Abstract
GADD45A (
parada do crescimento e DNA danos 45 A) é o primeiro stress gene induzível identificado como sendo um alvo de
p53
. No entanto, nenhum estudo até à data têm avaliado variantes do
gene GADD45
e sua relação potencial de susceptibilidade tumor. Nós investigamos a associação do
GADD45A
(1506T C) polimorfismo com o desenvolvimento de cancro do ovário em 258 pacientes com câncer de ovário e 332 mulheres saudáveis da mesma idade como controles usando análise de sequência. Encontramos uma diferença estatisticamente significativa no
GADD45A
(1506T C) distribuições genotípicas entre os grupos caso e controle (TT vs. TC vs. CC, P = 0,0021) e descobriu que variante 1506T C foi significativamente associada com um risco aumentado de cancro do ovário (P 0,001, OU = 1,71, IC 95% [1,28-2,29]). Observou-se um efeito estatisticamente significativo entre a histologia do tumor (P = 0,032) e do estado CA125 (P = 0,021). Portadores do alelo C (TC + CC) foi associado com um risco aumentado de CA125 positivo (OR = 3,20, IC 95% [1,15-8,71). Portador do alelo T (TT + TC) mostrou uma correlação significativa com tanto maior
GADD45A
expressão de mRNA e mais RFS do cancro do ovário (sobrevida livre de recidiva) e OS (sobrevida global). Nós somos o primeiro grupo a demonstrar que o
GADD45A
(1506T C) polimorfismo está associado a suscetibilidade ao câncer de ovário e prognóstico. Estes dados sugerem que
GADD45A
(1506T C) é um novo gene de susceptibilidade do tumor e pode ser um marcador molecular útil para avaliar o risco de câncer de ovário e para a previsão do prognóstico do câncer de ovário paciente
Citation:. yuan C, Liu X, Liu X, Yang N, Liu Z, Yan S, et al. (2015) O
GADD45A
(1506T C) O polimorfismo é associado com cancro do ovário Susceptibilidade e prognóstico. PLoS ONE 10 (9): e0138692. doi: 10.1371 /journal.pone.0138692
editor: Da-Tian Bau, China Medical University, TAIWAN
Recebido: 12 Janeiro, 2015; Aceito: 02 de setembro de 2015; Publicação: 30 de setembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Yuan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de alta Tecnologia de Pesquisa e Desenvolvimento ( “863” Programa) da China (2014AA020605, 2012AA02A507), National Natural Science Foundation da China (81.272.857), China Pós-Doutorado Science Foundation (2014M551918), Ciência e Projeto de Desenvolvimento de Tecnologia da Província de Shandong (2014GSF118071, 2013GNC11306, 2013GSF12202), a Fundação de Ciência Natural da província de Shandong (ZR2014JL019) e Fundação de Shandong Departamento de Saúde Pública (2014WS0123). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
introdução
o câncer de ovário é o câncer mais mortal do sistema reprodutor feminino, com mais de 21.980 novos casos e mais de 14.270 mortes nos Estados Unidos em 2014 [1]. Semelhante a outros tumores malignos, cancro do ovário ocorre como um resultado das interacções entre o ambiente e factores genéticos
Uma acumulação de variantes genéticas em diversos genes podem estar envolvidos no processo da carcinogénese do ovário [2].; por exemplo,
BRCA1
,
BRCA2
,
RAD51C
,
RAD51D
,
MLH1
,
MSH2
,
RB1
,
CASP8
,
LIN28B
,
SMAD6
,
ERCC4 Comprar e PRG têm sido implicados neste processo [3 -12]. Recentemente, estudos de associação do genoma (GWAS) ter encontrado vários alelos comuns de susceptibilidade em quatro loci com fortes associações [13-15]. Braem et ai. avaliação 147 genes candidatos e 3 GWAS publicado de 1990 a outubro de 2010, incluindo cerca de 1.100 variantes genéticas em mais de 200 genes candidatos e 20 regiões intergênicas [8]. No entanto, apenas algumas variantes genéticas exibiu uma forte evidência de uma associação com o câncer de ovário, bem como a identificação de genes associados a uma predisposição para o cancro do ovário requer uma investigação mais aprofundada [8].
A detenção crescimento e dano ao DNA 45 (
GADD45) família é composta por três membros,
GADD45A
, –
B
, e-
G
. A humana
gene GADD45A
está localizado no cromossoma 1 (1p31.2-31.1), contém 4 exões e intrões 3, codifica para uma proteína ácida ácido amino 165 (18,4 kDa), e é altamente conservada em todas as espécies [ ,,,0],16]. Como um alvo confirmado de p53 [17, 18],
GADD45A
pode ser regulada por ambos (radiação não-ionizante) Vias (radiação ionizante) e p53-independente dependente de p53 [19] e desempenha um papel importante na G2 /M e o ponto de verificação na estabilidade do genoma [18]. Vários fatores de transcrição, tais como
BRCA1
,
WT1
,
Oct-1 |,
NF-YA
,
ATF4
,
AP-1 |,
c-myc
,
ZBRK1
, e
junho D
, pode regular a expressão
GADD45A
por ligação para a região intrônica ou promotor ao nível da transcrição [16, 18, 20, 21].
estudos anteriores demonstraram que a regulação negativa da
GADD45A
e
GADD45G
permite tumor células de escapar da morte celular programada em vários tipos de tumores [22].
GADD45
expressão é frequentemente diminuída em câncer de pulmão de não pequenas células [23], carcinoma hepatocelular [22], e glioblastoma [24]. A regulação negativa da
GADD45
expressão confere mau prognóstico do tumor e está correlacionada com o estado de diferenciação. metilação anormal do
GADD45A
região promotora do gene foi encontrado em várias linhas celulares de cancro da mama e amostras de cancro da mama, mas não em gânglios linfáticos ou epitélio mamário normal [25].
GADD45A
superexpressão está associada a um prognóstico favorável, o que sugere que a metilação anormal de
GADD45
pode contribuir para o risco de câncer de mama [25]. No entanto, nenhuma
GADD45A
polimorfismo associado a susceptibilidade do tumor foi avaliado. Uma variante
GADD45A
(1506T C) localizado em regiões intrônicas foi encontrado em nosso estudo. Assim, a hipótese de que esta variante pode afectar fator de transcrição sítios de ligação, alterando assim
GADD45A
expressão e afetando gênese do tumor. Assim, investigamos o
GADD45A
(1506T C). Polimorfismo,
expressão GADD45A
, eo risco de câncer de ovário e prognóstico
Materiais e Métodos
pacientes e amostras
Este estudo incluiu 258 pacientes com diagnóstico de câncer de ovário (média de idade de 52,1 ± 13,9 anos, de 21 a 81 anos de idade) em Qilu Hospital (Shandong, China) entre setembro de 2008 e setembro de 2012. Clinical características, incluindo a idade no momento do diagnóstico, grau de diferenciação, estágio FIGO, tipo histológico, metástase linfonodal, estado CA125 e tamanho do tumor, foram obtidas a partir dos prontuários dos pacientes. Além disso, 332 mulheres saudáveis da mesma idade (idade de 50,2 ± 13,4 anos, de 21 a 82 anos de idade média) foram recrutados como controles de entre os pacientes submetidos a um exame físico no nosso hospital. Calculou-se a sobrevivência
GADD45A
genótipo com relação à recaída-free (RFS) e sobrevida global (OS) em 151 pacientes ovarianos com base em nossa capacidade de entrar em contato com os pacientes.
A maioria dos sujeitos eram de origem chinesa Han e residia na província de Shandong, na China. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito para participar neste estudo. O Comitê de Ética da Universidade de Shandong aprovou esta pesquisa (número IRB: Kyll-2013-019). Todos os participantes (pacientes e controles) doou 2 ml de sangue periférico, o qual foi armazenado a -80 ° C no nosso laboratório.
O DNA foi extraído usando um kit de ADN genómico TIANamp (Tiangen, Pequim, China) de acordo com a o protocolo do fabricante. A concentração e a pureza do ADN foram medidos utilizando um espectrofotómetro de ultravioletas (GE Healthcare, EUA). As amostras de DNA foram rotineiramente armazenadas a -80 ° C
A genotipagem Análise de GADD45A (1506T C).
A genotipagem do
GADD45A
(1506T C) polimorfismo foi realizada utilizando PCR e sequenciamento. A sequência do gene da
GADD45A
foi obtido a partir de NCBI (Gene ID: 1647, sequência do GenBank, AY135686.1, GI: 22122007). Os iniciadores foram concebidos usando Primer Premier 5 de acordo com a seqüência de
GADD45A
como segue: iniciador directo 5’AGTTTGCACAGGGCAACTCC-3 ‘e iniciador 5′- CCTGCTAAAGGAATTAGTCACG-3 reverter’. O tamanho do produto de PCR era 1255 pb. A amplificação por PCR foi realizada num volume final de 50 uL, contendo 1 uL de ADN genómico (100 ng /uL), 4 ul de dNTPs 2,5 mM, 5 mL de tampão, 2 ul de cada iniciador e 1 L de alta fidelidade de Taq polimerase (TransStart FastPfu Fly DNA polimerase, transgénica, Beijing, China). As condições de amplificação por RCP foram as seguintes: 94 ° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 61 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 2 min e um passo final de extensão de 72 ° C durante 10 min. Toda a sequenciação foi realizada por BioSune Biotecnologia Co., Ltd. (Xangai, China), e os dados de sequência foram analisados utilizando Cromas 2,31 e 7,0 MegAlign software.
Isolamento de ARN, transcrição reversa PCR, e quantitativa em tempo real PCR (qRT-PCR)
o ARN total foi extraído a partir de tecidos de cancro, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) com base no protocolo sugerido. A transcrição reversa PCR foi realizada utilizando um kit de RT-PCR PrimeScript (Takara, Dalian, China). QRT-PCR foi realizada utilizando o sistema de PCR Applied Biosystems 7900HT em tempo real. A sequência de mRNA do
gene GADD45A
foi obtido a partir de NCBI (NM_001924.3 GI: 315075321). Os seguintes iniciadores foram utilizados para amplificar o gene da
GADD45A
: 5′-GAAAGGGATGGATAAGGTGGG-3 ‘e iniciador 5′-CCTGGATCAGGGTGAAGTGGA-3 inverter’. GAPDH (iniciador directo 5′-GGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAAG-3 ‘e o iniciador inverso 5′-CCATGGGTGGAATCATATTGG-3’) foi utilizada como controlo interno. Os experimentos foram repetidos três vezes para confirmar as descobertas.
Análise Estatística
As análises estatísticas foram realizadas como descrito anteriormente [26]. Hardy-Weinberg foi testado para todos os SNPs utilizando uma ferramenta estatística baseada na Web pública (https://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml), e o limite para o desequilíbrio foi P 0,05. As distribuições alélicas e genotípicas no grupo de câncer de ovário e do grupo controle foram comparados utilizando testes de qui-quadrado e teste exato de Fisher foi utilizado quando a contagem de uma célula era 5. O risco de desenvolvimento de câncer de ovário foi estimada em um odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95% (CI) usando análise de regressão logística não condicional. As taxas de sobrevivência de pacientes foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier. A análise multivariada de fatores prognósticos foi realizada por meio de análise de regressão de Cox. Todos os valores de p foram calculados como dois lados, eo limiar de significância foi de P 0,05. Os dados foram analisados usando SPSS (Statistical Package for Social Sciences) 17.0 (SPSS, Chicago, Illinois, EUA)
Resultados
Relação entre o GADD45A (1506T C). Polimorfismo e ovário risco de câncer
SNP
GADD45A
(1506T C) é um romance, a variante não identificado anteriormente. Sequenciamento cromatogramas de casos selecionados aleatoriamente foram usados para ilustrar as variantes do
GADD45A
(Fig 1).
A-C, os resultados do complemento sequenciamento chromatogram reversa dos genótipos TT, TC e CC, respectivamente. As amostras foram escolhidos aleatoriamente
Os participantes dos grupos e controlo do cancro do ovário eram todos da China Continental.; não houve diferenças clínicas significativas (isto é, idade média, índice de massa corporal [IMC], história menstrual ou outros parâmetros relacionados) entre os 2 grupos. Hardy-Weinberg foi testado. Os valores de qui-quadrado do grupo grupo caso e controle foram de 0,51 e 0,47, respectivamente. Como mostrado na Tabela 1, o
GADD45A
(1506T C) genótipos e distribuições de alelos apresentaram uma diferença estatisticamente significativa entre os grupos caso e controle. associações fortes com o risco de câncer de ovário foi encontrado com SNP 1506T C no modelo log-genética aditiva (TT vs. TC vs. CC, P = 0,0021), dominante modelo genético (TT + TC vs. CC, P = 0,0017, OR = 1,95, IC 95% [1,28-2,95]), e modelo genética recessiva (TT vs. TC + CC, P = 0,0093, OR = 2,05, IC 95% [1,19-3,53]). Observou-se uma maior prevalência de alelos C (P 0,001, OR = 1,71, IC 95% [1,28-2,29]) em pacientes com câncer de ovário em comparação com os controles
Em resumo, a variante 1506T C é correlacionado com um aumento no risco de cancro do ovário
Relação entre a GADD45A (1506T C). Polimorfismo e Variáveis clínicopatológicos
Como se mostra no Quadro 2, há uma associação do TT e TC + CC genótipos com as características clínico-patológicas, incluindo a idade no momento do diagnóstico, grau de diferenciação do tumor, estágio clínico, metástase linfonodal, expressão CA125, tamanho do tumor e histologia do tumor. Observou-se um efeito estatisticamente significativa entre a histologia do tumor (P = 0,032) e do estado CA125 (P = 0,021). Portadores do alelo C (TC + CC) foi associado com um risco aumentado de CA125 positivo (OR = 3,20, IC 95% [1,15-8,71)
Relação entre o GADD45A. (1506T C) polimorfismo e GADD45A expressão níveis
Nós testamos ainda mais a relação potencial entre o
GADD45A
(1506T C) polimorfismo e
GADD45A
níveis de expressão de mRNA in vivo. Como mostrado na Fig 2A, os níveis de
GADD45A
ARNm em tecidos de cancro do ovário 22 foram significativamente mais baixos do que os níveis observados em 15 tecidos normais (P 0,001). Como mostrado na Fig 2B, o
GADD45A
expressão de ARNm foi maior em pacientes com TT ou genótipos TC em comparação com os pacientes com o genótipo CC (P 0,001). Como mostrado na Fig 2C, o
GADD45A
expressão de ARNm foi maior em controlos com TT ou TC genótipos do que com o genótipo CC, (P 0,001). Estes achados sugerem que o SNP 1506T . C pode afetar significativamente a expressão do gene da
GADD45A
A, os níveis relativos de expressão de mRNA GADD45A em tecidos de cancro do ovário em comparação com tecidos ovarianos normais. B, os níveis relativos de expressão de mRNA GADD45A nos tecidos de cancro do ovário de pacientes com diferentes 1506T genótipos C. C, os níveis relativos de expressão de mRNA GADD45A nos tecidos normais de controle de indivíduos com diferentes 1506T genótipos C. Um ponto representa a média de três medições independentes obtidos a partir de um sujeito. Distribuições dos três genótipos foram aleatoriamente entre os grupos. N representa o número de amostras em cada grupo respectivo. As barras representam o desvio padrão. Estudante de
t
-test foi utilizado para avaliar as diferenças nos níveis de diferentes construções de expressão
Relação entre GADD45A (1506T C). Polimorfismo e Ovarian Cancer Prognosis
para testar o poder prognóstico da
GADD45A
polimorfismo em câncer de ovário, foi calculado o
GADD45A
genótipo no que diz respeito à sobrevivência de ovário livre de recidiva (RFS) e sobrevida global (oS). Como mostrado na Figura 3, o genótipo TT + TC mostrou correlação significativa com tanto mais RFS câncer de ovário e OS em 151 pacientes (p = 0,018, P = 0,0093, respectivamente).
A, genótipo TT + TC de
GADD45A
teve maior sobrevida livre de recidiva (P = 0,018). B, genótipo TT + TC de
GADD45A
tiveram maior sobrevida
Discussão
Um grande número de variantes genéticas nos genes candidatos (P = 0,0093). envolvida no processo da carcinogénese do ovário foram relatados [8]. Três GWAS com sobreposição de conjuntos de participantes do estudo para o câncer de ovário foram realizados [13-15]. Um total de 18 SNPs em 5 regiões foram encontrados para ser associado com o cancro do ovário, em 3 estudos GWAS. No entanto, não houve sobreposição entre as variantes genéticas identificadas através dos estudos GWAS e as variantes identificadas utilizando uma busca do gene candidato [8]. Acreditamos que a evidência de uma associação com o câncer de ovário é insuficiente e que é necessário investigar mais genes candidatos associados com cancro do ovário.
GADD45
expressão é frequentemente diminuída em alguns tipos de câncer [22 -24]. Anormal
GADD45
expressão tem sido associada com o prognóstico do tumor [25], e anormal
GADD45
metilação podem contribuir para o risco de câncer [25]. Um estudo mostrou que a 1,25-di-hidroxivitamina D3 provoca a paragem do ciclo celular na transição G2 /M por meio de indução independente de p53 de GADD45 em células de cancro do ovário [27]. A indução da expressão de GADD45A pode desempenhar um papel na mediação da resposta apoptótica de células de cancro do ovário a retinóide sintético CD437 [28]. A associação de
GADD45A
polimorfismos com a susceptibilidade do tumor eo prognóstico nunca foi relatado
Neste estudo, o
GADD45A
(1506T C). Polimorfismo foi encontrado para ser associado com o risco de câncer de ovário, características clínico-patológicas,
GADD45A
níveis de expressão e prognóstico do câncer de ovário. Para o melhor de nosso conhecimento,
GADD45A
é um novo gene de suscetibilidade ao câncer de ovário e este estudo é o primeiro a relatar uma associação entre mutações germinativas em
GADD45A
e risco de tumor e prognóstico. Esperamos
GADD45A
ser um marcador molecular útil para avaliar o risco de câncer de ovário e prognóstico
O SNP 1506T . C está localizado em íntrons e, portanto, não pode alterar a sequência ou a estrutura da proteína. No entanto, entendemos que a variante 1506T C e foi associado com o aumento do risco de cancro do ovário e a sobrevivência decresceu do paciente. Além disso,
GADD45A
funções a jusante da
BRCA1
e
p53
na via de danos ao DNA.
GADD45A
expressão é regulada por vários fatores de transcrição, tais como
p53
,
BRCA1
,
WT1
,
Oct-1 | ,
NF-YA
,
ATF4
,
AP-1 |,
c-myc
, e
ZBRK1
, que tipicamente ligar ao promotor ou regiões intrônicas de
GADD45A
[16, 20, 21, 29]. Assim, a hipótese de que esta variante pode afectar fator de transcrição sítios de ligação, alterando assim
GADD45A
expressão e afetando gênese do tumor. Consistente com os resultados obtidos em outros estudos de câncer [22-24],
GADD45A
expressão de mRNA foi menor nos pacientes do ovário do que os controles. Além disso,
GADD45A
expressão de mRNA foi menor nos pacientes com o genótipo CC em comparação com pacientes portadores do alelo T (TT + TC) e a sobrevida dos pacientes com o genótipo CC era mais pobre. Assim, com o alelo C (TC + CC) foi associada a um risco aumentado de CA125 positivas. Esses resultados foram consistentes com a função de
GADD45A
.
GADD45A
está implicado na desmetilação DNA ativo, além da manutenção da estabilidade genômica, reparo do DNA e supressão do crescimento celular [29,30].
Como indicado anteriormente, os participantes envolvidos em nosso estudo foram principalmente moradores da província de Shandong, na China. Porque a população chinesa é geralmente mais geneticamente homogênea do que outras populações étnicas, podemos prever que estes resultados serão consistentes em amostras maiores em toda a China, mas determinar a aplicabilidade dos nossos resultados a outras populações étnicas (tanto dentro como fora da Ásia) requer uma investigação mais aprofundada em diferentes populações de pacientes e amostras maiores são necessários antes que esses dados podem ser extrapolados para outras etnias [30].
em conclusão, verificou-se, pela primeira vez, que o
GADD45A
(1506T C) polimorfismo pode ser correlacionada com a susceptibilidade do cancro do ovário, características clínico-patológicas,
GADD45A
níveis de expressão e prognóstico do cancro do ovário. Porque
GADD45A
foi demonstrado ser um regulador chave numa rede complexa de vias oncogénicas, são necessárias novas investigações para elucidar o papel funcional deste gene e a sua associação com a carcinogénese e do desenvolvimento do ovário. As variantes de
GADD45A
pode vir a ser marcadores úteis para a identificação de pacientes com câncer de ovário suscetíveis ou indicadores de prognóstico da progressão da doença, e eles também podem servir como potenciais alvos para terapias futuras.
neste estudo, pela primeira vez, que demonstram que o
GADD45A
(1506T C) polimorfismo está associada à susceptibilidade a cancro do ovário e prognóstico. Observou-se uma relação entre o
GADD45A
(1506T C)
GADD45A
níveis de expressão de polimorfismo e. Estes dados sugerem que
GADD45A
(1506T C) é um novo gene de susceptibilidade do tumor e pode ser um marcador molecular útil para avaliar o risco de câncer de ovário e para a previsão do prognóstico do câncer de ovário paciente
.