Abstract
A epigenética estão pensados para desempenhar um papel importante na carcinogênese de vários cânceres colorretais esporádicos (CRC). Estudos anteriores sugeriram hipermetilação DNA concordantes entre pares tumorais. No entanto, apenas alguns marcadores de metilação foram analisados. Este estudo teve por objetivo descrever a assinatura epigenética de múltiplos CRC utilizando uma escala genoma de metilação do DNA profiling. Foram analisados 12 pacientes com CRC síncrona e 29 por idade, pelo sexo, e tumorais pacientes emparelhado-localização com tumores solitários da coorte EPICOLON II. perfis de metilação do DNA foi realizada utilizando o ensaio de metilação Illumina Infinium HM27 DNA. Os resultados mais significativos foram validados por Methylight. Tumores amostras foram também analisadas para o CpG Ilha Methylator Fenótipo (CIMP);
KRAS Comprar e
BRAF
mutações e status de deficiência de reparo incompatível. Funcional agrupamento anotação foi realizada. Foram identificados locais de CpG 102 que mostraram a hipermetilação do ADN significativo em múltiplos tumores no que diz respeito aos homólogos solitários (diferença de valor β ≥0.1). ensaios Methylight validado os resultados para 4 genes seleccionados (p = 0,0002). Oito dos 12 (66,6%) vários tumores foram classificados como CIMP-alto, em comparação com 5 dos 29 (17,2%) tumores solitários (p = 0,004). Curiosamente, a 76 de 102 (74,5%) hipermetilado locais CpG encontrados em vários tumores foram também observadas em tumores CIMP-altos. A análise funcional de genes hipermetilado encontrados em vários tumores apresentaram enriquecimento de genes envolvidas em diferentes funções tumorigénicas. Em conclusão, múltiplos CRC estão associados a um fenótipo de metilação distinto, com uma estreita associação entre a multiplicidade de tumores e CIMP-alta. Nossos resultados podem ser importantes para desvendar o mecanismo subjacente da multiplicidade de tumores
Citation:. Gonzalo V, Lozano JJ, Alonso-Espinhaço V, Moreira L, Muñoz J, Pellisé M, et al. (2014) Vários cânceres colorretais esporádicos Exibir uma única metilação fenótipo. PLoS ONE 9 (3): e91033. doi: 10.1371 /journal.pone.0091033
editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japão
Recebido: 11 de dezembro de 2013; Aceito: 06 de fevereiro de 2014; Publicação: 18 de março de 2014
Direitos de autor: © 2014 Gonzalo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Hospital Clínic de Barcelona (Josep concessão Font), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2.007-64.873 e SAF2010-19273), Fundação Científica de la Asociación Española contra el Câncer e Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). “Cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Unión Europea. Una manera de hacer Europa “. CIBEREHD é financiado pelo Instituto de Salud Carlos III. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
até 10% de todo o cancro colorectal (CRC) pacientes desenvolvem mais de um tumor no colorectum, de forma síncrona (diagnosticada ao mesmo tempo) ou metachronously (diagnosticada durante o follow-up) [1], [ ,,,0],2], [3]. a multiplicidade de tumores é pensado para ocorrer devido a um factor etiológico comum (genética ou ambiental) e proporcionar um bom modelo para examinar as alterações moleculares comuns e, mais especificamente, um potencial efeito de campo [4], [5], [6], [7 ]. Genetics explicam apenas uma parte do espectro de múltiplos CRCs, especialmente os que ocorrem no contexto de síndrome de Lynch (causadas por mutações nos genes mismatch repair) [8], [9], [10], polipose associada (FAP) [ ,,,0],11],
MUTYH
polipose associada (MAP) [11] e outras formas de polipose colorectal [12]. Por outro lado, tem sido proposto o conceito de defeito de campo para explicar a multiplicidade de tumores através de um distúrbio celular ou molecular generalizada em toda a mucosa colorrectal, causando um efeito de campo putativo (assim chamado de “campo de cancerização”) [6], [7] , tal como na síndrome de polipose serrilhada [13], [14], [15]. No entanto, o mecanismo patogénico subjacente definitivo da multiplicidade de tumores permanece indefinida.
No cenário não-hereditária, estudos anteriores encontraram padrões alteração molecular comuns entre os pares de CRC e na mucosa do cólon normal dos pacientes com tumores múltiplos colorretais, apoiar um defeito no campo putativa [4], [10], [14], [16]. Em contraste com as alterações genéticas, que não são geralmente encontrados na mucosa normal a partir de doentes com cancro, epigenética são pensados para desempenhar um papel importante na carcinogénese desses indivíduos que desenvolvem tumores múltiplos [4], [5], [14], [17 ], [18], [19], [20], [21]. Neste sentido, tem sido sugerido que CRCs síncronos são mais frequentemente associados com o fenótipo ilha methylator CpG (CIMP) [4],
BRAF
mutação e microsatélites instabilidade [10]. Na verdade, o nosso grupo comparou um conjunto de 41 CRCs múltiplas e solitárias de pares e hipermetilação identificado do
MGMT2
lócus e
RASSF1A
gene como variáveis independentemente associadas à multiplicidade de tumores. Além disso, vários estudos têm encontrado padrões de metilação concordantes em pares tumorais [4], [14], [17], [18]. Por outro lado, a hipometilação do ADN global tem sido associada a instabilidade genómica e carcinogénese [22], [23] e, mais recentemente, maior hipometilação de LINE-1 (um marcador substituto de metilação global do DNA) em mucosa de cólon normal, foi encontrada a ser uma característica distintiva dos pacientes com CRCs síncronas [14]. Todos estes resultados sugerem que o fundo do meio ambiente e /ou genética partilhada pode provocar padrões concordantes de metilação do DNA em pacientes com tumores múltiplos. No entanto, apenas alguns marcadores de metilação foram analisados e técnicas de alto rendimento com genoma capacidade grande são necessários para descobrir e entender melhor a assinatura epigenética subjacente de várias CRCs esporádicos.
Neste estudo teve como objetivo descrever a epigenética subjacente assinatura que diferencia múltipla de tumores CRC solitários usando uma abordagem de todo o genoma. Para este efeito, analisou-se 12 síncrona e 29 de controlo CRCs solitários derivados do EPICOLON-II coorte de base populacional, e avaliado o perfil de metilação escala genoma utilizando o ensaio de metilação Ilumina Infinium HM27 ADN, uma abordagem que não tenha sido previamente tentada.
Materiais e Métodos
pacientes e amostras
Doze pacientes com CRC síncrona e 29 por idade, pelo sexo, e tumorais pacientes emparelhado-localização com tumores solitários foram recrutados a partir da EPICOLON II coorte, um estudo de base populacional multicêntrico realizado na Espanha entre 2006 e 2007 [24]. tumores síncronos estavam claramente separados por mucosa de cólon normal e foram invasiva (pelo menos pT1). Os pacientes foram acompanhados até a morte ou março de 2012, o que viesse primeiro. características demográficas, clínicas e relacionadas com tumores de pacientes incluídos no estudo estão resumidos na tabela 1. Os critérios de exclusão para o presente estudo foram síndromes colorectal polipose, síndrome de Lynch e história pessoal de doença inflamatória intestinal. A Comissão de Ética Institucional de cada hospital participante (ver Agradecimentos) aprovou o estudo, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.
tumorais congelados tecidos colorretais foram obtidos na cirurgia de todos os pacientes, e imediatamente armazenados a -80 ° até à sua utilização. Em doentes com múltiplas lesões, amostra de tecido foi obtida a partir de um dos tumores (a mais avançada ou a uma maior quando vários tumores tinham a mesma fase do tumor).
extracção de ADN e de conversão
bissulfito
as amostras congeladas foram descongeladas e o ADN genómico foi isolado usando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. tratamento com bissulfito foi realizada sobre o ADN genómico utilizando o kit de ADN-ouro EZ metilação (Zymo Research, laranja, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.
matriz Infinium
realizada de metilação de ADN a partir de perfis 12 síncrona e 29 CRCs solitários utilizando o ensaio de metilação Infinium com HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, San Diego, CA), que é capaz de analisar simultaneamente o estado de metilação de 27,578 locais CpG individuais que cobrem 14.495 genes codificadores de proteínas e 110 miARNs [25], [ ,,,0],26], [27]. amplificação do genoma inteiro, rotulagem, hibridação e de varredura foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante em uma instalação do núcleo (Centre de Regulació GENOMICA, Barcelona, Catalunha, Espanha). estado de metilação foi medida como a razão de sinal a partir de uma sonda metilado em relação a ambos os sinais da sonda metilados e não metilados. rácios de metilação foram extraídos utilizando o Módulo de metilação no Illumina Bead Estúdio seguinte normalização média. β-valor quantitativo varia de 0 (0% metilação) de 1 (100% de metilação). O valor-p cortado para sondas detectados (diferentes a partir de medições de fundo) foi de 0,05. Foram excluídos sondas que foram publicados anteriormente para não ser confiáveis (aqueles que contêm polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e as sequências repetitivas que cobriam o dinucleótido CpG alvo) e os que foram concebidos para sequências em X ou o cromossomo Y. Juntos, mascarado pontos de dados para 7549 sondas [27]. conjunto de dados microarray completa está disponível no GEO. (Gene Expression Omnibus, número de acesso GSE52573)
Definição de tumores CIMP de altura com base no ensaio Infinium
Nós classificados como tumores CIMP-alta (CIMP- H), CIMP-baixa (CIMP-L) e CIMP-0 com base em um 2-step painéis de marcadores recentemente descritos por Hinoue
et al
com base no ensaio de metilação do DNA HM27 Illumina Infinium [27]. O primeiro painel (
B3GAT2
,
FOXL2
,
KCNK13
,
RAB31
, e
SLIT1
) qualifica-se uma amostra de como CIMP (alta e baixa) versus CIMP-0 se β-valor é ≥0.1 em três ou mais marcadores. O segundo painel de marcadores (
FAM78A
,
FSTL1
,
KCNC1
,
MYODCD
e
SLC6A4
) distingue CIMP-H em função CIMP-L tumores se β-valor é ≥0.1 em três ou mais marcadores (Tabela 2). Estes marcadores têm se mostrados para exibir sensibilidade de 100% e 100% de especificidade para identificar tumores CIMP-H [27].
validação técnica do ensaio Infinium utilizando a técnica Methylight
Methylight para quantitativa análise de metilação foi utilizado para a validação técnica dos resultados observados no ensaio Ilumina Infinium [28]. Os seguintes critérios rigorosos foram usadas para genes candidatos selecionados para a validação: 1) tumor solitário tinha um valor de β 0,2; e 2) vários tumores ou tinham um valor β 0,3 e a diferença no valor β ≥0.2; e 3) o valor ajustado p 0,05; e 4) evidências anteriores de recursos supressores de tumor com base na literatura publicada. Seguindo esses critérios, foram selecionados 4 genes para validação técnica (
MAP1B, HTRA1, ALOX15, TIMP3
). Locus primers e sondas de PCR específicos estão listados na Tabela S1 e foram projetados especificamente para sequências de DNA bisulfited-convertidos e localizados em cada região promotora do gene. Methylight foi realizada como descrito anteriormente, usando ALUC4 como controle interno [17], [28].
Avaliação de tumor de reparo incompatível deficiência
deficiência reparação Tumor incompatibilidade foi avaliada por ambos instabilidade de microssatélites ( MSI) e ensaios imuno incluindo a avaliação de MSH2, MLH1, e PMS2 MSH6 como previamente descrito [29]. estado MSI foi avaliada utilizando BAT26 e NR24 marcadores quasimonomorphic como previamente descrito [30]. Os tumores foram classificados como MSI, quando qualquer um dos dois marcadores era instável.
Avaliação da
BRAF
e
KRAS
estado de mutação
BRAF
mutações no códon 600 no exão 15, e
KRAS
mutações nos codões 12 e 13 no exão 2 foram analisados por Methylight e sequenciação directa, respectivamente, conforme publicado anteriormente [31].
agrupamento anotação funcional de genes diferencialmente metilados entre múltiplas e solitários cancros colo
Foi utilizado o banco de dados para anotação, visualização e integrado Discovery (DAVID) [32] para identificar caminhos relevantes para a carcinogénese com base nos genes que mostraram diferenciais significativamente metilação entre vários e múltiplos tumores solitários (diferença de valor β ≥0.1 e P 0,05). (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov)
a análise estatística
logística regressão ajustado para idade, sexo e localização do tumor foi utilizado para avaliar a diferença de valores de beta de metilação do DNA para cada sonda entre dois grupos independentes. As p-valores de metilação do DNA Illumina Infinium foram representados graficamente usando um mapa de calor, gerado pelos pacotes R /Bioconductor. características clinicopatológicas foram comparados por meio do qui-quadrado (variáveis qualitativas) e testes t (variáveis quantitativas). dados quantitativos Methylight (relação percentual metilação, PMR) foram analisados utilizando o teste de Mann-Whitney. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. análise estatística e visualização de dados foram realizados utilizando o pacote R /Bioconductor software e software SSPS (v.15).
Resultados
metilação diferencial entre tumores múltiplos e solitários
doze pacientes com múltiplos CRC e 29 por idade, pelo sexo, e tumorais pacientes emparelhado-localização com tumores solitários constituiu a base deste estudo. As características demográficas e de tumores de pacientes incluídos no estudo estão listados na Tabela 1. Foram utilizados ensaio de metilação Illumina Infinium HM27 DNA, que avalia o estado de metilação do DNA de 27,578 locais CpG localizados nas regiões promotoras dos mais de 14.000 genes codificadores de proteínas. Foram identificados locais de CpG 102 que mostraram a hipermetilação do ADN significativo em múltiplos tumores no que diz respeito a uns solitários (diferença no valor β ≥0.1 e p 0,05). Utilizando critérios mais rigorosos (diferença no valor β ≥0,2; p 0,05), foram identificados 36 locais CpG significativamente hipermetilado (ver lista detalhada de genes na Tabela S2). Um mapa de calor que mostra os locais de CpG mais significativamente hipermetilado que diferenciam tumores múltiplos e solitários é mostrada na Figura 1. Em geral, estes resultados mostram que múltiplas tumores estão associados a um fenótipo distinto metilação, independentemente da idade, sexo e localização do tumor.
a metilação do DNA β-valores são representados por meio de uma escala de cor de vermelho (metilação alta DNA) para verde (metilação baixo DNA). As linhas representam sondas e colunas representam amostras de tumor. As características clínicas e moleculares (grupo, sexo, localização do tumor, CIMP-H e
estado mutacional do KRAS
) estão representados acima do heatmap com barras horizontais.
validação técnica dos resultados de microarray
a fim de validar tecnicamente os resultados do ensaio Infinium usamos critérios rigorosos para seleccionar sondas que foram significativamente hypermethylated em múltiplos tumores em comparação com lesões solitárias (valor β em tumores solitários 0,2; β valor 0,3 em múltiplos tumores; diferença de valor entre β tumores solitários e múltiplos ≥0.2; e um valor de p ajustada 0,05). A fim de selecionar sites biologicamente relevantes CpG, priorizamos genes com evidências anteriores de recursos supressores de tumor. Seguindo esses critérios, foram selecionados
MAP1B
,
HTRA1,
ALOX15
, e
TIMP3 Compra de validação em cada cinco emparelhado tumores múltiplos e solitários. Os resultados são mostrados na Figura 2. Globalmente, verificou-se um nível de metilação significativamente mais elevados em vários tumores, em comparação com os tumores solitários (PMR global, 14% versus 2,7%, respectivamente; p = 0,0002). Como mostrado na Figura 2, todas as quatro marcadores apresentaram maiores níveis de metilação em vários tumores no que diz respeito aos solitários, reforçando assim a consistência dos nossos resultados.
Quatro genes (
MAP1B, HTRA1, ALOX15, TIMP3
) foram selecionados com base em critérios rigorosos (valor β em tumores solitários 0,2; β valor 0,3 em múltiplos tumores; diferença de valor β entre múltiplos contra ≥0.2 solitário; e um valor ajustado p 0,05). Box-plots exibir a relação percentual metilação (PMR) determinado por Methylight. As linhas dentro de caixas denotam mediana e caixas de marcar o intervalo entre os percentis 25 e 75. linhas pretas denotar o maior eo menor valor PMR. Os valores de P para a comparação entre múltiplos (vermelho) e tumores solitários (azul) (teste de Mann-Whitney) são mostrados.
CIMP de alta está associada com a multiplicidade de tumores
A seguir, analisado o estado CIMP de tumores solitários e múltiplos com base nos painéis gene marcador recentemente desenvolvidos definidos por Hinoue
et al [27]. Este painel tem mostrado recentemente para superar o painel de cinco marcador baseado em Methylight descrito por Weisenberger [33]. Dez dos 12 (83%) tumores múltiplos e 25 dos 29 (86,2%) solitária CRC mostrou hipermetilação de três ou mais marcadores a partir do primeiro painel (ou seja,
B3GAT2
,
FOXL2
,
KCNK13
,
RAB31
, e
SLIT1
), então eles foram classificados como tumores CIMP. Com base no segundo painel (ou seja,
FAM78A
,
FSTL1
,
KCNC1
,
MYOCD
, e
SLC6A4
), 8 fora dos 12 (66,6%) vários tumores foram classificados como finalmente CIMP-H, em comparação com 5 dos tumores 29 (17,2%) solitários (p = 0,004) (Tabela 2). tumores CIMP-H exibida hipermetilação significativa (diferença no valor β ≥0.1; valor de p 0,05) em 301 locais CpG (109, com uma diferença em valor β ≥0.2; Valor de p 0,05). Um mapa de calor que mostra os locais de CpG mais importantes que diferenciam CIMP-H e CIMP-G /0 tumores é mostrado na Figura 3. Uma lista detalhada com CIMP-H hipermetilado locais CpG é mostrado na Tabela S3. Curiosamente, 76 dos 102 locais CpG hipermetilado em múltiplos tumores foram também observadas para ser hipermetilado em tumores CIMP-H (Figura 4). Não houve
BRAF
mutações em qualquer tumor. Nossos resultados mostram uma estreita associação entre a multiplicidade de tumores e CIMP, independentemente da idade, sexo e localização do tumor. Esta observação está de acordo com um estudo maior anterior, em que os tumores foram classificados utilizando marcadores baseados em Methylight [4], o que reforça a teoria do campo de defeitos.
A metilação do DNA β-valores são representados por usar uma cor escala de vermelho (metilação alta DNA) para verde (metilação baixo DNA). As linhas representam sondas e colunas representam amostras de tumor. As características clínicas e moleculares (grupo, sexo, localização do tumor, CIMP-H e
estado mutacional do KRAS
) estão representados acima do heatmap com barras horizontais.
círculo azul mostra 102 hypermethylated CpG sites encontrados em vários contra tumores solitários e círculo amarelo mostra os 301 sites de hypermethylated CpG em CIMP-H contra CIMP-L /0 tumores. Notavelmente, 76 dos 102 genes hypermethylated em múltiplos tumores também foram vistos a ser hipermetilado em tumores CIMP-H, e são representados como um cruzamento.
associação entre
KRAS
mutações e hipermetilação
KRAS
mutações têm sido associadas a um fenótipo metilação chamado CIMP de baixa, em que a hipermetilação de um reduzido número de loci CIMP definidoras ocorrer [27]. Buscou-se investigar o perfil de metilação associada a
KRAS
tumores mutantes e sua associação com a multiplicidade de tumores. Descobrimos que
KRAS
tumores mutantes foram representados em ambos os tumores solitários e múltiplos (33,3% versus 43,4%, respectivamente; p = 0,7) (Figura 1). Curiosamente, descobrimos que
KRAS
tumores mutantes mostrou um perfil de metilação distinto em relação ao
KRAS
tumores do tipo selvagem. Foram identificados 189 CpG locais que mostraram hipermetilação DNA significativa no
KRAS
CRCs mutantes com relação ao
KRAS
do tipo selvagem tumores (diferença de valor β ≥0.1 e p 0,05). Usando critérios mais rigorosos (diferença de valor β ≥0,2; p 0,05), foram identificados 92 locais de CpG significativamente hypermethylated. Uma lista detalhada com
KRAS
-associated locais CpG hypermethylated é mostrada na Tabela S4 e Figura S1. A percentagem de CIMP-H não diferiu entre os
KRAS
tumores do tipo selvagem e mutante (23% versus 35%, respectivamente; p = 0,7). Da mesma forma, o percentual de CIMP de baixa não diferiu entre os
KRAS
tumores do tipo selvagem e mutante (69,2% contra 55%, respectivamente; p = 0,485). No geral, embora, descobrimos que
KRAS
tumores mutantes exibir perfis de metilação distintas, houve associação com nenhuma multiplicidade de tumores nem estatuto CIMP.
Análise funcional de metilação diferencial observado em câncer colorretal múltipla
Foi realizada uma análise de enriquecimento de 102 sondas hypermethylated observadas em vários tumores (valor β 0,1; p 0,05) utilizando o banco de dados para anotação, visualização e ferramenta integrada de descoberta a fim de encontrar uma correlação funcional em qualquer via cancerígeno envolvidos na carcinogênese. Esta análise funcional mostrou a presença e enriquecimento de genes envolvidas em diferentes funções tumorigénicas: movimento de células (12 genes), a migração celular (7 genes), as vias de cancro (8 genes), motilidade celular (7 genes), regulação da proliferação celular ( 11 genes), a actividade do factor de transcrição (14 genes), e regulação da transcrição (17 genes) (Tabela 3). Lista completa de agrupamento anotação funcional de genes diferencialmente metilados é mostrada na Tabela S5.
Discussão
Neste estudo foram examinados pela primeira vez, o perfil de metilação do DNA escala genoma do tumor tecidos de pacientes com múltiplas e solitária CRC recrutados a partir de uma coorte de base populacional. Descobrimos que a multiplicidade de tumores está associado com um perfil distinto de metilação, independentemente da idade, sexo ou localização do tumor. Em comparação com tumores solitários, vários CRCs mostrou hipermetilação significativa em locais específicos CPG e, curiosamente, houve uma forte associação com o CIMP-H descrito para CRC. A análise funcional de locais CpG metilados diferencialmente em vários tumores apresentaram enriquecimento de genes envolvidas em diferentes funções tumorigénicas. Os resultados do perfil de metilação foram validados com êxito por PCR quantitativas. No geral, nossos dados fornecem uma nova visão sobre o efeito de campo de cancerização e carcinogênese colorretal em casos não-hereditários. Este estudo revela que a hipermetilação somática desempenha um papel importante na multiplicidade de tumores e pode constituir um biomarcador interessante para avaliação de risco CRC.
Estudos recentes têm relatado uma associação estreita entre a metilação do DNA aberrante e multiplicidade de tumores [4], [14 ], [16], [17], [18]. Nosho e colaboradores [4] analisaram 47 pacientes com CRC síncrona e 2021 tumores solitários para vários marcadores de metilação, incluindo ilha CpG específicas do CIMP 8 (ou seja,
CACNA1G
,
CDKN2A
,
CRABP1
,
IGF2
,
MLH1
,
NEUROG1
,
RUNX3
, e
SOCS1
) e encontrou uma associação significativa entre a multiplicidade de tumores e a presença de CIMP-elevada (35% em tumores síncronos versus 8% em tumores solitários; p = 0,036). Mais importante, os autores encontraram metilação concordantes dentro de pares de tumor. Da mesma forma, Konishi e colegas [18] analisou o estado de metilação de um número limitado de fabricantes em 57 tumores múltiplos e 69 CRCs solitários, e constatou que o estado de metilação de
p14
e
MGMT
foi significativamente mais elevada em tumores múltiplos, mostrando metilação concordantes para alguns marcadores dentro dos tumores pares do mesmo local do cólon. Em linha com estas observações, mostramos anteriormente que a hipermetilação do
MGMT
e
RASSF1A
é independentemente associada com a multiplicidade de tumores [17]. Em outro estudo, Kamiyama e colegas [14] analisaram o estado de metilação do elemento comprido-1 nucleótido intercaladas (LINHA-1) em tecido de cancro do cólon combinados e mucosa não-cancerosas de pacientes com CRCs únicas e múltiplas do lado direito. Os autores encontraram maior hipometilação do LINE-1 em ambos tumor e normal mucosa de pacientes com múltiplos tumores em comparação com pacientes com tumores solitários, e mais importante, LINE-1 hipometilação foi um preditor independente para tumores metacrônicos (p = 0,003). Os autores sugeriram que a hipometilação LINHA-1 na mucosa normal podia ser utilizada como um biomarcador preditivo epigenética por múltiplo risco CRC. É importante notar que a linha 1-hipometilação foi anteriormente encontrado para estar inversamente correlacionada com o fenótipo CIMP, que pode estar em contradição com os nossos estudos anteriores e. No entanto, a correlação entre LINE-1 hipometilação e CIMP em vários tumores não foi explorada em profundidade, e as diferenças de selecção ea metodologia paciente poderia explicar estes resultados inesperados. Finalmente, outros estudos levantaram a hipótese de que a paisagem genética e epigenética de um determinado tumor é determinado pela localização no cólon, e que os perfis moleculares semelhantes para tumores síncronas é influenciada pela proximidade [34], [35]. Infelizmente, não conseguimos subanalyze esta questão devido à indisponibilidade da segunda neoplasia. Todos estes resultados sugerem que a acumulação de metilação de ADN aberrante ocorre predominantemente em indivíduos com uma propensão para desenvolver tumores múltiplos. Os resultados do presente estudo não apenas argumentar em favor dessa hipótese, mas também fornecem novas evidências sobre a paisagem epigenética de pacientes com tumores múltiplos. O mecanismo subjacente da associação entre a metilação aberrante e multiplicidade ainda é desconhecida. Alguns autores sugeriram uma predisposição hereditária em alguns casos [14], com a acumulação de erros durante o envelhecimento de metilação num subgrupo geneticamente predispostos de indivíduos. No entanto, esta hipótese ainda são necessários estudos não comprovados e futuras.
Neste estudo foram validados com sucesso por Methylight o estado de metilação de 4 locais CpG diferencialmente metilados observadas na fase de descoberta do estudo. Especificamente, observou-se que
MAPB1B
,
HTRA1
,
ALOX15
, e
TIMP3
foram significativamente hipermetilado em vários tumores.
MAP1B
(associada a microtúbulos Proteína 1B) foi anteriormente mostrado para ser hipermetilado em tumores CIMP-alta, sem MSI, o que corresponde principalmente ao grupo de tumores analisados no nosso estudo [36].
HTRA1
é um membro da htrA (High Temperature Requirement Factor A) da família de proteases de serina e desempenha um papel protetor em várias doenças malignas devido às suas propriedades supressoras de tumor [37], [38], [39] .
HTRA1
mostrou ser silenciado através de hipermetilação do promotor [38], e proposto como um romance potencial biomarcador para o diagnóstico e prognóstico em vários tipos de câncer.
ALOX15
(15-lipoxigenase ou 15-LOX) é uma enzima induzível e altamente regulada em células humanas normais que desempenha um papel chave na produção de mediadores lipídicos de sinalização.
ALOX15
mostrou recentemente ser regulada para baixo em CRC e actuar como um supressor de tumores através da promoção de vários eventos anti-tumorigénica, incluindo a diferenciação celular e apoptose, e inibe a inflamação crónica, angiogénese e metástase [40]. Finalmente, Tecido Inibidor de Metaloproteinases-3 (
TIMP-3
) foi encontrado para ser silenciado em vários tipos de cancro por hipermetilação do promotor de genes, incluindo CRC [41], [42]. Em geral, os nossos resultados mostram que vários tumores estão associados a hipermetilação de genes supressores de tumores bem estabelecidos.
Independentemente do mecanismo subjacente por detrás da forte associação entre a metilação aberrante e a multiplicidade de tumores, os nossos resultados sugerem que o estado de metilação de marcadores específicos podem ser usadas para estratificar o risco de a multiplicidade de tumores. Kamiyama e colegas mostraram recentemente que LINE-1 estado de metilação na mucosa do cólon normal poderia prever o desenvolvimento de CRC metacrônica com alta sensibilidade [14], representando, assim, um biomarcador de prognóstico clinicamente importante para a identificação de pacientes de “alto risco”. Da mesma forma, a análise do estado de metilação de marcadores específicos identificados no nosso estudo poderia ser utilizado num cenário clínico para identificar doentes de alto risco e adaptar a estratégia de vigilância. Estudos prospectivos analisando especificamente esta hipótese, no entanto, são garantidos.
A força principal deste estudo é que utilizou uma coorte de base populacional de casos CRC bem descritos, minimizando assim o viés de seleção. Além disso, foi utilizado pela primeira vez, todo o genoma de perfis de metilação com ensaio Illumina Infinium neste cenário. No entanto, estamos cientes de algumas limitações. Em primeiro lugar, nós não analisar correlação metilação do DNA em pares tumorais devido à concepção do projecto EPICOLON II, em que apenas um tumor foi recolhida. Em segundo lugar, a definição CIMP não foi baseado em marcadores de metilação previamente descritos [33]. No entanto, actualmente não existe qualquer definição de consenso de tumores CIMP e Hinoue e colegas [27] recentemente mostrou que um novo painel com base na plataforma de metilação Illumina Infinium DNA superou o painel de cinco marcador baseado em Methylight (ou seja,
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3
e
SOCS1
). A frequência de CIMP de alta frequência em CRCs solitários observados em nosso estudo (17%) está de acordo com dados anteriores, o que reforça a precisão do novo painel proposto por Hinoue
et al.
Em terceiro lugar, em nosso estudo , não havia
BRAF
tumores mutantes, e, consequentemente, a associação da multiplicidade tumoral com um fenótipo metilação distinto se refere apenas a CIMP de alta /
BRAF
tumores do tipo selvagem, que podem representar até a 40% dos tumores CIMP-altos. Finalmente, como nossos resultados devem ser formalmente considerado estatisticamente não significativa ao aplicar múltiplas correções de testes, estudos adicionais em outras coortes são necessários para confirmar os resultados. No entanto, fomos capazes de confirmar alguns dos mais importantes locais de CpG hypermethylated por Methylight, reforçando, assim, a validade dos resultados.
Em resumo, os nossos resultados são consistentes com a hipótese de que a multiplicidade de tumores está associado a uma distinta padrão de metilação aberrante. Em comparação com tumores solitários, vários CRCs exibir mais frequentemente CIMP-H e hipermetilação em outro locus específico. Nossos resultados podem ser importantes para desvendar o mecanismo subjacente da multiplicidade de tumores no cenário de não-hereditária, e fornecer novos biomarcadores potenciais para a identificação de pacientes de alto risco e adequar estratégias de vigilância.
Informações de Apoio
Figura S1.
Heatmap mostrando os 172 locais CpG mais significativamente hypermethylated que diferenciam mutante KRAS (n = 13) contra tumores KRAS do tipo selvagem (n = 28) com base nos dados metilação do DNA Infinium.