Sumário

Regulação da expressão genética é um dos vários papéis propostos para o tetrafosfato diadenosina nucleotídeo induzida por estresse (Ap

4a). Examinamos isso diretamente por uma análise de RNA-Seq comparativo de KBM-7 células de leucemia mielóide crônica e células KBM-7 em que o

NUDT2

(células Nuko) Ap

gene 4A hidrolase tinha sido interrompido, causando um aumento de 175 vezes na intracelular Ap

4A. 6.288 genes diferencialmente expressos foram identificados com

P Art 0,05. Destes, 980 foram up-regulada e 705 sub-regulada em células Nuko com um fold-change ≥ 2. Ingenuity

® Análise Pathway (IPA

®) foi usado para atribuir estes genes a vias canônicas conhecidos e funcional redes. Caminhos associados a respostas de interferão, receptores de reconhecimento de padrões e inflamação marcou altamente no conjunto regulada para baixo de genes enquanto as funções associadas a MHC antígenos de classe II foram destaque entre os genes regulados positivamente, que de outra forma mostrou pouca organização em grandes conjuntos de genes funcionais. catabolismo do triptofano foi também fortemente regulada negativamente como foram numerosos genes conhecidos por estarem envolvidos na promoção de tumores em outros sistemas, com papéis na epitelial-mesenquimal transição, a proliferação, invasão e metástase. Por outro lado, alguns genes pró-apoptóticos foram up-regulada. Principais factores a montante previstos pelo IPA

® para o gene para baixo-regulação incluídos NFkB, STAT1 /2, IRF3 /4 e SP1 mas sem grandes fatores que controlam gene-regulação foram identificados. Os mecanismos potenciais para regulação de genes mediados por Ap

4A e /ou

NUDT2

perturbação incluem a ligação de Ap

4A ao HINT1 co-repressor, a activação autócrina de purinoceptors por Ap

4A, cromatina remodelação, efeitos de perda na estabilidade NUDT2 transcrição, e de inibição de factores de regulação dependentes de ATP, tais como proteina-quinases por AP

4A. A evidência existente favorece o último deles como o mecanismo mais provável. Independentemente disso, nossos resultados sugerem que a proteína NUDT2 poderia ser um alvo quimioterápico do câncer novela, com a sua inibição potencialmente exercer efeitos anti-tumorais fortes através de vias múltiplas envolvendo metástase, invasão, imunossupressão e apoptose

Citation:. Marriott AS, Vasieva O, fang Y, Copeland NA, McLennan AG, Jones NJ (2016)

NUDT2

Disruption Eleva diadenosina Tetrafosfato (Ap

4A) e Genes sub-regula a resposta imune e Promoção do Câncer. PLoS ONE 11 (5): e0154674. doi: 10.1371 /journal.pone.0154674

editor: Francisco J. Esteban, Universidade de Jaen, Espanha

Recebido: 09 de dezembro de 2015; Aceito: 18 de abril de 2016; Publicado em: 04 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Marriott et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante dados analisados ​​estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Além disso, todos os arquivos de dados estão disponíveis no (número de acesso E-MTAB-4104) de banco de dados ArrayExpress

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Norte Cancer Research Oeste (https://www.nwcr.org) conceder números CR968 a AGM, NJJ e NAC; CR891 para NAC; e número NWCR pesquisa comunhão BR879 para NAC (www.nwcr.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução hidrolases

Nudix regular os níveis de uma grande variedade de nucleotídeos canônicas e modificados e alguns substratos fosforilados não-nucleotídeos, bem como participar de processos essenciais, como mRNA decapping [1, 2]. Um dos mais bem estudado é NUDT2 mamíferos. Este enzima tem sido isolado a partir de muitas fontes [3, 4] e o seu substrato principal é que se acredita ser diadenosina 5 ‘, 5’ ” –

P

1,

P

4-tetra fosfato (Ap

4A). Nas células animais, Ap

4A pode ser sintetizado pela maioria das aminoacil-ARNt-sintetases, ligases de ADN, sintetases firefly luciferase e acil-CoA enquanto uma outra gama de enzimas é capaz de fazê-lo em plantas, fungos e bactérias [7/5 ]. Síntese geralmente envolve a transferência de AMP a partir de uma acil-AMP ou reacção enzima-AMP intermediário para um aceitador de ATP. Ele também pode ser degradado por uma série de enzimas, além de NUDT2, incluindo FHIT [8], aprataxin [9] e fosfodiesterases não específicos [3]. No entanto, NUDT2 se acredita ser o principal responsável pela manutenção do baixo nível de intracelular Ap

4A [10-12].

Um aumento de Ap

4A resultante da ativação da síntese, inibição da degradação ou ambos tem sido implicada em vários processos intracelulares. Genotóxicos, térmicas e outros estresses levar ao aumento Ap

4A [13-17] e assim Ap

4A tem sido implicado na regulação da replicação do DNA após danos no DNA e na promoção da apoptose [17-19]. Ap

4A também podem ser levantadas em resposta a ligantes externos e atuar como um segundo mensageiro intracelular [20-22]. Também actua como um mensageiro extracelular através da sua interacção com um número de receptores de P2 do tipo [23]. Ap

4A é também um ligando para um número de proteínas, incluindo um complexo multiproteico contendo ADN polimerase-α [24, 25], protea-quinases [26-28], ADN-glicosilase de uracilo [29], as chaperonas proteína [30] , o supressor de tumor HINT1 [31], 5′-nucleotidase, II [32], proteínas de domínio CBS [33, 34] e CFIm25 [35], mas na maioria dos casos, o significado desta ligação não é clara. De particular interesse, no entanto, é a possibilidade de que p

4A pode actuar como um regulador da transcrição. Tem sido sugerido que um aumento do nível de p

4A induzida em mastócitos por factores externos activa a expressão de um subconjunto de genes controlados pelos factores MITF e USF2 transcrição por ligação a e deslocando a proteína HINT1 inibidora destes factores [ ,,,0],10, 31, 36].

a fim de determinar se a regulação da transcrição por Ap

4A está confinado a relativamente poucos genes ou é mais difundido, analisamos o transcriptoma de um derivado nocaute da KBM- 7 linha de células de leucemia mielóide (LMC) crônica [37] em que o nível intracelular de Ap

4A foi aumentado 175 vezes pela ruptura da

NUDT2

gene (KBM-7-Nuko, referido daqui em diante como Nuko). Estas células apresentam alterações profundas na expressão do gene em comparação com a linha de células KBM-7-mãe com um total de 6288 genes diferencialmente expressos significativamente (degs) identificadas. Ingenuity

® Análise Caminho foi usada para destacar as redes de genes e processos metabólicos e de sinalização afetadas, revelando a regulação negativa de interferon, respostas imunes e inflamatórias inatas e up-regulação dos processos que envolvem antígenos MHC classe II. Além disso, muitos dos genes mais fortemente afetados têm um papel na promoção da metástase e invasão de câncer, sugerindo que NUDT2 podem oferecer um romance, alvo pleiotropic para quimioterapia do câncer.

Materiais e Métodos

Células

o KBM-7 de referência clone B (número de produto. P00174E07) e o derivado de KBM-7-Nuko (P01289H04), na qual o

gene NUDT2

foi inactivado por inserção do gene-armadilha retroviral [ ,,,0],38] foram obtidas a partir de Haplogen e mantida a 37 ° C em 5% (v /v) CO

2 /ar em Isocoves modificado meio de Eagle (IMEM, Sigma) suplementado com 10% (v /v) fetal Bovine Serum ( Sigma), 2 mM L-glutamina (Sigma) e 100 ug mL

-1 penicilina-estreptomicina (Sigma).

Medição de Ap

4A e derivados

O nível intracelular Ap

4A em células KBM-7 e Nuko fase log foi determinada como descrito anteriormente usando um ensaio luminométrico sensível com pequenas modificações para utilização com células em suspensão [17, 39]. As células foram recolhidas da suspensão por centrifugação a 500

g

durante 5 min e utilizada para a extracção de nucleótidos. Ap

4A também foi medida no meio de crescimento sobrenadante destas células, o qual foi filtrado através de um filtro Millipore de 0,2 um, desproteinizado com TCA a 10%, em seguida, ensaiadas como descrito acima. derivados de Ap

4A (ADPR-Ap

4A) foram separados por cromatografia de troca iônica e identificados e doseados como descrito anteriormente [17].

ensaios de inibição do crescimento

As células (2 x 10

5) foram semeadas em 25 cm

2 frascos contendo 7 ml de meio de crescimento. Foram adicionados agentes químicos como indicado e as células cultivadas durante 96 h a 37 ° C após o que as culturas foram centrifugadas a 500

g

durante 5 min, as células foram ressuspensas em meio fresco, e contadas utilizando um hemocitómetro. contagens médias foram normalizados para a contagem de células de cultura não tratada

análise de RNA-Seq:. biblioteca de cDNA e sequenciação preparação

Três amostras independentes de ARN total foram preparados a partir de ambos KBM-7 e Nuko células. extracção de RNA foi realizada usando um kit Qiagen RNeasy Mini com QIAshredder, e a quantidade e qualidade determinada utilizando um Nanodrop e Agilent Bioanalyzer. Para cada uma das seis amostras, 10? G de ARN foi utilizando um Ambion TURBO ADN

livre

™ kit e, subsequentemente, purificado usando esferas AMPure XP tratados com ADNase. 2 ug do ARN total tratado com ADNase foi então sujeita a depleção de rRNA usando a ribo-ouro zero (/rato /Rato Humano) kit e purificado de novo com grânulos Ampure XP. depleção bem sucedido foi avaliada utilizando um fluorómetro e Qubit Agilent Bioanalyzer 2100 e todo o ARN esgotado foi utilizado para a preparação da biblioteca de ARN-Seq utilizando o protocolo ScriptSeq V2. Após 15 ciclos de amplificação de bibliotecas foram purificadas usando esferas Ampure XP. Cada biblioteca foi quantificada utilizando Qubit e a distribuição do tamanho avaliada utilizando o Agilent Bioanalyzer 2100. As bibliotecas finais foram misturadas em quantidades equimolares utilizando os dados Qubit e Bioanalyzer. A quantidade e a qualidade de cada agrupamento foi avaliada com o Bioanalyzer e por qPCR utilizando o kit KAPA Biblioteca Quantificação para plataformas Illumina sobre uma Roche LC480II Cycler luz de acordo com as instruções do fabricante. O DNA molde foi desnaturado de acordo com o protocolo descrito no manual do utilizador Illumina CBOT e carregado com uma concentração de 9:00. A sequenciação foi levada a cabo sobre uma pista de uma Ilumina HiSeq 2000 com a versão 3 química gerando 2 × 100 pb final emparelhado lê. O controle de qualidade foi mantida com um 1% phix spike-in.

análise bioinformática de dados de RNA-Seq

Basecalling e de-multiplexação de indexado lê para cada biblioteca amostra foi realizada utilizando casava 1.8. 2 (Illumina). arquivos fastq brutos foram processados ​​usando [40] Cutadapt 1.2.1 com a opção “-O 3” definido para remover as sequências de adaptador de 3 bp ou mais. Lê foram ainda cortados usando Sickle 1.200 para remover bases de baixa qualidade e, finalmente, lê 10 pb foram removidos. O TopHat2 alinhador versão 2.0.10 [41] foi usada para alinhar o aparadas R1-R2 ler pares para o conjunto do genoma de referência humano GRCh38, que contém 64,253 genes. parâmetros padrão foram utilizadas, exceto para a opção de tipo de biblioteca, que foi definido como “fr-secondstrand” para todas as amostras como o kit utilizado produziu uma segunda cadeia tipo de biblioteca (R1 é esperado para mapear na cadeia 5 ‘→ 3’ e R2 em 3 ‘→ 5’ cadeia). Lê alinhando a referência em mais de uma posição foram descartados e os valores FKPM (fragmentos por transcrição quilobases por milhão lê mapeados) calculado. A análise da expressão diferencial de genes foi realizado no ambiente de R utilizando o pacote facetadora [42]. Os dados de contagem foram normalizados entre bibliotecas utilizando a média valores M aparadas método (TMM) no aparador com os parâmetros predefinidos. parâmetros de dispersão Tagwise foram estimados e, em seguida, usado para log

2FC (log

2 Fold Change) estimação e testes em Edger usando a razão de verossimilhança (teste LR) [43].

valores P

associados com log

2FC foram ajustados para testes múltiplos utilizando a abordagem Falso Descoberta Rate (FDR) [44]. Degs significativas foram definidos como aqueles com um

P

valor 0,05. Todos os dados de RNA-Seq originais produzidos neste estudo foram submetidos ao banco de dados EMBL-EBI ArrayExpress sob o número de E-MTAB-4104.

análise de RT-PCR dos genes selecionados

extração de RNA foi realizada usando um kit Qiagen RNeasy Mini com QIAshredder e ADNc foi sintetizado utilizando um kit de síntese de ADNc Tetro Bioline, ambos de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi então quantificada por PCR utilizando Maxima SYBR Green Master Mix (Thermo) e um sistema de PCR em Tempo Real StepOnePlus ™ (Applied Biosystems). Os iniciadores foram obtidos da Sigma e estão listadas na Tabela S1. O 2 método

-ΔΔCt foi usada para determinar os níveis de transcrição relativa utilizando o gene housekeeping GAPDH para normalizar os dados [45].

análise Pathway

Genes mostrando ≥ 2 vezes para cima ou para baixo-regulação com um

P

valor 0,05 foram analisados ​​através do uso de QIAGEN Ingenuity

® software Análise Pathway (IPA

®, QIAGEN, Redwood City, https://www.ingenuity.com), a fim de atribuí-los a diferentes redes funcionais. IPA

® usa a curadoria manualmente Ingenuity® Knowledge Base, que contém informações de vários genes e expressão de proteínas, interação e bancos de dados de anotação, como intacta, BIND e MIPS, bem como a partir da literatura publicada [46]. Nós também utilizado IPA para identificar genes relacionados funcionalmente que correspondem a vias canônicas específicas que eram mais significativa para o conjunto de dados a partir de uma coleção de 200 metabólica, cascata de sinalização celular e associados à doença vias curadoria. teste exacto de Fisher de independência foi usada para calcular a probabilidade de que a associação entre os genes no conjunto de dados e a via canonical pode ser explicada apenas por acaso. Por fim, foi utilizada a análise do regulador a montante IPA para identificar os fatores que podem controlar os genes e vias destacadas por meio de análise de rede para fornecer hipóteses testáveis ​​para a regulação gênica por Ap

4A.

Resultados

nível de Ap

4A em 7 KBM-Nuko células

o pai KBM-7 linha utilizada neste estudo contém o

BCR-ABL1

fusão de genes e mutações potencialmente de inactivação em

TP53

e

NOTCH1

, mas não tem as outras aberrações genéticas comuns encontradas em malignidades mielóides [38]. Exprime a maioria das proteínas anotados a partir de uma grande variedade de vias de sinalização, tornando-se uma linha celular adequada para este estudo. A ausência completa de proteína NUDT2 do Nuko

NUDT2

disruptant foi confirmada por Western blotting (Figura 1). A concentração de estado estacionário intracelular Ap

4A em células de mamíferos átonas é tipicamente na faixa de 0,1-1,0 pmol /10

6 células (0,05-0,5 ^ M), sendo a quantidade exacta de espécies e célula do tipo dependente [17, 47]. células em fase log KBM-7 tinha um nível de 0,21 ± 0,02 (

n

= 3) pmol /10

6 células. No entanto, o derivado Nuko teve um aumento do nível 175 vezes de 36,9 ± 0,3 (

n

= 3) pmol /10

6 células, proporcionando a evidência mais clara até agora de que Ap

4A é um importante substrato NUDT2

in vivo

e que esta enzima desempenha um papel essencial na manutenção do baixo nível de Ap

4A fundo. Note-se que um teor Ap

4A de 1 pmol /10

6 células equivale a cerca de uma concentração intracelular de 0,5 mM se uniformemente distribuído [17] para o nível em células Nuko será em torno de 20? M. Sobre se este nível elevado e as mudanças resultantes nas células aqui relatados são biologicamente relevante, já anteriormente medido até 20 mM Ap

4A em células de reparação defeituosa de ADN tratadas com mitomicina C [17], enquanto uma concentração tão alta quanto 775 uM foi reportado em mastócitos FCεR1-activado [31]. A análise cromatográfica do Ap

4A a partir de células Nuko mostrou que cerca de 35% estava presente sob a forma de derivados de ADP-ribosylated (ADPR-Ap

4A), principalmente mono-ADPR-Ap

4A (Fig 1 ). Foi anteriormente mostrado que a ADP-ribosilação de um p

4A por PARP1 e PARP2 em células de hamster chinês EM9 e fibroblastos de embrião de ratinho ocorre em resposta a danos no ADN [17]; no entanto, parece que o alto nível de Ap

4A aqui está sujeito a constitutiva ADP-ribosilação.

Um extrato de nucleotídeos a partir de células Nuko foi submetido a cromatografia de troca iônica e frações analisadas luminometrically para Ap

4A como descrito em Materiais e Métodos. Inserção: uma amostra de NUDT2 e proteína extractos recombinantes de células KBM-7 e KBM-7 Nuko foram sujeitos a electroforese em gel de poliacrilamida e blots de nitrocelulose subsequentes sondadas para a presença de NUDT2 com anticorpo policlonal de coelho anti-NUDT2 (Santa Cruz) seguido por detecção com conjugado com HRP de IgG de cabra anti-coelho e visualização de ECL (ECL Select, GE Healthcare). Rato β-actina foi detectado com HRP-conjugado de cabra anti-rato IgG (Santa Cruz).

Análise da expressão diferencial de genes RNA-Seq e

Ap

4A tem foi relatado para activar a transcrição de subconjuntos de genes controlados por factores de transcrição e de MITF USF2 [31, 36]. Em vista disso, e para continuar a explorar o fenótipo dos

NUDT2

knockout células, foi realizada uma análise comparativa dos transcriptomes de KBM-7 e células Nuko por RNA-Seq para identificar degs. Uma média de 46,1 milhões de pares de 100 pb emparelhado-end leituras por amostra foram gerados que alinhado com o genoma de referência humano. Os resultados do alinhamento encontram-se resumidos na Tabela 1, que mostra o número e a percentagem de leituras mapeado para cada amostra. percentagens de mapeamento para os seis amostras foram entre 80,2 e 81,3%. 31,177 (48,5%) dos genes de referência 64,253 tinha, pelo menos, uma leitura alinhada enquanto 33,076 genes não tinha leitura alinhados a partir de qualquer uma das seis amostras.

A diferença nos perfis de expressão de gene entre os dois tipos de células é ilustrado na trama Análise de componentes Principais (PCA) de dados de expressão de genes log2 mostrados na Fig 2A. As amostras em triplicado de cada tipo de células são agrupadas bem longe um do outro, o que indica um elevado grau de expressão diferencial de genes entre eles. Além disso, o mapa de calor dos coeficientes de correlação de Pearson na Fig 2B indicam que os perfis de expressão para as três amostras a partir do mesmo tipo de célula foram muito mais intimamente correlacionados do que amostras a partir de diferentes tipos de células, demonstrando que o efeito de

NUDT2

knockout na expressão do gene era muito mais forte do que a influência de quaisquer variações técnicas biológicas ou entre amostras. O mapa de calor também mostra uma correlação muito elevada (P 0,99) entre as amostras do mesmo tipo celular. Assim, podemos concluir que a expressão diferencial de genes detectados aqui é estatisticamente muito robusto.

(A) enredo PCA de dados de expressão de genes log2 mostrando a 2

º e 3

componentes principais Rd. visualização (B) Heatmap dos coeficientes de correlação de Pearson de log

2 expressão gênica entre as amostras. As três amostras de tipo selvagem células KBM-7 são rotulados WT1-WT3 e aqueles a partir das células KBM-7-Nuko KO1-KO3. (C) enredo MA mostrando a distribuição dos níveis de expressão de genes médios (log

2Counts por milhão mapeados lê) contra log

2 Fold-Change (KO

vs

WT) para respostas de genes individuais. genes de expressão baixo (Log

2CPM -5) laranja são coloridos. Significativas genes diferencialmente expressos (degs) são de cor vermelha; genes que mostram nenhuma mudança na expressão são de cor preta.

Dos 31.177 leituras mapeada (S2 Table) de um total de 6.288 degs foram identificados com um

P

-valor (FDR-ajustado ) 0,05, dos quais 2.550 foram up-regulada e 2.285 regulada para baixo com um ≥ fold-change 1.2 (Fig 2C e S3 Tabela). A trama MA na Figura 2C mostra uma distribuição bastante simétrica de genes para cima e para baixo-regulados em todos os níveis de expressão. Destes genes, 980 foram supra-regulados e 705 regulada negativamente com uma dobra de mudança de ≥ 2. Em ambos os casos, 88% tinha FPKM ≥ 0,3 para um ou ambos os conjuntos de dados de WT e KO. O down-40 e mais fortemente sobre-regulada genes anotados estão apresentados nas Tabelas 2 e 3, respectivamente. Note-se que muitos destes genes tinha zero contagens de leitura tanto para os conjuntos de dados WT ou KO que requeiram a adição de uma pequena zero deslocamento pseudocount pelo software Edger para calcular log

2FC [42].

A análise de RNA-Seq foi validado através da realização em tempo real qRT-PCR em uma variedade de genes que representam várias vias afectadas (Fig 3). Estes resultados confirmam a direção da regulação (para cima ou para baixo) para todos os genes estudados. A magnitude da mudança também foi semelhante para a maioria dos genes, com um coeficiente de correlação de 0,83 entre os dois conjuntos de dados (Fig 3, inserção). No entanto, para alguns genes com um valor de zero de FPKM para uma das amostras em análise de RNA-Seq, a utilização do método pseudocount por facetadora para calcular uma dobra-mudança conduziu a um valor significativamente diferente, v.g.

GFRA1

e

TNF

. No entanto, os valores calculados pelo facetadora são utilizados nas discussões seguintes como eles estão disponíveis para todos os genes e ainda uma boa indicação relativa da mudança na expressão. A fim de mostrar que a expressão diferencial de genes observada correlaciona-se apenas com o aumento de P

4A, em vez de os

derivados 4A relacionados ADPR-AP, a análise de qRT-PCR foi também realizada com ARN extraído de células Nuko cultivadas na presença de 100 nM KU-0058948, um inibidor de PARP1 PARP2 e que impede a síntese de ADPR-Ap

espécies 4A [17]. Os resultados foram muito semelhantes aos obtidos na ausência de KU-0058948 (Figura 3), mostrando que, para estes genes, pelo menos, ADPR-Ap

4A não é a causa da expressão diferencial. A função de ADPR-Ap

4A, se for o caso, ainda não é clara.

análise de qRT-PCR foi realizada em ARN seleccionados da KBM-7 e células Nuko na presença e na ausência de 100 nM do inibidor de PARP KU-0058948 utilizando os iniciadores listados na Tabela S1 tal como descrito em Materiais e Métodos e o log

2-dobra mudança na expressão plotado ao lado aqueles obtidos por análise de RNA-Seq. Inset: Lote de correlação simples do log

2 dobrável mudanças na expressão obtidos por RNA-Seq (

x

-axis) e qRT-PCR sem inibidor PARP (

y

-axis ).

Ingenuity

® Pathway Analysis

a fim de colocar os dados de expressão gênica em um contexto biológico, Ingenuity

® Análise Pathway (IPA

® ) o software foi utilizado para atribuir os degs para vias canónicas conhecidas e redes funcionais, a fim de prever as funções biológicas das alterações da transcrição. Para simplificar, a análise inicial incluiu genes que foram apenas para cima ou para baixo-regulado por ≥ 2 vezes (

P

0,05); No entanto, quando presentes nas vias redes e os genes resultantes, para cima ou para baixo-regulados por ≥ 1,2 também foram considerados de interesse potencial como não há nenhuma justificação biológica para um valor de corte de 2. Verificou-se que os degs mapeado para um grande número de vias, com uma pontuação de enriquecimento significativo (-log (

P

-valor)) (Tabela S4). Top classificado dentro ambos os conjuntos de genes para cima e para baixo-regulados foram vias de sinalização relacionadas com a imunidade e inflamação. Vias principalmente associada com a resposta imune inata, tais como a activação de factores de interferão reguladoras (IRFs) por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), e inflamação foram especificamente enriquecido no conjunto regulada para baixo de genes, enquanto as funções associadas com antigénios MHC da classe II foram específicos para o conjunto de genes up-regulamentados (Tabela 4). A predominância destas vias no conjunto de dados pode reflectir a natureza mielóide da linha celular KBM-7 [37]. Estas vias são discutidos em detalhe abaixo.

resposta do interferon e da imunidade inata.

Os interferões são importantes mediadores da resposta imune inata, que fornece uma defesa vital inicial contra patógenos invasores (vírus , bactérias, protozoários) a seguir à interacção de componentes de agentes patogénicos com PRRs em diferentes compartimentos celulares. Eles também podem inibir a proliferação celular, modular a resposta imune adaptativa, e ser pro- ou anti-inflamatória, dependendo do contexto [48-51]. Apresentação do conjunto de 4.835 degs com a mudança vezes ≥ 1,2 a base de dados Interferome (v2.01) [52] revelou um subconjunto de, pelo menos, 1.038 degs se sabe serem reguladas por Tipo IFNs I (IFN e IFNp) em outros sistemas. Cerca de metade destes sobreposto com o conjunto de 944 exibição regulamento conhecido por Tipo II IFNs (IFN-y). Alguns (56) Tipo III (IFNλ) regulação também mostrou com 15 destes potencialmente exclusivos de um tipo III (S5 Tabela).

Figura 4 mostra o IPA

® via canonical para ativação de receptores de interferão (IFNRs ) por tipo I e tipo II interferões, com exemplos de genes que se encontram a ser expresso diferencialmente no presente estudo salientou. A maioria das funções nesta via foram regulada para baixo, com a expressão de

IFNb

sendo o (15 vezes, S3 Tabela) mais fortemente afetados. As vias de sinalização de JAK-STAT são essenciais para a resposta de interferão. No tipo de sinalização II interferão, homodímeros STAT1 activados ligar-se ao gás (Interferão Gama Sequência Activado) promotor e induzir a expressão do gene, enquanto a sinalização do tipo I envolve a combinação de heterodímeros STAT1-STAT2 com IRF9 (factor de resposta Interferon 9) formando ISGF3 (Interferão Estimulada Gene factor), o qual, em seguida, liga-se ao promotor ISRE (Estimulado por Interferon Elemento de resposta).

STAT1

,

STAT2

e

IRF9

foram todos regulada para baixo (1.4-, 1.8- e 3,7 vezes, respectivamente), enquanto que os supressores via

SOCS1

e

PTPN2

foram regulados positivamente (1,2-1,4 vezes). Embora individualmente ligeiro, o efeito combinado destas mudanças podem, no entanto, ser significativo. Os aumentos no

SOCS1

e

PTPN2

também mostram que não há apenas uma supressão geral da expressão do gene, mas que o feedback negativo através destes genes é preservada. Finalmente, vários dos genes controlados por STAT que são regulados negativamente são eles próprios activadores de mais genes de resposta de IFN, v.g.

IRF1

,

IRF7

e

IRF9

(1.2-, 3.8- e 3,7 vezes, respectivamente).

Down-regulada genes estão em verde, -regulada genes no vermelho. A intensidade da cor corresponde à mudança de dobragem; fronteiras negrito destacar genes com 2 vezes a mudança na expressão. Linhas correspondem às interações físicas e setas para relações funcionais entre proteínas. As linhas sólidas e flechas implicam relações directas e linhas pontilhadas e flechas implicam relações indirectas. relações funcionais incluem modificações pós-translacionais, regulação da transcrição, proteólise ou co-expressão. setas planas indicam inibição.

A via canônica na Figura 5 destaca os papéis das três PRRs helicase RIG-1-like da resposta imune inata, RIG-1 (DDX58), MDA5 (IFIH1) e LGP2 (DHX58) na activação de

ifnb

após estimulação por ARN de cadeia dupla e o feedback virais fornecida por IFNp na expressão destes PRRs. Todos os três genes receptores são regulados negativamente (3.1-, 2.3- e 3,0 vezes, respectivamente) (Tabela S3) em células Nuko. Além disso,

IFITM2

e

IFITM3

, cujos produtos restringir a entrada de muitos vírus [53], e todos os quatro membros da família antivirais iFit que se ligam componentes virais (

IFIT1

,

2

,

3

e

5

) [54] são regulados negativamente entre 1.6- e 6,8 vezes. Outros regulada genes anti-virais incluem

PKR

,

GBP1

e

TLR10

[55-58] (S3 Tabela).

Explicação dos símbolos como na Figura 4.

sinalização de citocinas, inflamação e NF-kB.

a interleucina-1 de sinalização (IL-1) é apanhado pelo IPA

® como um top sub-regulada via (Tabela 4) com expressão reduzida de importantes membros pró-inflamatórias de IL-1 superfamília [59]. Por exemplo, o ARNm para IL-1β, o seu receptor IL-1R1 e proteína acessória IL-1RAP são diminuídos 1.5-, 11.7- e 1,2 vezes, respectivamente, enquanto a IL-18, IL-18R1 e IL-18RAP são 2.3- para baixo, 3.0- e 4,0 vezes, respectivamente. A expressão de pró-inflamatória

IL32

também é reduzido cinco vezes, enquanto que a expressão do factor de necrose tumoral (

TNF ou

TNFa), que pode activar tanto de Tipo I os IFNs do mediador inflamatório e NF-kB, é regulada negativamente de 30 vezes (Tabela S3). A via canonical levando à activação transcricional de NF-kB por meio de IL-1, TNFa e outros ligandos é mostrado na Figura 6. O complexo NF-kB é um mediador importante das respostas inflamatórias e imunes e responde a PRRs e citoquinas pró-inflamatórias [ ,,,0],60]. Pode sinergia com STAT sinalização com o aumento da indução de genes-alvo resultantes de coordenar a ligação de estatísticas e NF-kB ao gás e NF-kB promotores. Os componentes p50 e P52 da NF-kB complexo e o

RELB

transativador são todos para baixo regulamentados, como muitos componentes de vias de sinalização que levam à ativação de NF-kB.

sabe-se que o Tipo IFNs I e TNF pode mutuamente suprimir a expressão de cada um dos outros, e tem sido sugerido que as alterações na regulação cruzada destas vias pode afectar o equilíbrio entre os potenciais papéis destrutivos e protecção destas citocinas na patogénese de doenças autoimunes doenças inflamatórias, tais como o lúpus eritematoso sistémico (SLE) e artrite reumatóide (RA) [61]. IPA

® identifica sinalização na AR como um caminho melhor classificado afetada canônico (Tabela 4) e a lista de degs associados com AR e LES são apresentados na Tabela S6. Embora as modestas alterações na expressão de alguns outros receptores de citocinas poderia ser potencialmente pró-inflamatórias (por exemplo,

IL10RA

e

IL23R

), o quadro geral é um dos supressão da inflamação pela elevada Ap

4A, com a regulação negativa da sinalização de NF-kB que caracteriza fortemente.

vias canónicos sobre-regulada e antigénios MHC de classe II.

KBM-7 células pode ser considerada como precursores imaturos para as células apresentadoras de antígenos profissionais, tais como macrófagos e células dendríticas e caminhos canônicos quase todo o top 20 up-regulamentados sinalizados pelo IPA

® envolvem funções associadas com a resposta imune adaptativa, incluindo apresentação de antígenos, a sinalização OX40, rejeição do enxerto e desenvolvimento de células B (Tabela 4 e Tabela S4). No entanto, deve salientar-se que esta é, em grande parte porque estas vias envolvem todos um dos conjuntos de genes sobre-regulada mais proeminentes, os indutíveis antigénios MHC de classe II (MHC-II). moléculas de MHC-II são principalmente preocupado com a apresentação de antigénios derivados de agentes patogénicos extracelulares, resultando em escorvamento de células auxiliadoras T CD4 + e a produção de anticorpos pelas células B [62]. Quase todos os genes do subtipo de classe II mostram um aumento significativo da expressão, com algumas apresentando um grande aumento, por exemplo,

HLA-DOA

47 vezes e

HLA-DPA1

12 vezes. *

P Art