da doença e os ataques de características específicas, como as principais prioridades na pesquisa do câncer [1].

O aumento da

de Novo

síntese de ácidos graxos é uma característica marcante do câncer [2], [3]. Otto Warburg observada pela primeira vez glicólise anaeróbia melhorada em células [4] cancerosas. tecidos humanos normais usar gorduras alimentares para a síntese de novos lipídios estruturais, enquanto que incessantemente proliferação de células cancerosas por razões desconhecidas evitar a utilização de gorduras da dieta e realizar

de novo

síntese de ácidos graxos para fornecer continuamente para a produção de membrana, a geração de energia independente e modificação lipídica de proteínas [4].

De novo

de ácidos graxos síntese envolve duas enzimas-chave; acetil Co-A carboxilase (ACC) e sintase de ácido gordo (FASN). carboxilatos ACC acetil-CoA para malonil-CoA formar. O produto de malonil-CoA é ainda convertido por FASN de ácidos gordos de cadeia longa. ácidos gordos recentemente sintetizadas são armazenados por lipolítica PPAR-gama, para evitar toxicidade de ácido gordo. Portanto, as funções desregulado de enzimas lipogênicas FASN ACC e envolvido em

de novo de ácidos gordos de síntese em conjunto com lipolítica PPAR-gama desempenhar um papel importante na promoção da sobrevivência de células tumorais em múltiplos níveis.

numerosos estudos mostraram sobreexpressão de FASN no cancro epitelial de ovário humano (EOC) [5] – [8] e cancros da mama [9], próstata [10], do cólon [11], do pulmão [12], do endométrio [13] e de tireóide papilar [14]. Um microarrays de oligonucleótidos que consistem em mais do que 6000 genes humanos identificados sintase de ácido gordo (FASN) como um potencial alvo terapêutico ou molecular em EOC [15]. Posteriormente, uma segmentação farmacológico da FASN pela cerulenina produto natural e uma molécula sintética C75 suprimiu o crescimento do câncer de ovário e de mama em modelos animais [16] – [17]

No presente estudo, mostramos que MT19c é uma nova classe de agentes anti-tumor que tem como alvo os componentes críticos de

de novo

ácido gordo máquinas de síntese em tumores de xenoenxerto de cancro do ovário e células de cancro do ovário. MT19c é um novo agente de vitamina D2 derivada que exerceu nenhum efeito hipercalcêmicos e exibido índices de segurança muito elevados em ratinhos nus. MT19c é um antagonista do VDR fracos que rompe interacções VDR-co-ativadoras e não apresentam interacções clássicos calcitriol-VDR [18]. Em baixas doses de MT19c, tumores de xenotransplante de ovário ou ratos sing�icos mostrou parcial para completar a resposta e estendeu a taxa de sobrevivência significativamente em comparação com os animais de controlo. Este estudo descreve uma nova abordagem para a concepção de classe segura e eficaz de agentes anticancerígenos da vitamina-d que são desprovidos de hipercalcemia, bem como clássicos do tipo toxicidades de vitamina D. Além disso, os dados fornecidos aqui verificado que a ênfase atual na segmentação

de novo

gordos máquinas enzima síntese de ácido para tratar o câncer de ovário é uma abordagem viável para o tratamento de câncer de ovário humano, e com base neste MT19c estudo foi identificado como uma promissora candidato para a avaliação clínica em doentes com cancro do ovário humano.

resultados

Os estudos de eficácia de MT19c em modelos animais EOC

A eficácia anti-tumoral de MT19c (Fig. 1A) foi estudada utilizando xenoenxertos de células EOC humana derivados in nude (/nU nU) ratos, bem como modelo de rato singênica baseado rato cancro do ovário em Fisher-344 ratos. Para o primeiro estudo de células SKOV-3 suspensas em Matrigel foram inoculados subcutaneamente no flanco um de cada animal. Os animais foram atribuídos a um tratamento (n = 20) ou um grupo de controlo (n = 10). Veículo ou MT19c (5 mg /kg de pc) foi administrado IP em dias alternados durante 60 dias a ratinhos portadores SKOV-3 tumores derivados. Os animais foram pesados ​​(Figura 1B, painel inferior) e o tamanho do tumor medido (Figura 1B, painel superior) a cada 5 dias. Observou-se ganho de peso normal para veículo e ratos tratados de drogas durante o tratamento. O tamanho do tumor aumentou nos animais de controlo com um aumento médio de 2 vezes do diâmetro do tumor durante o período experimental. No grupo de tratamento, o tamanho do tumor diminuiu significativamente durante os últimos 15 dias de tratamento com 5 de 8 animais que apresentaram uma resposta completa (Fig. 1B, painel superior). as taxas de sobrevivência dos animais foi significativamente diferente entre os grupos de tratamento e controle (p = 0,0001, Fig. 1C) com base na análise de Kaplan-Meier. Durante o período de avaliação, os ratos tratados com veículo atingiu o ponto final (10 mm diâmetro do tumor) no prazo de 20 dias de tratamento, enquanto uma porção do MT19c animais tratados sobreviveram até o final do estudo.

(A) estrutura química do MT19c. (B) A actividade anti-cancro de MT19c num modelo de EOC em ratinhos. Os ratinhos nus (20 tratada e 10 controlos) tendo SKOV-3 xenoenxertos tumorais derivadas foram doseados (IP) quer com veículo de controlo ou MT19c (5 mg /kg de pc) em dias alternados durante 60 dias. O tamanho do tumor foi calculado (painel superior), utilizando um compasso de calibre e a cada 5 dias de peso registada (painel inferior). análise de sobrevivência (C) de Kaplan-Meier. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier para MT19c e ratos tratados com veículo foi realizada usando STATA 9 (StataCorp, College Station, TX) e SAS 9.1 software (SAS Institute, Cary, NC). (D) A eficácia da MT19c num modelo EOC singeneico em ratos. Fisher 344 ratos (3 animais /grupo de tratamento) foram injectados IP com células EOC rato Nutu-19. Após 3 semanas, quer MT19c (100 ou 500 ug /kg de pc) ou veículo foram injectados IP diariamente durante 12 dias. Os tecidos tumorais foram colhidas e peso omental (D-1), o volume ascítico (D-2) e o peso corporal (D-3) gravado. peso omental média eo volume foram comparadas pelo teste t de Student com variâncias desiguais. O painel inferior mostra o índice de resposta (D-4).

Como uma abordagem independente para determinar a atividade anti-câncer do MT19c

in vivo

empregamos um rato singênica bem definida modelo EOC [19] Fisher 344 ratos foram divididos em dois grupos de tratamento de 3 animais cada e um grupo de controle. células EOC ratos Nutu-19 foram injectados IP. Após 3 semanas, 0,1 ou 0,5 mg MT19c /kg de pc ou veículo foram injectados IP diariamente. Uma média de 22 ml de líquido ascítico foi coletado em animais de controlo no final do estudo (Fig. 1D, o volume de ascite). Múltiplos tumores pequenos (0,1-1,5 cm de diâmetro) foram observados no omento, intestino, diafragma, a parede peritoneal e superfície de todos os outros órgãos abdominais. MT19c tratamento dependente da dose, reduziu a formação de ascite em média de 0,5 mg /kg de pc e suprimiu a formação de nódulos de tumor. Da mesma forma, o tratamento MT19c dependente da dose, reduziu o peso médio omental (Fig. 1D). Neste estudo utilizou-se uma dose muito baixa de MT19c, em comparação com o estudo de toxicidade aguda (400 mg /kg de pc) ou o modelo de xenoenxerto de murganhos de cima e estudo de toxicidade de longo prazo (5 mg /kg de pc; 10 × maior). Notavelmente, na dose de 0,5 mg MT19c /kg de pc todos os 3 animais tratados apresentaram regressão do tumor (Fig. 1D, o índice de resposta). Um animal apresentou uma resposta completa. O peso dos animais em ambos os grupos de controle e tratamento aumentou durante este experimento (Fig. 1D).

efeitos MT19c sobre os níveis séricos de cálcio e estudos de toxicidade em modelos animais

calcitriol Atualmente conhecido /análogos da vitamina D3- causar hipercalcemia. Nós, portanto, investigar se MT19c pode causar hipercalcemia em animais, apesar de alterada conformação A-anel. Em animais, MT19c não causar hipercalcemia, durante 35 dias de julgamento animal. Calcitriol mostrou níveis de cálcio significativamente mais elevado de soro (15,5 mg /dL) no fim do tratamento do que os ratos MT19c tratados (-10 mg /dl) que estava mais próximo de níveis de cálcio no grupo de controlo (p 0,05) (a Fig. 2A).

(A) níveis séricos de cálcio em ratos após o tratamento MT19c. 8 ratos cada foram tratados com MT19c (5 mg /kg de pc) ou calcitriol (10 ug /kg de pc) ou veículo (EtOH) durante 35 dias, o sangue recolhido e o cálcio no soro analisadas no dia 35. Alterações no cálcio sérico médio foi significativa ( P 0,05) em comparação entre os grupos pelo teste t de Student com variâncias desiguais (B) estudo de toxicidade aguda de MT19c. MT19c ou veículo foi administrado a ratinhos nus e os animais foram monitorizados quanto a qualquer toxicidade observável. (C) MT19c num rastreio VDR agonista ou antagonista. VDR-sobre-expressar VDR-UAS-bla células 293T HEK foram tratados durante 5 h com calcitriol /vitamina D3 (12:01-1 nM; painel esquerdo) ou MT19c (1 nm e 1 PM; painel do meio) e VDR-activação foi analisada. Para analisar os efeitos antagônicos do ensaio foi realizado (RECEPTOR NUCLEAR Profiling serviços baseados em celular SelectScreen®: https://www.invitrogen.com) após a estimulação das células com calcitriol /vitamina D3 (120 pm) e tratamento com MT19c (1 nM -1 mM; painel direito;) durante 5 h. (D) Resumo das principais características do MT19c e compostos relacionados. Comparação de MT19c com a calcitriol e outros derivados de vitamina D clinicamente relevantes.

Um estudo de toxicidade aguda para determinar a segurança de MT19c foi realizada pelo National Cancer Institute (NCI) em ratinhos nus atímicos. MT19c foi administrado por via intraperitoneal (IP) em doses de 400, 200, 100 mg /kg de pc (um animal /dose) e os animais foram monitorizados por um período de 13 dias (Fig. 2B) para gravar qualquer toxicidade observável (ver Informação de Apoio S1) . MT19c não mostraram qualquer toxicidade em qualquer um dos três doses testadas. medidas de toxicidade aguda a concentração que irá afectar negativamente a saúde do animal, e letalidade é o desfecho mais comum.

MT19c não afeta VDR transcrição em células

MT19c mostrou um efeito antagonista fraco em uma fluorescência ensaio de polarização com a utilização do domínio de ligação ao ligando de VDR e um péptido marcado fluorescente coativador [20]. Para determinar a regulação da transcrição de VDR em células após tratamento MT19c empregamos um ensaio funcional-VDR-repórter baseada em células (GeneBLAzer® Tecnologia, www.invitrogen.com) utilizando transformada HEK293 células (ver Informações de Apoio S1). Estas células HEK293T expressar uma proteína de fusão do domínio de ligação ao ADN VDR-LBD-GAL4, que é activada pelo calcitriol e induz a transcrição de um gene repórter de beta-lactamase. A activação da transcrição de VDR na presença de MT19c foi determinada após 5 hr de pré-tratamento com o calcitriol controlo (12:01-1 nM) (Fig 2C;. Painel da esquerda). Ou MT19c (1 nM-1? M) (Fig 2C ; painel do meio). Calcitriol causada VDR-activação às 10 horas (IC

50~30 pM). MT19c não mostrou actividade agonista nas concentrações testadas. Para analisar os efeitos antagonistas, células estimuladas pelo calcitriol (120 pM) foram tratados com MT19c (1 nM-50 ^ M) (Fig 2C;. Painel da direita) durante 5 h. MT19c inibida VDR-activação induzida por calcitriol apenas em concentrações relativamente elevadas (IC

50~30 uM). Assim MT19c emergiu como um antagonista extremamente fraco VDR não atingiu significância biológica. MT19c é aproximadamente 1000 vezes antagonista VDR menos potente que o TEI-9647 ou ZK159222 [21].

Molecular Docking Simulation (MDS) de VDR e MT19c interação

Na maioria das actualmente conhecidas calcitriol /vitamina -D3 análogos são agonistas do VDR. Para melhor compreensão molecular sobre uma possível interacção entre MT19c com o VDR que empregue um MDS com base na estrutura de MT19c como o VDR liganded ao calcitriol (PDB ID: 1DB1) [22] utilizando o programa AutoDock 4.0 [23]. complexos de proteína-ligando possíveis foram selecionados com base na sua ligação de energia livre e a conformação de menor energia ancorada foi escolhido como um possível candidato para MT19c interação /VDR. FIG. 3A representa o MDS para VDR e calcitriol (painel da esquerda) ou MT19c (painel da direita). Na bolsa de ligao de VDR, os resíduos que estão em contacto com calcitriol foram utilizadas como referência (Fig. 3B) e para MT19c os mesmos resíduos foram escolhidos para caracterizar as interacções. Observamos que MT19c adquiriu um alojamento invertida no VDR domínio de ligação ao ligando comparação com calcitriol. MT19c é a primeira classe de vitamina D da molécula para demonstrar essa única interação VDR-LBD. -Se do lado do alojamento de MT19c em VDR-LBD foi altamente consequencial que pessoas com deficiência o clássico calcitriol-VDR como interações que definem as funções genômicas de vitamina-D. Além disso, o espaço de chave entre as hélices 11 e 12 no VDR domínio em calcitriol, ou o antagonista ZK168281 cadeia lateral (C-25) ligam-se (Fig. 3D, painel esquerdo) está ocupado pelo anel-A de MT19c ligação ao ligando-(Fig . 3D, painel da direita). Curiosamente, MT19c revelou uma ligação entre o carbonilo do anel-A com resíduo VDR H397 (2.05 Â) (Fig. 3E, painel da direita), em comparação com o grupo 25-hidroxi de calcitriol (2,8 A) (Fig hidrogénio mais perto 3E. , painel esquerdo). efeitos múltiplos descrito acima, incluindo a estrutura do anel A alteradas alargada a MT19c que interrompeu a conformação natural de hélices 11,12 e 13 na entrada invertida no VDR-LBD, interações biologicamente irrelevantes com 15 resíduos de aminoácidos-chave da VDR-LBD, e distorção nas hélices 11, 12 e 13 que permite interações VDR-co-ativadoras pode explicar porque MT19c é não-hipercalcêmico em animais [21].

(a) estruturas 3D de VDR /calcitriol e complexos /MT19c VDR.

Painel esquerdo:

complexo /calcitriol VDR (Calcitriol no centro, hélice 11 = cor branca).

Painel direito:

VDR complexo /MT19c (MT19c no centro, 11 = verde claro). MDS foi realizada utilizando o programa AutoDock 4.0 com a estrutura de MT19 e de calcitriol VDR-liganded fornecida pela Protein Data Bank. Imagens de estruturas foram gerados utilizando UCSF quimera. (B) Sequência do local de ligação do ligando de VDR. código de cor amarela representa hélices na estrutura. código de cor verde representa aminoácidos com interação direta com o ligando (calcitriol). (C) Comparação Interaction.

Painel esquerdo:

Interação entre Leu227 e calcitriol.

Painel direito:

Interação entre Leu227 e MT19c. (D) Comparação de hélice 12 e 11 da hélice interacções com ligandos.

Painel esquerdo:

Interação entre hélice 11 (roxo), hélice 12 (amarelo) e calcitriol.

Painel direito:

Interação entre hélice 11 (branco), hélice 12 (amarelo) e MT19c. Em ambos os painéis interacção entre a His397 em hélice 11 e o ligando é descrito. (E) As distâncias entre Seus 397 e ligantes.

Painel esquerdo:

Interação entre His397 e calcitriol.

Painel direito:.

Interação entre His397 e MT19c

MT19c inibe EGFR sinalização tanto in vitro como in vivo, mas não afeta a expressão de PPAR-gama

Para identificar os alvos moleculares de MT19c em células de cancro do ovário, uma análise do gene Conjunto de análise de Enriquecimento de (AGEE) do genoma de largura de ARNm de tratados com veículo (controle) e MT19c tumores tratados no dia-8, dia 16 e dia 30, foi conduzida em triplicado usando Human Gene Affymetrix 1.0 ST array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Os dados de expressão foi depositado em www.ncbi.nlm.nih.gov endereço (ACC = GSE23616). MT19C tratados tumores de xenoenxerto mostrou consistentemente níveis mais baixos de expressão de genes envolvidos no metabolismo energético (p ,00000000055). Com base nos níveis de expressão com maior significância estatística (p = 0,00000005; ponto de corte), nós agrupados os genes metabólicos importantes que foram afetados por uma análise Pathway Ingenuity (IPA). A expressão diferencial de EGFR, PI3K, PRKAA2, THRSP, SREBF1, malonil Co-A carboxilase, acetil-CoA carboxilase e sintase dos ácidos gordos no controlo e grupo de tratamento no dia-8, dia 16 e dia-30 é mostrada na Fig. 4A.

(A) análise genômica de tumores xenoenxerto tratados ingênuos ou MT19c. SKOV-3 xenoenxertos foram tratados com veículo ou MT19c (5 mg /kg de pc) e tecido de tumor foram recolhidos no dia-8, 16 e 30. O ARNm de tumores foi analisado por chips de microarray Affymetrix em triplicado e expressão de genes foi agrupado por análise GSEA. A diferença na expressão dos genes a partir de tumores tratados MT19c foi expressa como% do controlo (±). (B) Expressão do EGFR nuclear (nEGFR) SKOV-3 em tecidos de xenoenxertos tratados com veículo ou MT19c. SKOV-3 foram tratados com xenoenxertos MT19c ou veículo. Embebidos em parafina tecidos foram processados ​​e corados com anticorpo de fósforo-EGFR AlexaFluor-conjugado e analisadas por microscopia confocal, como descrito na secção Materiais e Métodos. O EGFR é mostrado no verde juntamente com corante nuclear DAPI. Ampliação: 40 × 2 (C) análise de transferência de Western de fosfo-EGFR e fosfo-PI-3K e expressão de EGFR nuclear (nEGFR) nas células SKOV-3. (Painel esquerdo): células SKOV-3 foram tratadas com 250 nM MT19c. PAGE e análise Western blot dos lisados ​​de células foi realizada. Activado fosfo-EGFR e fosfo-PI-3K foi visualizado por imunotransferência utilizando anticorpos primários que reconhecem fragmentos clivados. Como padrão interno para a igualdade de carregamento (50 ug /pista de proteína total celular) membranas foram sondadas com um (tubulina anticorpo (painel da direita):. Expressão de EGFR nuclear (nEGFR) no veículo (painel superior), calcitriol (2 uM, painel do meio) e MT19c (250 nM, painel inferior) trataram células SKOV-3 por microscopia de imunofluorescência EGFR é mostrado nas colunas verdes e direita mostra DNA (azul) Ampliação:.. 40. (D) MT19c suprimiu a actividade de quinase PI-3K em As células SKOV-3. SKOV-3 foram tratados com células MT19c (0, 250 nM) durante intervalos de tempo indicados. Os lisados ​​celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo específico para a actividade de fosfo-tirosina e PI3K foi determinada com o ensaio in vitro da quinase lipídica. PIP- . 3 (fosfoinositida 3-fosfato), o produto final fosforilado é mostrada o gráfico de barras que mostra os resultados de varrimento densitométrico de uma experiência representativa (e):.. Identificação da interacção entre MT19c e PPARy usando polarização de fluorescência de Perturbação de ligação entre PPARγ- LBD e peptídeo DRIP2 fluorescente por MT19c foi investigada na presença ▪ e • ausência de agonista GW929. Os controles foram veículo DMSO (▴ com agonista, ○ sem agonista), ▾ peptídeo DRIP2 não marcado (controle positivo) e ♦ peptídeo DRIP2 fluorescente por si só (controle positivo).

As células cancerosas organizar a exigência de energia por reorientando o equilíbrio metabólico lipogenic /lipolítica prever e sustentar o crescimento do câncer através da redefinição de funções do EGFR, PPAR-gama, e síntese de ácidos graxos e máquinas glicólise [24]. Segmentação de EGFR e outros componentes de metabolismo tem sido, portanto, postulou para melhorar o resultado da terapia do cancro do ovário [6], [25]. Para entender o efeito da MT19c em EGFR e sua cascata de sinalização a jusante no cancro do ovário, nós investigamos o efeito da MT19c em EGFR e atividade PI-3kinase em Skov-3 células por análise de western blot, microscopia e um

in vitro

PI-3kinase ensaio da atividade.

a expressão gênica (GSEA) mostrou que MT19c suprimida a expressão do EGFR nos tumores tratados no dia-8. Além disso, os tumores tratados até ao dia-30 mostrou regulação baixa significativa de EGFR, enquanto a ativação menor de EGFR nos tumores tratados até dia 16 indicando esforço oposição contra a ação da droga foi observada (Fig. 5A). A seguir, os dados de microarray validado no EGFR por análise de imunohistoquímica de células SKOV-3 tratadas xenoenxertos tratados com veículo ou MT19c (5 mg /kg de pc). As lâminas de tumores colhidos congeladas rapidamente do veículo ou animais tratados com o fármaco na Fig. 1B foram imuno-coradas com um anticorpo FITC-EGFR (R D systems, MN, USA) e contra-coradas com DAPI dissolvido em meio de montagem Vecta-shield (laboratórios Vector, CA). A microscopia confocal dos tumores de controlo coradas fosfo-EGFR mostraram forte coloração citosólico e núcleos densamente empacotados, enquanto MT19c tumores tratados demonstraram uma redução significativamente coloração quantitativa ou expressão em relação ao controle (Fig. 4B)

.

(AC) Ocidental blot análise de proteínas lipogenetic em células SKOV-3. As células SKOV-3 foram tratadas com 250 nM MT19c ou veículo durante 24 h. Análise da expressão de proteínas por transferência de Western dos lisados ​​com anticorpos primários contra a sintase dos ácidos gordos (FASN), acetil Co-A carboxilase (ACC), ACC fosforilada e AMPA foi realizada (Material e Métodos). experiências representativas são mostrados. Como um padrão interno para o carregamento igual (50 ug /pista de proteína total celular) manchas foram sondadas com um anti – (-. Anticorpo tubulina (B) transmembranar mitocondrial despolarização-potencial (ΔΨm) análise após tratamento MT19c células SKOV-3 foram tratados. para 3 ou 24 h com MT19c 1 uM fixadas e coradas com DIOC

18 (3) e análise por FACS realizada. o diagrama de barras que descreve o número de células não-fluorescente (%) com perda ΔΨm. Uma experiência representativa é mostrada . (C) Efeito de substratos de sintase dos ácidos gordos na citotoxicidade de MT19c. SKOV-3 células, pré-incubadas com citrato (1 mM), acetil co-a (200 uM) durante 1 h e variando a concentração de MT19c (0, 1 uM) foram adicionados e as células foram incubadas durante 24 horas e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTS. (D) libertação de LDH em células SKOV-3. SKOV-3 células foram tratadas com várias concentrações de MT19c (0, 1 uM) foram adicionados e as células foram incubadas durante 24 horas e a libertação de LDH usando o kit de estimativa Cytotox (Promega). (e) a expressão de proteínas de síntese dos ácidos gordos em tumores de xenoenxerto sem tratamento prévio e MT19c tratada. Expressão de ácido gordo sintase (FASN) e fosfo-acetil-CoA carboxilase (ACC) em veículo (painel da esquerda) e MT19c (5 mg /kg de pc, painel da direita) tratada SKOV-3 xenoenxertos foi determinada por microscopia de imunofluorescência um confocal. FASN é mostrada em verde e fosfo-ACC é mostrado em vermelho. ADN é mostrado em azul. Ampliação: 40 × 2. (F) por HPLC-MS quantificação da malonil-CO-A o conteúdo em MT19c tratada células SKOV-3. As células SKOV-3 foram tratados com veículo ou MT19c (500 nM) em meio DMEM isento de soro. extractos solúveis em ácido foram analisadas por HPLC-MS. A área de retenção integrais e tempo da malonil-CoA no grupo de controlo e de tratamento foi comparado com o padrão de referência (Sigma-Aldrich). (Painel da esquerda): tempo de retenção do padrão de referência (Sigma Alrich, EUA); (Painel do meio): tempo de retenção de malonil-CoA no veículo tratado SKOV-3 células; (Painel da direita): tempo de retenção de malonil-CoA na MT19c (500 nM) trataram células SKOV-3

Para estudar o efeito funcional do MT19c na expressão do receptor de EGF em células de cancro do ovário examinamos EGFR. localização em células SKOV-3

in vitro

após tratamento com MT19c. As células SKOV-3 foram tratados com MT19c (100 nM) ou de calcitriol (2 uM) durante 12 horas em condições isentas de soro. As células foram processados ​​tal como descrito na secção Materiais e Métodos. Um exame microscópico das células tratados com veículo apresentaram morfologia celular clara e intacta, com coloração transmembrana EGFR em companhia de alguns núcleos densamente manchada (Fig. 4C, painel superior esquerdo). Uma coloração com DAPI mostrou também integridade estrutural intacto de ADN e cromatina (Fig. 4C, painel superior direito). Ao contrário do veículo, calcitriol células tratadas mostraram coloração nuclear altamente intensa e específica devido à translocalização nuclear e demonstrou falta de coloração transmembrana (Fig. 4C, painéis de média). Por outro lado, contrariamente ao calcitriol, tratamento MT19c não promover EGFR translocalização nuclear e uma forte coloração transmembranar EGFR entre a população de células semelhantes a células tratados com veículo foram observadas (Fig. 4C, painéis inferiores). Alguns núcleos com corante nuclear densa na população de células tratadas MT19c, de facto, foram remanescente de apoptose do que a translocação nuclear. Notou-se que os tumores de xenoenxerto citosólica apresentaram coloração mais forte do que a coloração transmembranar observado para as células de cancro do ovário SKOV-3 em cultura, indicando possivelmente o micro-ambiente do tumor diferencial do ambos os tipos de células (Fig. 4B e 4C). Uma análise western blot da droga tratada SKOV-3 células mostrou que MT19c suprimida activação de EGFR dentro de 12 horas de tratamento (Fig. 4C, painel esquerdo).

Desde EGFR regula diretamente muitas funções críticas do PI-3kinase [ ,,,0],5], para analisar a actividade de PI-3kinase nas células SKOV-3 aquando da aplicação de MT19c (250 nM) foi realizada uma actividade de PI-3kinase [26]. A PI3-cinase (PI3K) regula muitos processos celulares, tais como o metabolismo celular, sobrevivência celular, apoptose e no cancro e phosphotidylionositol-3,4,5-trifosfato (PIP-3) é o mediador chave da transdução de sinal PI-3kinse [ ,,,0],27]. PIP-3 é sintetizado a partir phosphotidylionositol-4,5-difosfato (PIP-2) [28]. Com base em nossa análise de imunoprecipitação, observou-se que o tratamento MT19c (250 nM) subregulado produção PIP-3 significativamente dentro de 12 horas em relação ao controle (Fig. 4D). A medição de densidade de pixels de ponto de carga representando PIP-3 quantidade de lisato de controlo eluiu-se através de cromatografia em camada fina (TLC) foi 14480 unidades enquanto que a amostra tratada MT19c mostrou 9 síntese vezes menos quantitativa de PIP-3 (densidade de pixels 1304) (fig. 4D, painel inferior). Surpreendentemente, a produção de PIP-3 foi fortemente regulada positivamente duas vezes dentro de primeiras 3 horas de tratamento, indicando pressão pró-sobrevivência após a aplicação da droga. Para compreender melhor o efeito do MT19c sobre a expressão da PI-3kinase, uma transferência de Western foi levada a cabo. MT19c (250 nM) de tratamento mostrou a regulação negativa da fosforilação PI-3kinase em células SKOV-3 no prazo de 12 horas (Fig. 4C, painel esquerdo).

MT19c não afecta a componente de PPAR-gama do metabolismo dos lípidos no ovário células cancerosas

EGFR superexpressão ativa função PPAR-gama nas células cancerosas para protegê-los de toxicidade palmitato [24]. PPAR-gama é um alvo potencial para a prevenção e tratamento de cancro [29]. Foi examinada a interacção de MT19c com o receptor nuclear PPAR-gama através da realização de um ensaio de polarização de fluorescência. Na ausência de agonista de PPAR-gama (GW949), não observada uma interacção entre o PPARy e DRIP2 proteína coactivador. Da mesma forma, na presença de agonista GW949 foi observada nenhuma interrupção da interação entre VDR e DRIP2.

MT19c suprimida a expressão ácido graxo sintase em tumores de xenoenxerto

EGFR /PI-3Kinase aumenta a lipogênese no câncer células por activar máquinas lipogénica sintase dos ácidos gordos (FASN) em conjunto com γ PPAR [5]. A sobre-expressão de FASN no cancro epitelial de ovário humano (EOC) foi mostrado [7] – [10]. Uma tela de microarranjos de oligonucleótidos sintase dos ácidos gordos identificados (FASN) como alvo molecular potencial em EOC [17]. análise de mRNA de todo o genoma dos tumores de xenoenxerto ingênuos e MT19c tratada claramente identificados ação MT19c na expressão FASN em MT19c tratados de xenotransplante de cancro do ovário (p = 0,00000000055) (Fig. 4A) [30].

Observamos através immunoblotting que o tratamento MT19c expressão reprimida de FASN e acetil-Co a-carboxilase (ACC) em células SKOV-3 (Fig. 5A) dependente do tempo. Examinamos se MT19c regula FASN e ACC em tumores de xenoenxerto tratados. xenoenxertos colhidas dos grupos de tratamento sem tratamento prévio e MT19c foram imuno-coradas com anticorpo FASN e analisadas por microscopia de fluorescência para distinguir a coloração FASN no grupo de controlo contra o grupo de tratamento. Enquanto os tumores tratados com veículo apresentaram coloração intensa e homogénea em torno de gotículas lipídicas incorporados nos tecidos (Fig. 5D, painel superior esquerdo), MT19c tumores tratados mostraram significativa falta de coloração e /ou coloração residual parcial (Fig. 5E, o painel superior direito). Observou-se a presença de 2 campos gordos na secção de tecido inteiro que foram densamente manchadas no controle. De igual modo apenas dois campos gordos foram detectados na secção de xenoenxerto tratados com fármaco e a coloração FASN em torno deles foi significativamente menor do que os tecidos tratados com veículo de controlo. Realizamos medições da intensidade de fluorescência de secções de tecido inteiras de tanto o controle e tecido de droga tratada e calculada a média e a densidade óptica integrada (IOD). Como mostrado na Fig. FIG.