Abstract

Objectivo

Recentemente, Next Generation Sequencing (NGS) começou a suplantar outras tecnologias para testes de mutação genética que agora é necessário para terapias direcionadas. No entanto, a transferência de tecnologia NGS para a prática clínica diária requer validação.

Métodos

Nós validado o painel Ion Torrent AmpliSeq cólon e pulmão interrogar 1850 hotspots em 22 genes de utilizar a máquina da Ion Torrent Personal Genome . Primeiro, usamos padrões de referência comerciais que carregam mutações nas freqüências alélicas definido (AF). Em seguida, 51 adenocarcinomas colorectal (CRC) e 39 carcinomas não pequenas células (CPNPC) foram analisados ​​retrospectivamente

Resultados

A sensibilidade e precisão para detectar variantes em um AF . 4% foi de 100 % para os padrões de referência comercial. Entre os 90 casos, 89 (98,9%) foram sequenciadas com sucesso. Entre as 86 amostras para as quais NGS eo teste de referência foram informativo, 83 apresentaram resultados concordantes entre NGS eo teste de referência; ou seja,

KRAS Comprar e

BRAF Compra de CRC e

EGFR Compra de NSCLC, com os 3 casos discordantes cada uma caracterizada por uma AF . 10%

conclusões

no geral, o painel do cancro do cólon /pulmão do AmpliSeq era específico e sensível para a análise de mutações de painéis de genes e pode ser incorporada na prática clínica diária

Citation:. D’Haene N, Le Mercier M, de Neve N, Blanchard O, Delaunoy M, El Housni H, et al. (2015) Validação clínica de Targeted Next Generation Sequencing para cancros do cólon e pulmão. PLoS ONE 10 (9): e0138245. doi: 10.1371 /journal.pone.0138245

editor: Aldo Scarpa, Universidade de Verona, Itália

Recebido: 04 de março de 2015; Aceito: 27 de agosto de 2015; Publicação: 14 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 D’Haene et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do “Fonds Yvonne Boël” (Bruxelas, Bélgica). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os recentes avanços na tecnologia de sequenciação permitiram perfil abrangente de alterações genéticas no cancro [1]. O desenvolvimento de tratamentos inibidor de tirosina cinase tornou importante para testar doentes com cancro de mutações genéticas clinicamente significativos que influenciam o benefício do tratamento. Identificação de mutações associadas ao câncer tornou-se o tratamento padrão para o tratamento do câncer; exemplos de tais incluem

RAS

mutações nos carcinomas colo-rectal metastático ou

EGFR

mutações no câncer de pulmão. Rotina

EGFR

testes de mutação somática agora é recomendado na Europa e Estados Unidos para carcinomas não-escamosas não pequenas células (CPNPC) [2, 3]. Novas orientações europeias incentivar fortemente uma ampla cobertura de exons 18-21 [2]. Além disso, novas orientações NCCN para NSCLC apoia fortemente perfil molecular mais ampla com o objetivo de identificar mutações motorista raras para as quais medicamentos eficazes já pode estar disponível, ou para aconselhar os pacientes de forma adequada em relação à disponibilidade de ensaios clínicos (diretrizes NCCN http: //www.nccn .org /profissionais /physician_gls /pdf /nscl.pdf). Até recentemente, as indicações para o teste molecular padrão de atendimento no carcinoma colorretal incluíram testes para

KRAS

estado mutacional como um preditor de resposta ao anti-epidérmico do receptor do factor de crescimento agentes (EGFR), como cetuximab [4]. Agora, as diretrizes recomendam que, no mínimo, exão 2

KRAS

estado de mutação deve ser determinada e sempre que possível, não exão 2

KRAS Comprar e

de ARN

statuts mutação deve ser também determinada (NCCN diretrizes https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf). Isto sublinha que o número (ou a extensão) de biomarcadores que será precisam ser avaliada na prática clínica diária em patologia molecular está aumentando rapidamente. Isto exige a implementação de métodos de sondagem do estado mutacional de múltiplos genes. Além disso, este aumento do número de genes a testar é associada com uma diminuição no tamanho da amostra. O patologista está enfrentando um novo desafio: a otimização do tecido tumoral disponível. Como o número de variantes genéticas clinicamente significativas tem aumentado, testes clínicos evoluiu, passando de mutações únicas para multiplexar avaliações hotspot em vários genes do cancro. Nos últimos anos, Next Generation Sequencing (NGS) começou a suplantar outras tecnologias para testes de mutação genética [5-8]. Alvo,-amplicon com base NGS oferece sequenciamento simultâneo de milhares de sequência de ADN curta de uma maneira massivamente paralelo e pode oferecer uma abordagem de custo eficaz para detectar múltiplas alterações genéticas com uma quantidade mínima de DNA [5, 9, 10]. Além disso, NGS pode ser realizado utilizando ADN de blocos, (FFPE) de tecido embebidas em parafina e fixado em formalina [11-16]. A aplicação clínica da NGS em câncer é a detecção de alterações genômicas clinicamente acionáveis ​​genéticos /que são críticas para o tratamento do câncer [6]. Essas alterações podem ser de diagnóstico, prognóstico, ou o significado terapêutico. No entanto, a transferência de tecnologia NGS para a prática clínica diária requer validação.

No presente estudo avaliou-se a aplicabilidade clínica do Colon Ion Ampliseq e painel de câncer de pulmão nos Ion Torrent Personal Genome Automática (PGM-Life Technologies) a tela de pulmão e colorretal. O Colon Ion Ampliseq e painel de câncer de pulmão é um método de preparação de biblioteca baseada em PCR multiplex pelo qual 90 amplicons que abrangem 1825 hotspots de mutação de 22 genes relacionados ao câncer de cólon e de pulmão são amplificados selectivamente [14, 15, 17, 18].

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este trabalho foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário Erasme (Bruxelas, Bélgica-ref: P2013 /174). De acordo com a lei belga de Dezembro de 2008, «Loi à l’obtenção et à l’utilização relativa de matériel corporel humain destinar um SED aplicações médicales humaines UO à des barbatanas de recherche scientifique», o consentimento informado não escrita foi exigido. A comissão de ética renunciou assim a necessidade de consentimento informado por escrito do participante.

Amostras selecção

amostras tumorais de 90 pacientes foram analisados ​​retrospectivamente, incluindo 51 adenocarcinomas colorectal (CRC) e 39 não pequenas Os carcinomas do pulmão (NSCLC incluindo 37 adenocarcinomas e carcinomas escamosos 2). O estado mutacional de

KRAS Comprar e

BRAF

no CRC e da

EGFR

em NSCLC tinha sido avaliado anteriormente no contexto da prática diária. Os tipos de amostra primários foram quer ressecções cirúrgicas (n = 57, 44 e 13, CRC NSCLC), biópsias (n = 23, 7 e 16, CRC NSCLC) ou blocos de células (n = 10, todos NSCLC). Além disso, foram utilizados 12 amostras não neoplásicas (6 pulmões e 6 dois pontos) e 5 padrões de referência comerciais FFPE (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK) que transportam mutação no

ARN

,

KRAS

,

AKT Comprar e

EGFR

a 50% freqüência de alelos (AF) e 1 FFPE padrão de referência multiplex (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK) transportando 11 mutações diferentes em vários AF definida (0,9-24,4% ).

DNA extração

o DNA foi extraído a partir de amostras tumorais FFPE utilizando o kit de tecido QIAamp FFPE (Qiagen, Antuérpia, Bélgica). Resumidamente, 10 uM não coradas secções de parafina foram cortadas e incubadas a 37 ° C num forno de secagem durante a noite. A parafina foi removida por incubação das lâminas em 2 banhos sucessivos de xileno e o tecido tumoral foi manualmente macrodissected, raspadas da corrediça com um bisturi e transferido para um tubo de 1,5 ml. O ADN foi em seguida extraído de acordo com as instruções do fabricante. A H E de slides corados a partir do mesmo bloco, anteriormente revisto por um patologista, que circulou a área do tumor e avaliada a percentagem de tumor, foi utilizado como um guia para a macrodissection. A percentagem de células tumorais das amostras variou de 5 a 90%. O DNA obtido foi quantificado usando o fluorímetro Qubit® em combinação com o kit de ensaio Qubit® dsDNA HS (Life Technologies, Gent, Bélgica).

Detecção de

KRAS

,

BRAF

e

EGFR

mutações

Detecção de

KRAS

,

BRAF

e

EGFR

mutações foram realizadas no contexto da clínica prática diária em um laboratório com certificação ISO15189 por PCR quantitativa. Estes métodos são descritos em Ficheiro S1. A sensibilidade desses ensaios é variado entre 3 e 20% do ADN mutante para o teste KRAS, 10% do ADN mutante para testes de BRAF, 0,5% do ADN mutante de EGFR para testes p.L858R, 1% do ADN mutante de EGFR exão 19 deleção e 5% do DNA mutante para testes EGFR p.T790M,

gota digital de PCR

Algumas mutações detectadas pelo NGS foram validados por gota PCR digitais (ddPCR), conforme detalhado no arquivo S1.

Próxima geração seqüenciamento

Para a construção de biblioteca, 10 ng de DNA (medido usando o fluorímetro Qubit® em combinação com o kit de ensaio Qubit® dsDNA HS) foi amplificada utilizando o Colon e painel de Câncer de pulmão (Ampliseq ™, Life Technologies), um painel recentemente validado [15] e o Mix master Ion Ampliseq ™ HiFi (kit ™ Biblioteca Ion Ampliseq 2.0). Uma biblioteca amplicon foi assim gerada para o sequenciamento de 1825 mutações de ponto de acesso em 22 genes, incluindo

AKT1 (NM_05163)

,

ALK

(

NM_004304)

,

BRAF (NM_004333)

,

CTNNB1 (NM_001904)

,

DDR2 (

NM_001014796),

EGFR (

NM_005228),

ERBB2 (

NM_004448),

ErbB4 (

NM_005235),

FBXW7 (

NM_033632),

FGFR1 (

NM_023110),

FGFR2 (

NM_022970),

FGFR3 (

NM_000142),

KRAS (

NM_033360),

MAP2K1 (

NM_002755),

MET (

NM_001127500),

NOTCH1 (

NM_017617),

ARN (

NM_002524),

PIK3CA (

NM_006218),

PTEN (

NM_000314),

SMAD4 (

NM_005359),

STK11 (

NM_000455 ),

TP53 (

NM_000546). Os fragmentos amplificados foram então digeridos, com código de barras e amplificado utilizando o kit ™ Biblioteca Ion Ampliseq 2,0 e ião Xpress ™ kit de adaptadores de código de barras (Life technologies) de acordo com as instruções do fabricante. A biblioteca foi quantificada usando o fluorímetro Qubit® eo kit de ensaio Qubit® dsDNA HS (Life Technologies). 20:00 de cada biblioteca foi multiplexados e amplificado por clonagem em partículas Ion esfera ™ (ISP) por emulsão PCR realizada no Ion One Touch 2 instrumento com o modelo Ion PGM ™ OT2 200 kit (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. controlo de qualidade foi realizado usando o kit de iões Esfera ™ Controlo de Qualidade (Life Technologies) para assegurar que 10-30% do ISP positiva modelo foram geradas na emulsão de PCR. Finalmente, o provedor de modelo foram enriquecidas, carregado sobre um ião 316 ™ ou num chip de iões 318 ™ e sequenciados num sequenciador de PGM ™ com o ião PGM ™ 200 sequenciação kit V2 de acordo com as instruções do fabricante.

Dados análise

os dados brutos foram analisados ​​utilizando o software v3.6.2 suíte torrente (Life Technologies). A análise de cobertura foi realizada utilizando o v3.6 plug-in de análise de cobertura. Casos em que o número de mapeado lê era 100000 e /ou a cobertura de base de média foi de 500x foram consideradas como não informativo. As mutações foram detectadas utilizando o plug-in v3.6 Variante chamador com configurações de restringência baixas (Life Technologies). Na lista variante obtida, cada mutação foi verificada no visualizador genoma Integrative (IGV), do Instituto Broad (https://www.broadinstitute.org/igv/) [19]. Somente mutações do COSMIC (Sanger Institute Catálogo do Somatic Mutações em Câncer) de banco de dados (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) foram tidos em conta e mutações silenciosas ou intrônicos não foram relatados.

análise estatística

Os testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis não paramétricos foram usados ​​para comparar dois ou vários grupos, independentes de dados numéricos, respectivamente. Se o teste de Kruskal-Wallis foi significativa, testes post-hoc foram aplicados usando o procedimento de Dunn padrão para comparar todos os pares de grupos ou sua adaptação para comparar cada condição experimental para o controlo, evitando múltiplos efeitos de comparação (conforme detalhado no Zar [20] )

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Statistica (Statsoft, Tulsa, OK, EUA) e valores de p 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

NGS validação painel

O desempenho do Colon AmpliSeq e painel de câncer de pulmão foi primeiro avaliada utilizando 12 tecidos neoplásicos não (6 pulmões e 6 dois pontos) e 6 padrões de referência comerciais FFPE (5 padrões de referência com uma mutação em freqüências alélicas de 50% e um padrão de referência multiplex transportando 11 mutações diferentes em várias freqüências alélicas definidos, variando de 0,9-24,4%).

no mutação foi detectada em 12 tecidos não neoplásicos. Os 5 mutações presentes nos padrões de referência em 5 freqüências alélicas de 50% foram todos corretamente detectado pelo NGS com o cólon AmpliSeq eo painel do câncer pulmonar (Tabela 1). Entre os 11 mutações presentes no padrão de referência em multiplex, todos os mutações com FA 3% foram correctamente detectados por NGS, com a excepção de o

KIT

mutação porque este gene não está incluído nos 22 genes do painel . Para as 3 mutações com AF 3%, apenas um (

EGFR

deleção no exon 19, AF = 2,0%) foi detectado pela Variant chamador enquanto os outros dois (

EGFR

p .L858R e p.T790M com AF = 2,7% e 0,9%, respectivamente) não foram. Por inspecção IGV, verificou-se que estas variantes estavam presentes, mas com baixo AF (25/1633 lê (1,5%) e lê 7/1613 (0,4%), respectivamente). mutações adicionais em

CTNNB1

,

BRAF

,

PIK3CA

e

EGFR

foram detectados pela Variant chamador nas normas de referência (Tabela 1). O

KRAS Comprar e

ARN

padrões são gerados a partir da linha de células SW48 que é relatado para transportar

CTNNB1

p.S33Y e

EGFR

p.G719S mutações no banco de dados cósmica (https://www.sanger.ac.uk/cosmic);

EGFR

padrões são gerados a partir da linha de células RKO que é relatado para transportar

BRAF

p.V600E e

PIK3CA

mutações p.H1047R. Finalmente, o padrão de referência multiplex é gerado a partir das linhas de células RKO, SW48 e HCT16, o que explica a detecção do

CTNNB1

mutação p.S33Y neste controle.

A precisão (reprodutibilidade e repetibilidade) também foi avaliada usando 2 amostras tumorais FFPE e o padrão de referência multiplex. As amostras foram analisadas 5 vezes (5 produções biblioteca de partida a partir do mesmo extracto de ADN) em três experiências diferentes (Tabela 2). Todas as mutações com um AF 4% foram consistentemente detectado. No entanto, as mutações com uma AF 3% foram detectados pela variante do chamador em uma ou mais, mas não todas, das cinco repetições. Por inspecção IGV, as mutações de TP53 inconsistentemente detectados pela variante chamador estavam presentes apenas no replicado para o qual a mutação foi detectada pela variante de chamadas, mas não para as outras réplicas (S1 tabela). Para o padrão de referência, as 3 variantes de EGFR foram detectados através de inspecção IGV (mas com uma cobertura variante 30X para a maioria das réplicas). Embora estes foram inconsistentemente detectado pela variante do chamador (S1 Tabela)

Além disso, algumas mutações foram verificadas por ddPCR (Tabela 2). A mutação p.H1047Q PIK3CA, consistentemente detectados por NGS com uma AF média de 10,8%, foi também detectado por ddPCR com uma FA de 9,1%. Em contraste, o p.R181C e as mutações em TP53 p.H168Y inconsistentemente detectado por NGS não foram detectados por ddPCR. Tendo em conta os factos de que as mutações detectadas com um AF 3% não foram validados por ddPCR (por TP53 mutações) ou inconsistentemente detectado (EGFR mutações no padrão de referência), e que a mutação KRAS com uma AF esperada de 5% foi consistentemente detectados com um AF variando 4,6-5,9%, nós seleccionado um limiar AF 4% para relatórios mutação. Este limiar é consistente com os dados relatados na literatura para esta plataforma NGS [9, 16, 21].

performances Sequencing

Um conjunto de 90 amostras FFPE, incluindo 51 CRC e 39 NSCLC , foi sequenciado por NGS. desempenho sequenciamento foi avaliada a partir do número e distribuição de lê em todas as regiões visadas. Entre os 90 casos seqüenciados, 89 (98,9%) foram bem sucedidos (número de mapeada lê 100000 ou a cobertura de base média de 500x). O caso unsuccesfull foi considerado não informativo devido a uma série de leituras 100 000 (40,072 leituras) e cobertura média de base 500x (1.2X). Entre os 89 casos seqüenciados com sucesso, um caso foi considerado abaixo do ideal (número de leituras: 69,564 e cobertura de base média: 676x), no entanto a qualidade do sequenciamento foi considerado bom o suficiente para uma análise mais aprofundada. Todos os outros casos (n = 88, 97,8%) tiveram um número de leituras 100.000 e um rendimento médio de base 1000X. O número médio de leituras por amostras foi de 232,832 ea profundidade de cobertura básico média foi de 2.296. Em média, 91,6% dos amplicões tinha uma profundidade de cobertura de mais de 500x (Tabela 3). Não houve diferença significativa entre CRC e NSCLC em termos de número de leituras (p = 0,45), a profundidade de cobertura de base (p = 0,42) e a percentagem de produtos de amplificação com uma profundidade de cobertura superior a 500x (p = 0,32) (teste de Mann-Whitney ). Para 12 casos, a quantidade de ADN obtido depois da extracção era demasiado baixo para chegar a 10 ng necessária para a sequenciação de alvo (ADN concentração variando de 0,1 a 1,5ng /mL). O sequenciamento foi bem-sucedida para os 12 casos e não houve diferença estatística em termos de número de leituras (p = 0,45), a profundidade de cobertura de base (p = 0,42) e em termos de percentagem de amplicons com uma profundidade de cobertura de mais de 500x ( P = 0,32) entre as amostras com menos do que a necessária 10ng de ADN e amostras com ADN suficiente (teste de Mann-Whitney, Tabela 3). Isto sugere que a sequenciação de sucesso pode ser obtido a partir de tão pouco quanto 1 ng de DNA.

Em seguida, considerou a influência de diferentes tipos de amostras primária sobre o desempenho sequenciamento. Não houve diferença estatística em termos de número de leituras e profundidade de cobertura básico entre as ressecções cirúrgicas, biópsias e blocos de células (teste de Kruskal-Wallis, Tabela 3). No entanto, a percentagem de amplicons com uma profundidade de cobertura de mais de 500X foi significativamente maior para blocos de células que para biópsias (Kruskal-Wallis p = 0,02 e teste post-hoc p = 0,02).

Os amplicons que mostrou uma cobertura abaixo 250X foram consideradas não informativo. Este limiar foi já utilizado na literatura [22]. Alguns dos produtos de amplificação do painel repetidamente não conseguiram chegar a 250X (em mais de 10% das amostras). Estes fragmentos amplificados estão listadas na Tabela 4. Os amplicons que repetidamente falhou foram os mesmos para os diferentes tipos de amostras primários (biópsias, blocos de células e de ressecção cirúrgica). Para estes produtos de amplificação, o teor de GC foi significativamente mais elevado (teor médio de GC nos 7 amplicões que repetidamente com falha foi de 69,6% contra 48% para os outros produtos de amplificação, p = 0,00005), ao passo que o comprimento não foi significativamente diferente (o comprimento médio do 7 amplicons que repetidamente falhou foi de 108 pb contra 112 para os outros amplicons).

a comparação com outros métodos

Um conjunto de 90 amostras FFPE, incluindo 51 CRC e 39 NSCLC, foi sequenciado pelo NGS. O estado mutacional de

KRAS

(exão 2) e

BRAF

(p.V600E) no CRC e

EGFR

(p.L858R e deleções no exão 19) em NSCLC tinha sido previamente avaliadas por PCR no contexto da prática diária.

NSCLC.

o sequenciamento foi bem sucedida por 38 das 39 amostras testadas (97%), enquanto que o

EGFR

análise de PCR com o método foi bem sucedido para apenas 35 das 39 amostras (90%). 34 amostras têm sucesso testar tanto pela NGS e PCR, permitindo estudo de concordância.

Usando NGS, mutações no

EGFR

foram detectadas em 4/38 casos (10,5%). Três em cada quatro

EGFR

mutações foram também detectados por PCR. Para uma amostra que foi considerado como não informativa por PCR, um p.L861Q

EGFR

mutação foi detectada usando NGS (S2 Tabela). Além disso, um p.L858R

EGFR

mutação foi detectada por PCR e por NGS. No entanto, para esta amostra a Variant Caller detectada a mutação em um AF de 1,9%; dado os nossos critérios para considerar uma variante como autênticos (ver materiais e métodos) que não poderia validar essa variante.

No geral, a concordância entre os dois métodos para

EGFR

detecção de mutações foi de 33/34 (97%)

Além disso, mutações em outros genes foram detectados por NGS:. mutações no

KRAS Compra de 15/38 amostras (39,5%), mutações no

TP53

para 15/38 pacientes (39,5%), mutações no

STK11 Compra de 3/38 pacientes (7,9%), mutação no

BRAF Compra de uma amostra (2,6%), mutação no

PIK3CA Compra de um paciente (2,6%), mutação no

CTNNB1 Compra de uma amostra (2,6%). perfis mutacionais de NSCLC foram resumidos na Figura 1 e na Tabela S2. Em geral, 29/38 amostras foram caracterizadas por, pelo menos, uma mutação (76,3%).

As mutações em genes diferentes (linhas) são indicadas para cada amostra de NSCLC (colunas). Um quadrado cinza indica que uma mutação (relatado no banco de dados COSMIC (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), excluindo polimorfismo) foi encontrado com o Colon Ampliseq e painel de pulmão no gene, enquanto um quadrado vazio indica que nenhuma mutação relevante foi encontrado para o gene

os 2 mutações KRAS identificados com um AF . 6% (um p.G12S com um AF de 4%, um p.G12D com um AF de 5%) foram verificadas por ddPCR. Os 2 mutações foram detectados por ddPCR com um AF de 1,1 e 5,7%, respectivamente (S2 Tabela).

CRC.

Sequenciamento e PCR foram bem sucedidos em todas as amostras.

Usando NGS, mutações no

KRAS

foram detectados em 30/51 casos (58,8%), enquanto que

KRAS

análise com o método de PCR detectou apenas 23 casos de mutações no

KRAS

gene (45,1%). Cinco dos 7 casos discordantes foram caracterizados por mutações nos códons 59, 61 e 146 (exons 3 e 4) que não foram cobertos pelo teste de PCR. As mutações nos códons 61 e 146 foram testados e validados por ddPCR (S3 Tabela) Para os 2 casos restantes não detectadas por PCR,

KRAS

mutação p.G12V foi detectada por NGS com um AF de 8 e 9%, respectivamente. Estas mutações também foram detectados por ddPCR com uma FA de 12,5 e 9%, respectivamente. Nos 23 casos concordantes, AF de

KRAS

mutações foram maiores que 20% para 21 casos; apenas dois casos foram caracterizados por um AF de 9 e 10%, respectivamente.

O estado mutacional de

BRAF

por PCR foi avaliada por 49 casos (por 2 casos não havia DNA suficiente) .

BRAF

mutação p.V600E foi detectada por 5 pacientes (10,2%) utilizando NGS ou PCR. . Além disso, a

BRAF

mutação p.E586K foi detectada usando NGS

Além disso, mutações em outros genes foram detectados por NGS: mutações no

ARN Compra de 2/51 pacientes (3,9%), mutações no

TP53 Compra de 32/51 pacientes (62,7%), mutações no

PIK3CA Compra de 10/51 pacientes (19,6%) e mutações no

FBXW7

em 5/51 amostras (9,8%). Os 2 mutações ARN ea p.E545K, mutações p.H1047 PIK3CA foram todos validados por ddPCR (S3 Tabela).

padrões de mutação de CRC foram resumidos na Figura 2 e S3 Tabela. Em geral, 45/51 amostras foram caracterizadas por, pelo menos, uma mutação (88,2%).

As mutações em genes diferentes (linhas) são indicadas para cada amostra CRC (colunas). Um quadrado cinza indica que uma mutação (relatado no banco de dados COSMIC (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), excluindo polimorfismo) foi encontrado com o Colon Ampliseq e painel de pulmão no gene, enquanto um quadrado vazio indica que nenhuma mutação relevante foi encontrado para o gene.

Discussão

Uma grande vantagem da NGS em relação aos métodos de detecção de mutação tradicionais é a sua capacidade para rastrear múltiplas mutações em vários genes simultaneamente, sem a necessidade para realizar vários testes sequenciais. Vários estudos já validado o uso de NGS e sua superioridade em termos de sensibilidade, velocidade e custo em comparação com os métodos tradicionais. [18, 23, 24] Em nossa própria experiência, para testes, incluindo mais de dois para três hotspots diferentes, NGS é mais barato, mais rápido e exige menos DNA do que seria necessário para os métodos tradicionais. Isto é de particular importância para as amostras de citologia e biópsias de tecidos pequena para que várias alterações moleculares necessitam de ser rastreados, quanto para as amostras de NSCLC e.g. [9, 18]. Na verdade, NGS requer apenas 10 ng para o painel de cólon e cancro do pulmão inteiro, enquanto os métodos tradicionais podem exigir até 10 ng de DNA para cada mutação testado.

A precisão (reprodutibilidade e repetibilidade) análise utilizando padrões de referência com uma conhecido AF nos permitiu mostrar que todas as mutações com um AF 5% foram consistentemente detectado. No entanto, as mutações com uma AF 3% foram detectados de forma inconsistente. Além disso, quando as amostras clínicas foram analisadas 5 vezes em 3 experiências diferentes, a variante do chamador inconsistentemente detectado mutações com uma AF 3%, que não são detectados por ddPCR, sugerindo que estas mutações correspondem a artefactos de sequenciação, como é frequentemente observado com DNA extraiu-se a partir de amostras de FFPE [25-27]. O limiar de 4% foi assim seleccionada para reporte mutação como um balanço entre a maximização da sensibilidade e minimizando os resultados falsos positivos devido ao artefacto técnica. Este limiar é consistente com outros dados de sensibilidade e especificidade relatados na literatura para esta plataforma NGS [16, 21]. Usando este limiar, um caso de NSCLC com uma mutação EGFR p.L858R foi desperdiçada. Para esta amostra a Variante chamador detectada a mutação em FA, de 1,9%. No entanto, dado os nossos critérios para considerar uma variante como autêntico (AF 4% e variante cobertura 30x), não foi possível validar esta variante. foi recentemente proposto que conhecido variantes genéticas clinicamente relevantes, tais como

EGFR

mutações para NSCLC, deve ser relatado independentemente do AF [28]. Em nossa prática clínica atual, quando observamos uma variante do gene clinicamente relevante conhecido, mas com um AF abaixo do limiar, informamos que a variante do gene é suspeita, mas não confirmada e que seria interessante para testar uma outra amostra do paciente se disponível .

As discrepâncias entre NGS e métodos tradicionais foram observados por 2 casos de CRC com mutações KRAS G12V, ambas com uma frequência alélica 10%. Esta baixa AF pode explicar as discrepâncias porque o limiar do método tradicional é que varia de 3 a 20% do ADN mutante para o teste KRAS. Para estes 2 casos, o

KRAS

mutações p.G12V foram validados por ddPCR.

Um dos desafios usando NGS é interpretar as mutações detectadas no contexto biológico. Como já descrito [28], as variantes podem ser agrupadas em três categorias: i) aqueles que podem ter um impacto direto sobre a assistência ao paciente e são consideradas acionáveis; (Ii) aqueles que podem ter relevância biológica, mas claramente não são acionáveis; e (iii) aqueles que são de significado desconhecido. No presente estudo, a análise NGS detectado mutações (exceto

EGFR

mutações para NSCLC e que

KRAS Comprar e

ARN Compra de CRC) com potencial impacto clínico em 4 pacientes com NSCLC (um

PIK3CA

mutação e 3

STK11

mutações) e para 14 pacientes com CRC (10

PIK3CA

mutações, 5

BRAF

mutações e um abrigando paciente

PIK3CA Comprar e

mutações BRAF

). De fato, os dados pré-clínicos apoiar o argumento de que linhagens de células NSCLC com

PIK3CA

ou

STK11

e

KRAS

show de mutação aumento da sensibilidade aos inibidores PIK3 ou MAPK e mTOR inibição de sinalização, respectivamente [29] – [30]. Além disso, uma fase I de escalonamento de dose de um ensaio clínico de classe I pan inibidor de PI3K em pacientes com tumores sólidos avançados primeiramente-rectal, da mama, e a actividade antitumoral preliminar mostrou-pulmonar [31]. Da mesma forma, a actividade anti-tumoral aparente foi observada em pacientes com

BRAF

CRC mutação tratados com um inibidor de BRAF mutante seletiva [32].

Em conclusão, o presente estudo validou a clínica aplicabilidade do Colon Ion Ampliseq e painel de câncer de pulmão na Ion Torrent pessoais Genome máquina para o rastreio de pulmão e colorretal. No geral, o painel do cancro do cólon /pulmão do AmpliSeq era específico e sensível o suficiente para a análise de mutações de painéis de genes e pode ser incorporada na prática clínica diária.

Informações de Apoio

S1 Arquivo. métodos suplementares:. detecção de KRAS, BRAF e mutações EGFR e gota PCR digitais

doi: 10.1371 /journal.pone.0138245.s001

(DOCX)

S1 Table. análise de cobertura para as variantes não consistentemente detectada na análise de precisão

doi:. 10.1371 /journal.pone.0138245.s002

(DOC)

S2 Table. Os resultados da sequenciação de NSCLC

doi: 10.1371. /journal.pone.0138245.s003

(DOCX)

S3 Tabela. Os resultados da sequenciação de CRC

doi: 10.1371. /journal.pone.0138245.s004

(DOCX)