Abstract

Immunosignaturing mostra promessa como uma abordagem geral para o diagnóstico. Tem sido demonstrado para detectar sinais imunológicos da infecção precoce durante o curso da doença e para distinguir a doença de Alzheimer a partir de controlos saudáveis. Aqui nós testar se immunosignatures correspondem às classificações clínicas da doença, utilizando amostras de pessoas com tumores cerebrais. Amostras de sangue de pacientes submetidos a craniotomias para tumores cerebrais terapeuticamente ingênuos com diagnóstico de astrocitoma (23 amostras),

Glioblastoma multiforme

(22 amostras), oligodendroglioma mista /astrocitoma (16 amostras), oligodendroglioma (18 amostras), e 34 caso contrário controlos saudáveis ​​foram testadas por immunosignature. Porque as amostras foram tomadas antes de adjuvante terapia, eles não são susceptíveis de ser perturbado por não-relacionadas com o cancro afecta. A plataforma immunosignaturing distinguido não só câncer no cérebro dos controles, mas também características patologicamente importantes sobre o tumor, incluindo o tipo, grau, ea presença ou ausência de O

6-metil-guanina-DNA promotor metiltransferase metilação (MGMT), um importante biomarcador que prevê a resposta à temozolomida no

Glioblastoma multiforme

pacientes

Citation:. Hughes AK, Cichacz Z, Scheck a, Coons SW, Johnston SA, Stafford P (2012) Immunosignaturing possível detectar os produtos de Marcadores moleculares no câncer de cérebro. PLoS ONE 7 (7): e40201. doi: 10.1371 /journal.pone.0040201

editor: Ernesto T. Marques, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de fevereiro de 2012; Aceito: 06 de junho de 2012; Publicação: 16 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Hughes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os fundos vêm desde a inicialização até SAJ do Estado do Arizona. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a identificação de biomarcadores para a detecção pré-sintomática da doença e classificação de estados de doença existente poderia fornecer um complemento rápida e barata para diagnóstico patológico padrão. Os investigadores continuam a procurar biomarcador de proteína transmitidas pelo sangue (s) para a detecção de câncer, mas a sensibilidade permanece teimosamente baixa [1], [2]. vigilância imunológica, no entanto, ocorre continuamente e é muito sensível a mudanças de perfis de antigénio [3], [4], [5], [6], [7]. Tem sido demonstrado que as células cancerosas eliciar uma resposta imunitária humor ai detectável [6], [7]. Os anticorpos são excelentes biomarcadores porque eles são estáveis ​​no soro, têm elevada especificidade e afinidade para o seu antigénio cognato, são abundantes, e permitir estudos retrospectivos. Uma célula B activado pode produzir anticorpos 5000-20,000 por minuto [8], [9] enquanto replicando cada ~ 70 hr [10] com uma vida útil de até 4 ½ meses [11], [12], levando a 10

11 amplificação de um sinal específico por semana. biomarcadores à base de anticorpos evitar o problema de diluição visto com biomarcadores de proteômica [13], [14] e, não só são muito abundantes, mas pode ser fisicamente capturados em nano e afinidades picomolar. Além disso, anticorpos não purificados são estáveis, permitindo que as amostras de arquivo para ser utilizada para os testes em que o RNA ou proteínas pode ter degradado [15]. O principal obstáculo à utilização de anticorpos como biomarcadores tem sido a nossa incapacidade para deconvoluir a informação contida na densa anticorpos, tal como elas existem num meio complexo [16]. Existem 10

9 especificidades distintas no sangue de um adulto médio, mais do que pode ser analisado individualmente. anticorpos câncer fingerprinting tem trabalhado no passado [17], [18], mas esta tem sido uma tarefa onerosa. Nós introduzimos immunosignaturing como uma abordagem simples e muito barato para diagnósticos. Aqui nós abordar se immunosignatures estão correlacionados com classificações biológicas ou clínicos.

As células cancerosas podem desencadear a produção de anticorpos contra antígenos próprios ou contra os neo-antígenos [3], [18], [19], [20 ], [21], [22], [23], [24]. Nós não temos nenhuma

a priori

maneira de determinar exatamente o perfil de antígenos será apresentado por uma célula cancerosa (embora a análise de bibliotecas de EST pode sugerir candidatos). Assim, a criação de uma micromatriz epitopo ou proteína capaz de detectar antigénios específicos do cancro seria difícil. Apesar de exibição em fagos tem sido mostrado para detectar anticorpos específicos para o cancro [17], [18], [25], por uma série de razões técnicas e práticas panning não é passível como uma ferramenta de diagnóstico. Criamos um microarray de uso único composto por 10.000 diferentes péptidos de sequência aleatória. Usamos os péptidos 20-mer que incorporam todos os aminoácidos possíveis, excepto cisteina que usamos como um ligante. Estes 20mers pode conter pelo menos 7 epitopos típica porte. apresentação de fagos e epitopo microarrays tendem a usar peptídeos mais curtos para evitar cross-talk e manter especificidade; no nosso caso, os péptidos mais longos nos permitem estender a complexidade do nosso microarray que tem relativamente poucos recursos. Além disso, as matrizes apresentam extremamente elevada reprodutibilidade de modo que mesmo pequenas diferenças na ligação entre o anticorpo e o péptido pode ser significativa. Os péptidos são impressos na densidade muito elevada, uma consideração importante quando se utiliza péptidos aleatórios para detectar anticorpos que se ligam ao mesmo ou micromolares afinidades milimolares [26]. A densidade destes péptidos de sequência aleatória sobre a superfície do microarray cria uma avidez semelhante onde a afectar a taxa de dissociação é retardado por várias ordens de grandeza, aumentando as interacções fracas mas reprodutíveis entre o anticorpo e o péptido. Padrões tornam-se detectáveis, e são tão reproduzível que sub-classificação de doenças é viável. Embora a matriz tem um efetivo muitos-para-muitos relação entre o anticorpo e peptídeo, os padrões produzidos não são de forma monótona; na verdade, eles são bastante distinguível de doença para doença. Assim, a ‘immunosignature’ é definido como o padrão comum de ligação que é compartilhado por pacientes com uma determinada doença, mas não com outra doença ou com controles saudáveis ​​[27], [28], [29], [30].

Nós perguntado se os anticorpos produzidos contra as células cancerosas pode estar relacionado com, ou servir como um proxy para, clinicamente biomarcadores de doenças úteis. Para responder à pergunta, nós nos concentramos em tumores cerebrais malignos. Embora a incidência de câncer no cérebro é relativamente baixo em comparação com outros tipos de câncer, como de mama e pulmão,

Glioblastoma multiforme

(GBM) é um dos tumores mais letais e agressivas com picos de incidência em ambas as populações mais jovens e mais velhos [31 ], [32]. Os tumores cerebrais malignos mais comuns são os astrocitomas, que consiste em grau II, grau III (anaplásico) e grau IV (GBM). Os tumores malignos também podem surgir a partir dos oligodendrócitos e são considerados de baixo oligodendroglioma grau (grau II) e oligodendroglioma anaplásico (grau III). Há também oligoastrocytomas mistos (de baixo grau e anaplásico). Menigiomas surgem a partir de células da aracnóide que cobrem o cérebro e são normalmente benignos, mas podem se repetem. Uma pequena porcentagem destes pode evoluir para graus mais elevados que são mais invasivas. De facto, os pacientes com qualquer um dos tipos de tumor mencionados podem apresentar-se com um tumor de alto grau inicialmente, ou eles podem progredir ao longo do tempo. Enquanto o diagnóstico de alguns destes tumores pode ser relativamente simples, tal não é sempre o caso [33], [34]. Neuropathologists são confrontados com o desafio de fazer chamadas consistentes – um painel de biomarcador não-subjetiva que pode distinguir entre estes diferentes tipos e graus de tumores cerebrais seria muito útil na eliminação de variância lab-to-lab. Neste artigo apresentamos dados que ilustra o desempenho da nossa plataforma immunosignaturing para a identificação de uma variedade de tipos de tumores cerebrais e subtipos.

Resultados

Immunosignaturing possível distinguir GBMs de outras doenças

resultados anteriormente publicados do nosso laboratório [26], [28], [29], [30] demonstraram assinaturas para a doença de Alzheimer, doença infecciosa, anticorpos monoclonais e policlonais. Em primeiro lugar, testou-se a hipótese de que uma resposta auto-imune ocorre em pacientes que sofrem de cancro cerebral. A fim de fazer isso, nós expusemos soro de 5 pacientes GBM aleatoriamente selecionados da nossa coorte e 3, controles saudáveis ​​pareados por idade aleatoriamente selecionados para ProtoArray® Life Technologies ‘. Depois de controlar a taxa de descoberta falsa, não reactividade significativa a qualquer proteína na ProtoArray foi visto, tanto para os controles saudáveis ​​ou os pacientes com câncer. Diante disso, pedimos se o câncer foi detectado em tudo em nosso microarray peptídico, e se tipos diferentes de câncer produzidos padrões distintos de ligação. Na verdade, o cancro e as doenças infecciosas, tanto produzir um padrão reprodutível; A Figura 1 mostra os 100 peptídeos mais significativos selecionados utilizando 1-way ANOVA com p 1,06 × 10

-13 em toda 28 pacientes com câncer de mama, 19 controles saudáveis, 10 pacientes com GBM, e 9 pacientes com disseminada

Coccidioides immitis

(febre do Vale). As classes de doença foram simultaneamente discernível com 0% licença de um fora de erro de validação cruzada usando tanto a análise discriminante linear e Máquina Support Vector ao classificar esses pacientes. Conclui-se que as amostras de câncer de cérebro GBM têm padrões immunosignature distinguível de outras doenças.

O heatmap aqui apresentada distingue 4 doenças diferentes, utilizando 70 peptídeos identificados como os mais significativos usando um 1-way ANOVA entre os pacientes com câncer de mama 27 , 19 controles saudáveis, 10

glioblastoma multiforme

pacientes e 9 pacientes febre do vale. a precisão da classificação foi de 100%, utilizando tanto a análise discriminante linear e Support Vector Machines e deixar um fora de validação cruzada.

Immunosignature foi reproduzíveis em conjuntos de amostras diferentes e ao longo do tempo

Em 2007, amostras de 13 pacientes com GBM e 45 voluntários saudáveis ​​de controle foram executados como uma prova de experimento diretor. Em 2010, 14 pacientes com GBM diferentes e 13 controles saudáveis ​​diferentes foram executados no microarray peptídico immunosignature. Nesse intervalo de 3 anos, muitas mudanças na impressão e superfície de deslizamento química foram aplicados, de modo a reprodutibilidade péptido-a-péptido melhorado a partir de um coeficiente de variação médio por matriz de 50% para 15%. Anteriormente usamos-house em lâminas revestidas aminossilano e uma Nanoprint 60 com Telechem SMP2 pinos entrar em contato com peptídeos de impressão em um design 1-up. Atualmente Microarrays Aplicadas (Tempe, AZ) piezo gravuras peptídeos em lâminas de aminossilano revestido de Schott (Jena, Alemanha) Nexterion A + utilizando deposição piezo para imprimir 10.000 peptídeos em um design 2-up [26]. No entanto, mesmo com estas mudanças substanciais e utilizando novas amostras, muitos dos peptídeos a partir de 2007 teve desempenho classificação semelhante

Encontramos 55 peptídeos com um teste t valor de p . 1 × 10

– 6 entre 45 controles e 13 pacientes GBM (Figura 2, à esquerda). Repetimos o experimento com pacientes 14 GBM e 13 de controlo de 3 anos mais tarde com as mesmas sequências de péptidos (Figura 2 direita) e encontrou as novas amostras tiveram 0% de erro de classificação usando tanto LDA e SVM. Um agrupamento K-means foi realizada nos péptidos com K = 3 e descobriram que os péptidos que formam o aglomerado ciano (alta de ligação no GBM, baixo em controlos) foram os mesmos para ambas as amostras, 2007 e 2010.

o heatmap à esquerda mostra 50 peptídeos que diferenciaram pacientes com glioblastoma de pessoas saudáveis ​​obtidos a partir de 4 diferentes localizações geográficas em todo os EUA (Fred Instituto Hutchison, University of Washington, University of California Irvine, Arizona State University). Estes peptídeos também foram usados ​​para classificar amostras diferentes que consistem do paciente saudável cego e soros obtidos a partir do Instituto Barrow Neurological 3 anos mais tarde. As barras coloridas na direita indicam clusters que definem grupos de peptídeos. Embora existam diferenças entre os valores obtidos em 2007 e 2010, a maioria dos péptidos de ligação de alta são muito semelhantes.

Immunosignaturing possível distinguir diferentes patologias Brain Tumor e subtipos moleculares

Finalmente , perguntamos se a patologia do tumor cerebral produziu um immunosignature distinguíveis. Analisou-se sangue de pacientes listados na Tabela 1.

A metilação do promotor de metiltransferase de O-6-metilguanina-ADN foi demonstrado ser um importante para stratifier GBM. Os pacientes com este subtipo molecular têm melhorado a sobrevivência, particularmente quando a terapia inclui temozolomida [38], [39], [40]. O pensamento atual é que a sobrevivência melhorada não é unicamente devido a este gene, mas que a metilação do promotor deste gene pode ser um marcador para um fenótipo metilação mais pleiotropic.

As amostras dos pacientes foram realizados em duplicado em nosso dois -se micoarrays. Uma réplica técnica foi executado no topo matriz de um slide e parte inferior de outro para garantir que nenhum top viés /inferior. As matrizes immunosignaturing forneceu um nível mínimo de detecção de 1,25 vezes na 95

percentil por 2 repetições técnicos em média. Arrays demonstrou um de Pearson coeficiente de correlação 0,97 em toda repetições técnicas de lâminas dentro do mesmo lote de impressão e 0,91 em toda lotes de impressão. Análise usou os não-fundo sinais mediana subtraídos tiradas diretamente do arquivo de GPR (relatório GenePix). subtração de fundo não é usado devido ao fundo mesmo e muito baixa. poder de classificação de peptídeo é calculada usando análise de potência padrão em R [41] (comando ‘power.t.test’). Para fins de treinamento de teste, nós dividir amostras 50:50 aleatoriamente, 1000 vezes e calculado a precisão resultante. Para a seleção de recurso que use um teste t ou ANOVA com correção de testes múltiplos apropriado. 100 péptidos cujos valores p variou de 10

-27 a 10

-18 foram usadas no mapa de calor visto na Figura 3.

Topo: seis diferentes classes de pacientes com tumores do cérebro foram testados quanto à sua immunosignature . Examinamos

Glioblastoma multiforme

(MGMT- é marrom, MGMT + é roxo), astrocitoma grau II (vermelho), oligodendroglioma (ciano) e misturado oligo /astro (azul) contra controles saudáveis ​​(amarelo). Utilizou-se um 1-way ANOVA para seleccionar a 100 peptídeos mais significativos, p 10

-18. sinais de baixa (azul) elevado (vermelho) e correspondem a anticorpos do doente detectado com um secundário marcado por fluorescência anti-humano. Os dados foram agrupados utilizando agrupamento hierárquico em ambos os péptidos (eixo Y) e pacientes (eixo X). canto inferior direito: principais componentes de visualização da separação entre as amostras. Os eixos x e y representam os dois primeiros componentes principais que constituem 64% da variância total nas amostras. As informações do paciente é encontrado na Tabela 1.

Como é evidente na Figura 3a, cada uma das classificações clínicas de câncer no cérebro produziu um padrão distinguíveis, incluindo amostras dos MGMT + e MGMT-. Um dos principais componentes plot (Figura 3b) mostra as diferenças relativas entre as amostras individuais e análise discriminante linear com leave-one-out validação cruzada (Tabela 1) fornece o desempenho de classificação e erro. Somente controles astrocitoma vs. produzido erros de classificação nas amostras testadas. Foi realizado o teste-treino com LDA e deixar um fora de validação cruzada através da divisão por igual as amostras e controlo do cancro em conjuntos de treinamento de teste. Fizemos isso 1000 vezes e obteve 0% de erro para todas as comparações de pares, exceto astrocitoma vs. controle onde obtivemos uma taxa de erro média de 4,7%. Nós relatou um erro de 7% na Tabela 1, que corresponde a uma única iteração de treinamento de teste selecionada aleatoriamente. Tivemos 0% de erro de classificação entre GBM MGMT + vs. controles e MGMT- vs. controles; tivemos também um erro de classificação de 0% entre os pacientes MGMT + e MGMT- GBM. Conclui-se que os immunosignatures das classificações clínicas são distintas.

Discussão

Em primeiro lugar, demonstrou que a immunosignature de GBM foi distinta da de câncer de mama e infecção febre do vale. Também mostrou que o assinatura MGB era relativamente estável, mesmo ao longo de várias iterações da plataforma de microarray. Finalmente, examinou um grande número de doentes com as patologias mais comuns de câncer de cérebro e descobriram diferenças immunosignature marcantes entre eles. Surpreendentemente, os pacientes ainda GBM com diferenças em O

6-metil-guanina-DNA metiltransferase status de metilação (MGMT) mostrou uma assinatura imune mensurável e comum, o suficiente para classificar o estado MGMT com 0% de erro de validação cruzada.

uma preocupação inicial para a utilidade de immunosignaturing se que a resposta inflamatória a qualquer doença que amortecer especificidade para uma doença. Como mostrado na nossa comparação entre GBM, câncer de mama e febre do Vale, assinaturas específicas de doença são evidentes. Uma preocupação técnica é a estabilidade da plataforma de microarray. Como mostrado na Figura 2, os péptidos GMB-distintivas foram evidente mesmo em matrizes impressas 3 anos de intervalo com o envelhecimento (e presumivelmente degradantes de péptidos solubilizados existências). No entanto, nós melhoramos a plataforma nos anos seguintes ao instituir técnicas de impressão sem contacto (Microarrays Aplicadas, Tempe, AZ), lotes de impressão maiores (136 slides por lote) e automação de processamento de amostras (HS 4800 Pro Hybridization Station, Tecan, Männedorf, Suíça).

mostram pela primeira vez que um estado patológico, a definição de origem ou desenvolvimento celular do tumor, pode ser reflectida no immunosignature (Figura 3A, 3B e Quadro 1). Para nossa surpresa, um único marcador molecular, o estado de metilação do promotor MGMT, tem um efeito profundo sobre o sistema imunitário que a immunosignature é distinta. Naturalmente, MGMT metilação do promotor pode ser bastante pleotropic e poderia marcar alterações adicionais na célula causando vários alvos a ser apresentado ao sistema imune. Nós não descarto a possibilidade de que as diferenças que vemos em assinaturas imunes são devidas a essas múltiplas proteínas sendo ativada por um único promotor. Dado que o estado MGMT é relevante para os resultados e temazolamide resposta, immunosignatures poderia levar a uma útil não-invasivo de diagnóstico para câncer no cérebro.

Em resumo, nós mostramos que immunosignaturing de câncer no cérebro reflete distinções patológicas. Mesmo que o cérebro é imunologicamente privilegiado, pode aparentemente cancros romper a barreira sangue-cérebro e estimular uma ampla resposta humoral. É importante notar que os péptidos utilizados nestas micromatrizes são completamente aleatória. Eles podem ser usados ​​para a análise de qualquer doença em qualquer espécie; eles são

não

específico para câncer no cérebro e foram

não

pré-selecionada de forma alguma. Se immunosignaturing teria uso diagnóstico ou prognóstico para o câncer de cérebro não é respondida por este estudo, mas a tecnologia é atraente em sua simplicidade e baixo custo e tem alta sensibilidade a mudanças em anticorpos circulantes. câncer no cérebro impôs enormes obstáculos que impedem a detecção, monitoramento e tratamento. Sentimos esta tecnologia proporciona um novo método para superar muitos desses obstáculos.

Materiais e Métodos

Amostras

O sangue foi coletado de pacientes submetidos a craniotomia para a ressecção de primário, tumores cerebrais terapêutica prévia sob IRB # 10BN171 no Barrow Neurological Institute, Phoenix, AZ. As amostras foram congeladas a -20 ° C a partir de 1 a 7 anos antes da utilização. O sangue foi centrifugado 100000 × g durante 30 min para sedimentar os detritos celulares e plasma hemolisado foi transferida para um novo tubo e congelados a -20 ° C. Voluntários saudáveis ​​de aproximadamente a mesma idade e composição macho-fêmea como o cancro do sangue doado coorte que foi congelado de um modo semelhante. Nós também obteve amostras de pacientes com diagnóstico de câncer de mama e febre do Vale. A Tabela 1 mostra o número eo tipo de amostras usadas nesta análise. MGMT análise de metilação do promotor do tecido tumoral GBM foi realizada por reação em cadeia da polimerase análise (PCR) do DNA modificado com bissulfito como descrito [42]

Protoarray Plataforma:. Presença de autoanticorpos

Foram selecionados 5

Glioblastoma multiforme

pacientes e 3 controles saudáveis ​​pareados por idade do nosso grupo de amostras de soro. Seguimos o protocolo Life Technologies ‘para a detecção de auto-anticorpos exatamente como está escrito. Utilizou-se Novagen Biologicals (San Diego, CA) biotinilado secundário na concentração sugerida e AlexaFluor Life Technologies ‘647-estreptavidina como a terciária detecção anti-humano. As lâminas foram digitalizados em scanner de um Agilent ‘C’, 100% da potência do laser, 80% PMT em 10um resolução. As lâminas foram alinhados com o arquivo appropriate.gal, e convertido para valores usando Molecular Devices ‘(Santa Clara, CA) GenePix Pro 6.0. Todos os controles fornecidos com as matrizes funcionou como esperado; os dados foram analisados ​​em (Palo Alto, CA) da Agilent GeneSpring 7.3.1 utilizando FWER = 5%. Não proteínas nas matrizes preencheram os critérios de descoberta de falsas para significância entre saudável vs. pacientes com câncer.

Immunosignature plataforma

A tecnologia immunosignaturing foi descrito em outros lugares [26], [27], [28 ], [29], [30], [35], [36], [37], [43]. Resumidamente, uma diluição de plasma 1:500 foi adicionado ao tampão de incubação que consiste em 5% de BSA, 0,1% de Tween 20 em PBS 1X pH 7,2. Esta mistura foi incubada nas micromatrizes immunosignaturing (obtidos a partir de www.peptidemicroarraycore.com) a 37 ° C durante 1 hora com agitação em um 4800 Pro Estação Tecan hibridação (Tecan, Salzburg, Áustria), secou-se, sob azoto, de grau molecular, e digitalizado no scanner de um Agilent ‘C’ na potência do laser de 70%, 20% PMT em 10um resolução, modo de cor única. imagens de microarranjos de 16 bits foram convertidos em valores usando GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Santa Clara, CA) para produzir um ficheiro de GPR. Os dados foram analisados ​​com GeneSpring 7.3.1 (Agilent, Santa Clara, CA). Coeficiente de Correlação de Pearson através destas amostras em média 0,92. As amostras com coeficientes de correlação de todo repetições técnicos. 0,85 foram re-executar

Análise Informatic

O pré-processamento dos dados microarray consistiu de normalização médio por slide e log

10 transformação. T-testes foram Welsh corrigida e ajustado para viés de teste de múltipla usando um FWER (Family-sábio Error Rate) de 5%; Do mesmo modo ANOVA. Os péptidos foram analisados ​​por testar a hipótese de que houve diferenças na intensidade em todo o cancro do cérebro ou de outros grupos de doenças e pacientes de controle, como resultado do estado da doença. Peptídeos que atenderam a esses critérios foram foram utilizados os ‘recursos’ para a classificação. Classificação utilizada análise discriminante linear (LDA) com leave-one-out validação cruzada. Support Vector Machines (SVM) com uma ordem de produto escalar polinomial de 1 0 factor de escala e diagonal foi usado com as características iniciais para assegurar que o desempenho de classificação não foi devido ao classificador. SVM produziu erros de classificação dentro de 3% de LDA. A (ROC) Receiver Operator Characteristic foi criado e a área sob a curva ROC (AUROC) foi calculado (Tabela 1).

Reconhecimentos

Agradecemos Adrienne Scheck e do Instituto Barrow Neurological de Hospital de São José para as amostras de soro.