Abstract

fucosila�o é uma modificação oligossacarídeos crucial no cancro. A função conhecida de fucosila�o no câncer é mediar metástases através de processos dependentes do ligando de selectina. Anteriormente, verificou-se perda completa da fucosilação na linha celular HCT116 do cancro do cólon, devido a uma mutação na enzima sintética de GDP-fucose, GDP-manose-4,6-desidratase (GMDS). Perda de fucosilação levado a escapar de células cancerosas de tumor vigilância imunológica seguido de progressão tumoral e metástases, o que sugere uma nova função de fucosilação na via de progressão tumoral. No presente estudo, foi investigada a frequência de mutação GMDS em um número de amostras de tecido de cancro colorrectal clínicos: 81 amostras de tecido de câncer colorretal primário e 39 amostras de lesão metastática, incluindo fígado e linfonodo. Foram identificados quatro tipos de mutação de deleção em GMDS em tecidos de câncer de originais, bem como lesões metastáticas. A frequência de mutação GMDS foi ligeiramente maior nas lesões metastáticas (12,8%, 5/39 amostras) do que em tecidos de câncer originais (8,6%, 7/81 amostras). Nenhuma mutação do gene GMDS foi observada em tecidos normais circundantes do cólon tecidos de cancro, sugerindo que a mutação somática é, em vez de na linha germinativa. A análise imunohistoquímica revelou perda completa de fucosila�o em três casos de tecido de câncer. Todos os três casos tiveram mutação GMDS. Em um dos três casos, foi observada perda de fucosila�o em apenas lesão metastática, mas não o seu tecido de câncer de cólon inicial. Estes dados demonstram o envolvimento da mutação GMDS na progressão do cancro colorectal

Citation:. Nakayama K, Moriwaki K, Imai T, Shinzaki S, Kamada Y, Murata K, et al. (2013) Mutação do PIB-manose-4,6-desidratase em Colorectal Cancer Metástase. PLoS ONE 8 (7): e70298. doi: 10.1371 /journal.pone.0070298

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 25 Janeiro, 2013; Aceito: 18 de junho de 2013; Publicação: 29 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Nakayama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

fucosila�o é uma das mais importantes modificações de oligossacarídeos em cancro e inflamação [1]. Fucosila�o é regulada por vários fucosiltransferases, guanosina 5′-difosfato (GDP) -fucose enzimas sintéticas e transportadores PIB-fucose. A maioria de GDP-fucose, é sintetizado pela via de novo em que o PIB-manose é transformado em GDP-fucose por GDP-manose-4,6-desidratase (GMDS) e PIB-4-ceto-6-deoxymannose-3,5- epimerase-4-redutase (FX) [2] – [4]. Vários anticorpos que reconhecem glicoproteínas ou glicolípidos fucosilado em soros de pacientes com cancro têm sido muito utilizados como marcadores tumorais [5]. A alfa-fetoproteína (AFP) -L3 fracção, que é fucosilado AFP, também tem sido utilizado clinicamente como um marcador tumoral do carcinoma hepatocelular desde 1996 e no Japão desde 2005, nos Estados Unidos [6]. Em geral, fucosilação níveis aumentam durante a carcinogénese de vários tipos de cancro [7], [8]. Previamente, no entanto, verificou-se que a perda completa da fucosilação devido a mutação de deleção de genes permitiu células cancerígenas do cólon GMDS para escapar de vigilância de tumor assassinas naturais mediada por células por meio da modulação de ligando de necrose tumoral relacionado com o factor de indução de apoptose (TRAIL) de sinalização [9 ], sugerindo que uma nova via metastática dependente de perda de fucosilação. GMDS mutação foi observada em dois pontos (HCT116, LS174T, NCI-H716) e linhas celulares de cancro gástrico (SCH), bem como em tecidos do cólon humano e do cancro do ovário [9]. Curiosamente, GMDS mutação não foi encontrada em todos os tecidos normais adjacentes, o que sugere que GMDS mutação somática era. Se a perda de fucosilação é crítica para a metástase do tumor durante a progressão do cancro colo-rectal, a frequência de mutação GMDS provavelmente ser aumentada em lesões metastáticas. Neste estudo, foi investigada a frequência da mutação GMDS em tecidos com câncer colorretal metastático, como nó de fígado e linfa.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O protocolo e informado consentimento foram aprovados pelos conselhos de revisão institucional da Universidade de Osaka Graduate School of Medicine. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes, eo estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki.

Amostras de Tecido

Trinta e uma amostras de câncer hepático metastático, 2 amostras de outros tipos de câncer metastático (cancro gástrico, cancro da tiróide) e 81 amostras de tecidos de câncer de cólon originais derivadas de pacientes com câncer colorretal submetidos à ressecção primária do Departamento de Cirurgia da Osaka Medical Center para o cancro e as doenças cardiovasculares entre 1995 e 2005 foram armazenadas a -80 ° C até ser utilizado. Seis amostras de linfonodos metastáticos de pacientes com câncer colorretal submetidos à ressecção primária do Departamento de Cirurgia do Hospital Municipal Suita 2010-2012 também foram utilizados neste estudo. Os parâmetros clínicos dos pacientes deste estudo estão resumidos na Tabela 1. Alguns dos tecidos de cancro foram embebidos em parafina e utilizado para análise imuno-histoquímica. Esses estudos foram aprovados pelo comitê de ética institucional do Hospital da Universidade de Osaka.

Triagem de GMDS Mutation com transcrição reversa Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Análise

O RNA total foi extraiu-se a partir de tecidos congelados de acordo com um protocolo padrão utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). O RNA extraído foi sujeitos a transcrição reversa usando Super Script ™ III transcriptase reversa e o iniciador oligo dT (da Invitrogen). Usando o ADNc sintetizado, a PCR foi realizada com polimerase de ADN-Plus-KOD (TOYOBO, Osaka, Japão). Os iniciadores de PCR para GMDS foram os seguintes: F, 5′-GCAAGCTTAAAATGGCACACGCACCGGCAC-3 ‘e R’, 5′-GCGGATCCTCAGGCATTGGGGTTTGTC-3 ‘. desidrogenase Glyceraldehydes-3-fosfato (GAPDH) foi usada como um controlo interno, e os seguintes iniciadores de PCR foram utilizados para amplificar GAPDH: F, 5’-AACGGGAAGCTTGTCATCAAT-3 ‘e R’, 5′-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3 ‘. A análise da sequência foi realizada com um ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA).

imuno-histoquímica Estudos

Câncer e tecidos de cólon normais foram fixadas com formalina a 10% /fosfato-tamponada solução salina (PBS) e armazenadas como amostras embebidas em parafina. As secções de tecido de 4 ^ m foram de-manteiga, e a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada por tratamento com 0,3% de peróxido de hidrogénio em metanol durante 10 min. Depois de lavar duas vezes com PBS, as amostras foram incubadas com solução salina tamponada com Tris e Tween 20 contendo 5% de albumina de soro bovino durante a noite a 4 ° C. As amostras foram incubadas com biotinilado

Aleuria aurantia

lectina (AAL; 2,0 ug /ml) ou anticorpo anti-coelho GMDS (0,3 ug /ml) durante 1 hora à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas três vezes com PBS e subsequentemente incubadas com o kit ABC (Vector Labs, Burlingame, CA) para a coloração AAL ou com Dako Cytomation Envision + System-HRP Labeled Polymer anti-anticorpo de coelho (Dako, Glostrup, Dinamarca) para a coloração GMDS em temperatura ambiente durante 30 min. Depois as amostras foram lavadas três vezes com PBS, coloração positiva foi visualizada utilizando diaminobenzidina (Dako).

Resultados

GMDS mutação no cancro colorectal

Para examinar a frequência de mutação GMDS em cancros colo-rectais originais e metastáticas, o RNA total foi extraído a partir de 81 amostras de tecidos de cancro colo-rectais humanos originais, 39 amostras de tecidos de cancro metastático do cólon, e tecidos normais adjacentes e foi submetido a análise de RT-PCR. Quatro produtos de PCR mais curtos foram encontrados em vários tecidos originais e cancro metastático (Fig. 1). A análise da sequência revelou detalhada diferentes tipos de eliminação de GMDS exões: exons 2-4, 5-7, 2-7, e 3-7. Duas destas mutações, a deleção dos exões 5-7 e os exões 2-4, foram idênticas às nas linhas celulares HCT116 e SCH, respectivamente. Deleções de exons 2-7 e 3-7 do gene GMDS representam novas mutações identificadas neste estudo. As mutações GMDS nas lesões metastáticas foram consistentes com aqueles a partir de tecidos de cancro colorrectal originais. Curiosamente, o homozigoto da mutação GMDS sem tipo normal de GMDS transcrição foi encontrada em um tecido de câncer hepático metastático (caso 1 na Fig. 1). A frequência de mutação GMDS em lesões metastáticas foi de 12,8% (5/39 amostras): 12,9% (4/31 amostras) no fígado, 16,7% (1/6 amostras) no nó de linfa, e 0% (0/2 amostras) em outros órgãos (Tabela 2). A frequência ligeiramente inferior 8,6% (7/81 amostras) da mutação GMDS foi observada nos tecidos de câncer de originais em comparação com as suas lesões metastáticas, embora a diferença não foi estatisticamente significativa (

p Art 0,10, por χ

2 de teste). Nenhuma mutação GMDS foi observada em 24 amostras de tecidos de cólon normais adjacentes.

DGMs mutações foram observadas em sete casos de tecidos com cancro colorectal originais e cinco casos de lesões metastáticas. As setas indicam bandas que representam mutação GMDS: exclusão de exons 2-4 (A, 876 pb), 5-7 (B, 693 pb), 2-7 (C, 450 pb) e 3-7 (D, 495 pb) . As setas indicam GMDS tipo selvagem (*) e não específica (**) bandas. G-6 indica um dos casos com linfonodos metastáticos. N, tecido normal adjacente; T, tumor; LN, linfonodo.

Imunohistoquímica

Para examinar nível fucosila�o celular nesses tecidos de câncer, 33 casos de tecidos com cancro colorectal originais e quatro casos de seus gânglios linfáticos metastáticos foram coradas com anticorpo anti-GMDS e uma subunidade de lectina de ligação glicanos fucosilados, AAL. análises de RT-PCR mostrou mutação GMDS heterozigotos em cinco dos 33 casos. Vinte e oito tecidos de câncer colorretal sem mutação GMDS mostrou coloração positiva para ambos GMDS e AAL. imagens representativos são mostrados na Fig. 2A (caso-N). Em contraste, dois dos cinco casos de cancro original com mutação GMDS mostrou coloração negativa para ambos GMDS e AAL (caso 4 e 6 na Fig. 2A). Curiosamente, um dos cinco casos com mutação GMDS mostrou coloração negativa para ambos os GMDS e AAL no linfonodo metastático, apesar da coloração positiva em seu tecido original do cancro do cólon (case L-6 na Fig. 2B e C).

Trinta e três casos de tecidos com cancro colorectal originais e quatro casos de seus gânglios linfáticos metastáticos foram coradas com GMDS anticorpo anti-e AAL. Casos (a) 4 e 6, que retratam o cancro colorectal original com mutação GMDS, mas não caso n, que não têm a mutação GMDS, mostrou coloração negativa para ambos os GMDS e AAL. (B, C) No caso de L-6, que fez mutação porto GMDS, o linfonodo metastático não foi corada para GMDS (B) e AAL (C), apesar de coloração positiva para ambas as GMDS e AAL na amostra de tecido do cancro colorectal originais. Caso L-4 sem mutação GMDS apresentou coloração positiva para GMDS e AAL em ambas as legiões originais e metastáticos. A barra indica 100 um. LN, linfonodo.

Discussão

Em nosso estudo anterior, a mutação GMDS foi identificado por gDNA sequenciamento em dois dos 100 casos de tecido de cancro colorectal humana e por RT-PCR análise em cinco de 10 casos de tecido de câncer de ovário humano microdissectados. Neste estudo, demonstrámos ainda mais a mutação GMDS em vários tecidos de cancro colorectal originais e metastáticos humanos. A frequência de mutação GMDS foi ligeiramente maior nas lesões metastáticas (12,8%) do que nos tecidos de câncer originais (8,6%). Curiosamente, em um caso (G-6), observou-se perda de fucosilação no nódulo linfático metastático, mas não no seu tecido de cancro inicial (Fig. 2B e C). Estes resultados sugerem que a mutação está envolvida GMDS na progressão do cancro colorectal. O número de casos com mutação GMDS não foi suficiente para examinar a correlação estatística entre a mutação GMDS e atividade da doença com toda a certeza. Uma análise mais aprofundada com maior número de amostras será necessária para determinar a correlação entre a mutação GMDS e progressão do cancro do cólon. Quatro dos nove pacientes com a mutação GMDS (caso 1-8 e casos de L-6) foram submetidos a intervenção cirúrgica dentro de 3 anos após o diagnóstico. Assim, também é necessário um estudo de acompanhamento para investigar recorrência de metástase.

Embora a maioria das mutações DGMs observados neste estudo foram heterozigotos, mutação deleção homozigótica foi observada em um tecido de câncer hepático metastático (caso 1, Figura 1). Uma vez que os tecidos de cancro consistem de uma variedade de células, incluindo as células cancerígenas não só, mas também as células intersticiais, é difícil para demonstrar se as células cancerosas abrigar um tipo heterozigótico ou homozigótico de mutação por análise de RT-PCR utilizando tecidos de cancro inteiros. Assim, a possibilidade de que as células cancerosas têm uma mutação homozigótica GMDS eliminação nos tecidos, em que a mutação de deleção heterozigótica foi observados restos. De facto, a expressão de GMDS glicanos fucosilados e quase não foram detectadas por análise imuno-histoquímica utilizando o anticorpo anti-GMDS e AAL, em três dos cinco casos com uma mutação heterozigótica GMDS, sugerindo que as células de cancro nestes tecidos pode realmente ter GMDS mutação homozigótica.

os níveis de expressão do gene em tecidos de cancro GMDS são afectados por não só mutação do gene mas também por regulação da transcrição. Embora alguns dos genes relacionados com a glicosilação foram relatados para ser epigeneticamente regulados [10], [11], expressão de GMDS não foi alterada por tratamento com agentes que modulam a estrutura de ADN epigenética por metilação de ADN ou de acetilação da histona, sugerindo que os efeitos epigenética não fazer desempenham um papel importante na regulação da expressão do gene GMDS [12] (dados não mostrados). Outros estudos sobre regulação da expressão gênica do gene GMDS são garantidos.

Entre os muitos genes relacionados com fucosila�o, mutação do FUT1 fucosiltransferases, 2 e 3, que catalisam α1-2 ou 1-3 /4 fucosila�o, tem sido relatada em pacientes com tipos sanguíneos raros [13], [14]. Além disso, o transportador de GDP-fucose, também tem sido relatado para ser responsável pela deficiência de adesão de leucócitos tipo II, que é um síndrome recessiva rara caracterizada por crescimento e atraso mental grave e imunodeficiência [15] – [17]. Nenhuma mutação de genes relacionados com a fucosilação tem sido relatada em tecidos de cancro humano antes. GMDS é o primeiro gene relacionado com fucosilação que foi encontrado para ser mutado em tecidos de cancro. Próxima geração de análise de sequência de ADN pode ser uma ferramenta útil para determinar por que DGMs mutação ocorre em vários tipos de cânceres.

Alto nível fucosila�o em células cancerosas foi demonstrada para aumentar a metástase através da expressão upregulating de sialil Lewis A e X, ligandos de selectina, na superfície da célula [10]. Em contraste, os nossos resultados mostram que a perda de fucosilação também aumentou metástase, mesmo na ausência de ligandos de selectina. metástase do câncer progride através de muitas etapas: escapar de células do sistema imunológico, invasão, angiogénese, intravasation, homing aos tecidos metastáticos, extravasamento e colonização [18]. Fucosilação poderia ter um papel diferente em cada passo. Fucosila�o em células de câncer precisa ser fortemente regulada e sua dysregulaiton causará uma maior progressão e metástase do câncer. Em conclusão, o presente estudo demonstrou que GMDS mutação devem ser envolvidos na progressão do cancro colo-rectal. Próxima geração de análise da sequência de DNA pode nos dar mais informações sobre mutação GMDS no cancro colorectal.

Reconhecimentos

Este estudo foi realizado como um programa de pesquisa do Projeto de Desenvolvimento da Pesquisa Inovativa em Cancer Therapeutics (P-direto), Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão e foi parcialmente financiado pela New Energy and industrial Technology Development Organization (NEDO) como parte do Projeto de Tecnologia em Desenvolvimento para a Implementação Funções cadeia de açúcar no Japão . Este trabalho também foi apoiado em parte pelo Programa Global de COE da Universidade de Osaka, financiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão.