Abstract

O número de cânceres renais tem aumentado ao longo dos últimos dez anos e sobrevida dos pacientes em estágios avançados permanece muito pobre. Por conseguinte, novas abordagens terapêuticas para o cancro renal são essenciais. Englerin A é um produto natural com uma citotoxicidade muito potente e selectiva contra células de cancro renal. Isto o torna um candidato promissor medicamento que pode melhorar os padrões atuais de tratamento para pacientes com câncer renal em todas as fases. No entanto, pouco se sabe sobre o modo de actuação do englerin Um em alvejar as células cancerosas especificamente renais. O nosso estudo é o primeiro a investigar o mecanismo biológico de acção Um englerin em detalhe. Relatamos englerin que A é específico para células de tumor renal e não afecta as células normais de rim. Descobrimos que englerin Um tratamento induz a morte celular por necrose em células de cancro renal, mas não em células de rim normais. Mostramos ainda que autophagic e proteínas pyroptotic não são afectados pelo composto e que a sinalização necrótico nestas células coincidiu com a produção de espécies reactivas de oxigénio e o influxo de cálcio para o citoplasma. Como o primeiro estudo para analisar os efeitos biológicos de englerin A, o nosso trabalho fornece uma base importante para a avaliação e validação de uso do composto como um fármaco anti-tumoral. Ele também fornece um contexto no qual a identificar o alvo ou alvos de englerin Um específica em células de cancro renal

Citation:. Sulzmaier FJ, Li Z, Nakashige ML, Fash DM, Cadeia WJ, Ramos JW (2012) Englerin a Induz seletivamente necrose em células de cancro renal humano. PLoS ONE 7 (10): e48032. doi: 10.1371 /journal.pone.0048032

editor: Kalpana Ghoshal, The Ohio State University, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de julho de 2012; Aceito: 26 de setembro de 2012; Publicado: 22 Outubro 2012 |

Direitos de autor: © Sulzmaier et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Medicina Geral (R01GM088266 para JWR) eo Victoria S. e Bradley L. Geist Foundation (47030 para WJC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de rim é um dos tumores malignos mais comuns em os EUA com uma estimativa de 60,920 novos casos e 13.120 mortes em 2011. Cerca de 85% de todos os cânceres renais são classificados como carcinomas de célula renal, um tumor maligno decorrente da epitélio renal [1], [2]. A terapia primária para pacientes com carcinoma de células renais é a excisão cirúrgica. No entanto, aproximadamente 25% dos doentes apresentam sinais de invasão local ou metástase fazendo a excisão completa difícil [2]. Uma vez que a doença está em fase avançada, a cirurgia por si só não é suficiente e a sobrevivência do paciente 5-ano cai de 70% para menos de 20% [1], [3]. Historicamente, o estado da arte o tratamento de pacientes com carcinoma de células renais tem sido a terapia imunomoduladora com interferão-α ou interleucina-2 [4]. No entanto, os últimos anos têm visto um aumento no uso de abordagens mais específicas para tratar câncer renal em estágio avançado. A descoberta do gene supressor de tumor de chumbo de von Hippel-Lindau (VHL) para o desenvolvimento de receptores tirosina-quinase terapias à base de segmentação da via VEGF ou TGF-α sinalização [5], [6]. BVS regula a angiogénese e uma perda deste gene em células de cancro resulta num aumento da produção de factores de crescimento, como VEGF [7]. Alternativamente, os inibidores da tirosina-cinase receptora como Sorafenib que bloquear a sinalização através de vias afectadas estão agora aprovados ou em ensaios clínicos para o tratamento de cancros avançados renais [8]. No entanto, essas drogas não são aplicáveis ​​para todos os pacientes com câncer renal avançado e efeitos colaterais graves foram relatados em alguns casos [2], [9].

Englerin A é um sesquiterpeno guaiano que mostrou especificidade intrigante como inibidor de crescimento de células de cancro renal [10]. O produto natural foi isolado a partir da casca de

Phyllanthus engleri

, uma planta nativa da Tanzânia e Zimbabwe. Um Englerin foi pesquisada quanto a actividade citotóxica específica contra um painel de linhas celulares de cancro (painel 60 de células NCI). Nesta tela, o composto apresentou câncer de GI específico renal

50 valores que estavam até 1000fold menor do que em outras linhas celulares de cancro. GI

50 valores determinados foram tão baixas quanto 11 nM para certas linhas celulares de cancro renal [10], [11]. Englerin Um não só mostrou especificidade extraordinária para células de cancro renal, em alguns casos, a sua potência foi ainda maior, em seguida, o estado da arte tratamentos como Sorafenib [10], [12]. Após a sua descrição inicial em 2009, laboratórios de todo o mundo têm descrito estratégias de síntese para tornar o produto natural [13], [14], [15], [16], [17], bem como quantidades crescentes de estrutura-atividade de relacionamento de dados [11], [18], [19], [20], [21], [22]. Apesar do seu alto impacto, a literatura sobre englerin Um é ainda limitada e artigos publicados lidam principalmente com a síntese do composto. Nós agora comunicar pela primeira vez que um mecanismo pelo qual englerin A actua sobre as células de cancro renal para inibir o crescimento celular. Os nossos resultados mostram que englerin Um induz especificamente a morte celular por necrose em linhas celulares de cancro renal, mas não afecta a viabilidade de uma linha de células de cancro ou células de rim de glioblastoma normais. Nosso estudo fornece uma visão mais aprofundada da actividade biológica do englerin A.

Materiais e Métodos

Reagentes

Englerin A foi sintetizado no laboratório do Dr. William J. Cadeia de acordo com o protocolo publicado anteriormente [12]. Estaurosporina foi adquirido a Merck Chemicals (Merck, Darmstadt, Alemanha), ionomicina e difosfato de cloroquina foi adquirido de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO).

Linhas Celulares e Cultura Celular

renais linhas de células humanas de carcinoma a-498 e UO-31, bem como a linha celular de glioblastoma SF-295 humana foram obtidos a partir do Repositório tumor DCTD do National Câncer Institute, Frederick, Maryland. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Mediatech Inc., Manassas, VA) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS, Life Technologies, Grand Island, NY), ácidos aminados não essenciais MEM a 1% (NEAA, Mediatech) e 1% de penicilina estreptomicina (Penstrep, Mediatech). As células HEK293 foram adquiridas a partir da ATCC (Rockville, MD) e mantidas em DMEM (Mediatech) suplementado com 10% FBS, 1% de NEAA e Penstrep 1%. células do túbulo proximal renal (RPTC) foram adquiridos a partir de linha de vida celular Tecnologia (Frederick, MD). As células foram cultivadas em RenaLife meio completo (Cell Technology Lifeline). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2 numa incubadora humidificada.

Ensaio de viabilidade celular

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços em 90 ul de meio RPMI sem vermelho de fenol e sem antibióticos, suplementado com 10% de FBS e 2 mM de L-glutamina. As células foram semeadas a uma densidade de 5000 células por poço. As células foram deixadas a ancorar-se durante 60 min a 37 ° C e 5% de CO2 numa atmosfera humidificada. Após 60 min, foi adicionado 10 uL de solução de trabalho englerin A ou um volume equivalente de DMSO, diluiu-se em meio RPMI. Um englerin Uma solução de estoque foi preparado dissolvendo o composto em DMSO a uma concentração de 10 mM. Todos englerin ainda um soluções de trabalho foram preparadas por diluição desta solução de estoque com meio RPMI para a concentração final desejada, tal como indicado. O volume de englerin Uma solução de estoque de DMSO ou veículo de controlo, por conseguinte, nunca excedeu os 0,1% do volume final. Depois de se adicionar o composto, as células foram incubadas durante 48 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando um Ensaio de Proliferação celular (XTT) de acordo com o protocolo do fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).

As células foram plaqueadas a uma densidade de 5000 células por cavidade em uma placa de 96 poços em 90 ul de cultura meio sem vermelho de fenol e antibióticos. As células foram deixadas a ancorar-se durante 60 min sob condições de cultura normais. Após o período de incubação de 10 ul de diluições englerin A ou o solvente de DMSO como controlo foram adicionados aos poços. As células foram incubadas durante 48 h com o composto antes de submetê-las a um Ensaio de Proliferação celular (XTT) de acordo com o protocolo do fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).

Microscopia

micrografias de campo claro foram feitas usando um Zeiss microscópio Axiovert200M com uma objetiva de 40x. imagens obtidas foram analisadas usando software AxioVision. As barras de escala representam 20 um.

Anexina V /PI ensaio

As células foram tratadas com quer 1 uM englerin um, transportador de DMSO ou estaurosporina 5 uM para a quantidade de tempo indicados (1h ou 3H) . Após a incubação, as células foram tripsinizadas e coradas para expressão fosfatidilserina extracelular utilizando Anexina V-FITC etiquetado e iodeto de propídio (PI) como co-mancha para testar a integridade da membrana celular (BD Biosciences, San Jose, CA). Corantes foram utilizados de acordo com o protocolo do fabricante. As células coradas foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD Biosciences) e software de análise CellQuest Pro.

A lise celular e imunotransferência

Os lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão de lise de MLB (1% de NP-40, 25 mM de HEPES-KOH (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,25% de desoxicolato de sódio, 10% glicerol, 10 mM de MgCl

2, 1 mM EDTA e inibidores de protease /fosfatase). Os lisados ​​celulares foram resolvidas utilizando SDS-PAGE, seguida de imunotransf erência. A expressão proteica foi detectada com anticorpos específicos primários contra a PARP, da caspase 3 e GAPDH (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), bem como de caspase 1 (Merck, Billerica, MA), beclin-1 (Epitomics, Burlingame, CA) e LC-3 (Novus Biologicals, Littleton, CO). A ligação dos anticorpos primários foi detectada utilizando IRDye 680 de cabra anti-ratinho e de anticorpos secundários anti-coelho de cabra IRDye 800. As bandas foram visualizadas usando um Imaging System Odyssey Infrared (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE).

Caspase 3 atividade ensaio

atividade da caspase 3 em células tratadas com englerin A, estaurosporina ou DMSO transportadora controlo foi analisada utilizando um Kit de Ensaio de Caspase 3 Actividade (Roche Diagnostics). Após incubação com os compostos células foram lisadas e os lisados ​​celulares foram ensaiadas de acordo com o protocolo do fabricante.

ROS ensaio de detecção

células tratadas com englerin A, estaurosporina ou controlo transportador DMSO foram testados quanto à sua produção de espécies de oxigénio e azoto reactivos utilizando o Kit de ROS total de Detecção (Enzo Lifesciences, Farmingdale, NY). As células foram tratadas de acordo com o protocolo do fabricante. A mudança relativa na reativas de oxigênio ou espécies reativas de nitrogênio foi medido utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD Biosciences) e software de análise CellQuest Pro.

intracelular Ca

2 + ensaio

concentração intracelular de cálcio mediu-se depois as células foram tratadas com englerin um, transportador de DMSO ou ionomicina controlo positivo. Após a incubação de 30 min com o composto 2 ^ M de Fluo-3 AM (Life Technologies) foi adicionado durante 30 minutos de incubação subsequente. Após a incubação, as células foram tripsinizadas e lavadas com PBS 1x. Fluo-3 de ligação a Ca

2+ foi medida através de um aumento da emissão de fluorescência do corante a 520 nm após excitação a 485 nm. As células foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD Biosciences) e software de análise CellQuest Pro.

Resultados

quimicamente sintetizados englerin A reduz viabilidade de linhas celulares de cancro renal

Englerin A foi descrito como tendo actividade potente na inibição do crescimento de células de cancro renal [10]. Publicações recentes descrevem métodos para a produção sintética de englerin A sem a necessidade de isolar o produto natural [13], [14], [16], [17]. Todos englerin A no nosso estudo (estrutura química ver Fig. 1

Um

) foi sintetizado seguindo o protocolo descrito na nossa recente artigo de Li e colegas [12]. A fim de avaliar a potência do englerin sintético Um nós analisamos os seus efeitos citotóxicos em duas linhas celulares de cancro renal humano (UO-31 e A-498) que foram descritos antes de ser sensível ao produto natural. Como linha celular de controlo utilizou-se uma linha celular de glioblastoma humano (SF-295), previamente relatado para ser insensível à englerin a [10]. Além disso, foram analisados ​​os efeitos de englerin Um tratamento sobre a viabilidade de uma linha celular imortalizada derivada de rim a partir de células normais de rim embrionário humano (HEK293) e as células normais epiteliais renais humanas (células do túbulo proximal renal, RPTC). A viabilidade foi determinada através da medição da actividade metabólica das células.

(a) a estrutura química de englerin A. (B) O glioblastoma (SF-295), células de rim imortalizadas normais (HEK-293), renal túbulo proximal células (RPTC) e células de cancro renal (UO-31, a-498) foram incubadas com a concentração indicada de englerin a durante 48 h. A viabilidade celular foi analisada utilizando um Ensaio de Proliferação celular XTT. Os resultados são apresentados em% de viabilidade em comparação com uma amostra de células tratadas com o veículo DMSO. Os valores apresentados representam a média ± SEM de todas as experiências (n≥6). Os valores de IC50 foram calculados com Prism 5 utilizando um ajuste de regressão não-linear (log (inibidor) versus resposta normalizada – declive variável).

Descobrimos que englerin A reduziu a viabilidade das células cancerosas renais durante que não tinha efeitos citotóxicos sobre a linha celular de controlo de glioblastoma (fig. 1

B

). Curiosamente, o composto não afectou a viabilidade das células HEK293 quer e apenas a viabilidade celular alterada em RPTCs em concentrações muito elevadas (Fig. 1

B

,

esquerda). IC

50 valores foram determinados como 140,3 nM para as células UO-31 e 53.25 nM para células A-498. O IC

50 para RPTCs foi de aproximadamente sete magnitudes superior e foi calculada como 2,53 M.

Englerin A provoca alterações morfológicas diferentes induzida por estaurosporina apoptose

Para excluir englerin A efeitos sobre células proliferação que teria representado a diminuição observada na actividade metabólica analisamos a morfologia das células após o tratamento com englerin a utilizando um microscópio de campo claro. As alterações morfológicas também permitiu-nos distinguir entre a morte celular por apoptose e necróticas. Para esta análise, além disso, em relação a morfologia celular em resposta à incubação com a estaurosporina, um conhecido indutor da apoptose [23].

Descobrimos que englerin Um tratamento de células de cancro renal resultou em uma alteração evidente no apontador morfologia celular à morte celular (Fig. 2). Não houve diferença na forma ou estrutura da célula podem ser observados em células de glioblastoma SF-295 tratados com o composto. células de cancro renal tratados com englerin A perdeu extensões filopodia, eventualmente, atingindo uma estrutura redonda, simétrico, antes de retirar totalmente a partir da matriz. Estaurosporina apoptose induzida em ambas as células de cancro renal e glioblastoma. A morte celular apoptótica foi caracterizada pelo encolhimento das células e a formação de corpos apoptóticos que rodeiam a célula morrer. Embora o tratamento com englerin A provocou uma diminuição relativa em volume das células, não foi possível observar a formação de corpos apoptóticos claras. Ambos estaurosporina e englerin A causou as células de cancro renal de morrer, mas de maneiras morfologicamente distintas.

As micrografias mostram a morfologia de células tratadas com englerin A ou estaurosporina, um conhecido indutor da apoptose. As células foram tratadas com quer 1 uM englerin Um ou veículo DMSO durante 60 min, ou estaurosporina 1 uM durante 5 h. As fotos foram tiradas com um microscópio Zeiss Axiovert200 M com um objetivo fase de 40 ×. Para cada tratamento, 5-10 campos aleatórios de visão foram adquiridos. A experiência foi repetida três vezes, micrografias apresentados são representativos da morfologia celular média após tratamento. barras de escala representam 20 mm.

Englerin um tratamento resulta em uma perda da integridade da membrana, mas não no aumento da regulação do fosfatidilserina externa indicativo de estágios apoptóticos primeiros

O morfologicamente resultado diferente em células tratadas com a estaurosporina apoptose-indutor levou-nos a analisar se as células de cancro renal morrer através de processos de sinalização necróticas em vez de apoptose quando incubadas com englerin A. no entanto, as medidas directas de necrose são escassos e a forma mais comum para confirmar celular necrótica morte é por exclusão que uma célula morre por apoptose [24]. Estágios iniciais apoptóticos são caracterizadas por um aumento de fosfatidil-serina (PS) no lado extracelular da membrana celular, seguida pela perda de integridade da membrana nas fases tardias apoptóticas [25]. Utilizou-se a Anexina V marcada com FITC e iodeto de propídio para analisar estes dois parâmetros por citometria de fluxo, que é uma abordagem comum para determinar se a morte celular é apoptótica ou necrótica [26], [27]. Foram quantificados os subpopulações de células correspondentes às fases de necrose precoce /apoptóticas tardias e apoptóticas através da medição da percentagem de células que expressam PS extracelular, com ou sem a perda de integridade da membrana (Fig. 3).

As células foram tratadas com quer 1 Um englerin uM ou veículo DMSO durante 60 min, ou 5 uM estaurosporina durante 3 h. Após a incubação, as células foram tripsinizadas e coradas para expressão fosfatidilserina extracelular utilizando Anexina V-FITC etiquetado e iodeto de propídio (PI) como co-mancha para testar a integridade da membrana celular. É mostrado um representante resultado de três repetições experimentais independentes. Quantificações e estatísticas de todos os dados são descritos como gráficos de barras e mostram a distribuição de células teste positivo para a ligação de anexina V (estágios iniciais de apoptose) ou a ligação de anexina V e absorção de iodeto de propídio (estágios finais apoptóticos /morte necrótica). Os valores apresentados são a média ± SEM (n = 3), diferenças estatisticamente significativas estão marcadas com asteriscos (*** p 0,001), n.s. = Não significativo.

Como esperado, a linha de células SF-295 controlo não mostraram um aumento significativo nas populações de células em apoptose quando tratadas com englerin A ou o controlo de transportador de DMSO. Estaurosporina tratamento causou a morte celular por apoptose em todas as linhas celulares acompanhado por um aumento em ambas as populações de células apoptóticas precoces e tardias. células de cancro renal A-498 foram os mais sensíveis, que mostra a percentagem mais elevada (27%) de células apoptóticas tardias /mortos. SF-295 e UO-31 linhas celulares apresentou populações elevadas nos primeiros estágios apoptóticos de cerca de 12-20%. Um claro aumento em células apoptóticas precoces também era visível após 1 h de tratamento com estaurosporina (Fig. S1).

Curiosamente, englerin Um tratamento não afectou as populações de células da mesma forma. Não foi encontrada nenhuma mudança significativa das populações de células apoptóticas precoces (anexina V positiva único) em qualquer UO-31 ou células A-498 após tratamento com englerin A. O tratamento fez com que as células perdem a integridade da membrana no início, que conduz a uma coloração positiva de duplo as células. Embora a percentagem de células no início da apoptose sector não aumentou, foi observado um aumento estatisticamente significativo de células mortas, aproximadamente, 10-15% em amostras de células UO-31 e uma população positiva dupla de até 27% em células A-498 depois 1 h de tratamento (Fig. 3, gráficos de barras). Mesmo a um ponto de tempo depois, o número de células positivas individuais, cedo apoptóticos não aumentou nos tratamentos englerin A (Fig. S1). tratamento DMSO de ambas as linhas celulares de cancro renal (UO-31 e A-498) não induziu um aumento da regulação significativa de qualquer único positivo (anexina V) ou dupla positiva (anexina V e PI) populações.

Englerin a morte celular induzida é independente da clivagem de PARP e caspase 3 actividade

a morte celular apoptótica é em parte mediada por caspases efectoras tais como a caspase 3 que clivar e activar alvos a jusante como a poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) . A PARP é pensado para ajudar na sinalização apoptótica, esgotando os recursos energéticos células [28]. A clivagem e activação destas proteínas é portanto um marcador para uma cascata de sinalização apoptótica activado. Para confirmar ainda mais que as células cancerosas renais tratados com englerin A não morrem por apoptose testamos a clivagem de PARP (Fig. 4

A

) e a clivagem e atividade da caspase 3 (Fig. 4

A e B

). Como um controlo, o tratamento de células de SF-295 com estaurosporina durante 4 ou 5 h resultou em bandas de proteína clivada em 17 e 19 kDa indicativos dos fragmentos de proteína activa. Da mesma forma, o tratamento estaurosporina de células SF-295 provocou a clivagem da PARP, tal como indicado pela 89kDa fragmento clivado. Descobrimos que englerin A não afectou a clivagem destas duas proteínas em SF-295 ou as células de cancro renal (UO-31 e A-498). Nós não poderíamos detectar bandas para caspase clivada 3 ou PARP ao tratar as linhas celulares com englerin A para 1 ou 4 horas (Fig. 4

A

). tratamentos de controle de todas as linhas de células com a transportadora DMSO para a mesma quantidade de tempo não resultou em clivagem detectável de caspase 3 ou PARP (Fig. 4

A,

painel da direita).

Células foram tratados com 1 uM englerin um, transportador de DMSO ou estaurosporina 5 uM para a quantidade de tempo indicados. (A) Após a incubação, as células foram lisadas e os lisados ​​foram analisados ​​por imunotransf erência para a clivagem de PARP ou de comprimento completo e clivada da caspase 3 (CASP3-fl, CASP3-CL). Carga igual de proteína foi confirmada por sondagem para GAPDH. Full-length e bandas clivados são indicados. A experiência foi repetida três vezes. (B) Em alternativa, após a incubação as células foram lisadas e a actividade da caspase 3 foi testada usando um kit de ensaio da actividade da caspase 3. Os valores mostrados são médias ± SEM (n = 6), diferenças estatisticamente significativas estão marcados com asteriscos (*** p 0,001). (C) As células foram tratadas com quer 1 uM englerin um, transportador de DMSO durante 60 min ou 50 uM de difosfato de cloroquina (Cloro) durante 18 h. Após a incubação, as células foram lisadas e os lisados ​​foram analisados ​​por imunotransferência por beclin-1, LC3-I /II e caspase uma clivagem (p45 proenzima e clivado subunidade p20 activa). Carga igual de proteína foi confirmada por sondagem para GAPDH. Todas as membranas foram analisados ​​utilizando anticorpos secundários IRDye e um sistema Licor Odyssey. As membranas são mostradas a partir de experiências representativas.

Para confirmar este resultado analisamos a actividade de caspase 3 com um ensaio baseado em ELISA, que mede a actividade enzimática directamente através da clivagem de um substrato de caspase 3. Como esperado, o tratamento com estaurosporina resultou num aumento da actividade da caspase 3 tanto na linha celular de controlo de glioblastoma e a linha celular de cancro renal A-498. Englerin Um tratamento não levou a nenhum aumento significativo na atividade da enzima indicativos de caspase 3 activação (Fig. 4

B

).

Englerin A não induz caspase 1 clivagem

Pyroptosis é um modo de morte celular causada por percursos de inflamação. A sinalização é independente das caspases efectoras relacionadas com a apoptose 3 e 7, mas envolve a libertação de interleucina-1β activo mediado por caspase 1 [29], [30]. Aqui nós medimos a caspase 1 de clivagem como um indicador da morte celular pyroptotic. Seguimos a dinâmica de uma caspase de activação através da detecção dos níveis de pró-enzima de 45 kDa e a 20 kDa reduzida caspase uma isoforma após o tratamento com englerin A (Fig. 4

C). Curiosamente, descobrimos que caspase 1 é activada para um nível baixo em ambos os tipos de linhas celulares testadas, com diferentes níveis de expressão que são mais alta em células SF-295 e mais baixos em A-498 células. Detectamos pequenas bandas para caspase 1 isoformas em amostras de SF-295 células de glioblastoma e UO-31 células de cancro renal. No entanto, o tratamento com englerin Um não aumentou significativamente os níveis de caspase uma clivagem indicativo de sinalização pyroptotic. intensidades de banda para o fragmento de caspase 1 é igualmente baixa. Níveis de p45 pro-enzima mal alterações mediante englerin Um tratamento (Fig. 4

C

)

Englerin A não induz a autofagia

A autofagia é um processo celular em que citoplasmática material é degradada com o auxílio de lisossomas. O mecanismo de per se é uma via de reciclagem que é geralmente associada com a sobrevivência da célula. No entanto, existem relatos de células submetidas a um modo de morte celular na qual as células sobre-regular a sinalização autophagic (embora autofagia não é a causa de morte celular neste cenário). O resultado é chamado autophagic morte de células [31], [32]. A activação de autofagia podem ser analisadas seguindo o processamento do marcador LC3 autophagic e a sua conversão a partir da isoforma I LC3 para a forma II LC3 que é acompanhada por uma alteração no peso molecular [31]. Outro marcador anteriormente para autofagia é beclin-1, que é sobre-regulada por indução de autofagia e desencadeia a formação de autofagossomas [33], [34].

Determinou-se se o tratamento induziu englerin Um autofagia na experimental linhas celulares, seguindo mudanças em LC3 e beclin-1 (Fig. 4

C

). Como um controlo positivo para a detecção da isoforma LC3 II foram tratados todas as linhas celulares com 50 cloroquina uM (Cloro) durante 18 h, uma substância mostrado para prender autofagia na fase autophagosomal resultando num aumento dos níveis de LC3 II [35], [ ,,,0],36]. O tratamento com cloroquina resultou em forte aumento dos níveis LC3 II em todas as células testadas. A LC3 I isoforma foi detectável em todas as linhas de células em todas as condições de tratamento. No entanto, o tratamento com englerin A ou o transportador de DMSO não resultou num significativo aumento da regulação da LC3 II. Mesmo que fomos capazes de detectar bandas fracas para este isoformas LC3 em SF-295 e UO-31 células, o nível se LC3 II não aumentou significativamente após englerin Um tratamento (Fig. 4

C

).

beclin-1 níveis poderiam ser detectado em todas as linhas de células experimentais. níveis mais baixos foram encontrados em células SF-295, os níveis mais elevados em células A-498. O tratamento com englerin A ou cloroquina não resultou em diferenças nos níveis beclin-1, quer em células de cancro renal ou glioblastoma. Englerin A não levaria a um significativo aumento da regulação do beclin-1 níveis de expressão (Fig. 4

C

).

Englerin A provoca a produção de espécies reativas de oxigênio

O estresse oxidativo induzido pela produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) é um fator conhecido causando a morte celular por necrose [24]. Por isso, procurou analisar se englerin A causou um aumento de intracelular ROS. Foram tratados SF-295 e células A-498, com o composto e medido o conteúdo do total de espécies reactivas de oxigénio e de azoto (Fig. 5

Um

).

(A) células foram tratadas com ou 1 uM englerin Um ou veículo DMSO durante 60 min. A mudança relativa na reativas de oxigênio (ROS) ou espécies reativas de nitrogênio (RNS) em comparação com células tratadas com o DMSO transportadora foi medido utilizando o kit de detecção total ROS. Os histogramas mostram as intensidades de fluorescência de uma experiência representativa (painel da esquerda). mudanças relativas quantificados em ROS /RNS mostrados (painel da direita) são meios ± SEM (n = 5), diferenças estatisticamente significativas estão marcadas com asteriscos (* p 0,05). (B) As células foram tratadas com quer 1 uM englerin Um ou veículo DMSO durante 60 minutos, ou 10 uM ionomicina durante 50 min. Fluo-3 de ligação a Ca

2+ foi medida através de um aumento da emissão de fluorescência do corante a 520 nm após excitação a 485 nm. Os histogramas mostram as intensidades de fluorescência de uma experiência representativa (painel da esquerda). mudanças relativas quantificados em íons de cálcio intracelulares mostrados (painel da direita) são médias ± SEM (n = 3), diferenças estatisticamente significativas estão marcadas com asteriscos (* P 0,05, *** p 0,001).

no nosso estudo, englerin a não afectou a quantidade relativa de ROS nas células SF-295 quando comparada com o tratamento com o controlo de DMSO transportadora. No entanto,-A 498 células reagiram fortemente a englerin Um através da produção de ROS concentrações significativamente mais elevadas do que nas células de controlo. A quantidade total de espécies reativas foi cerca de 2,5 vezes maior quando as células A-498 foram tratados com englerin A.

Englerin A induz um aumento na Ca intracelular

2 + concentração

O cálcio tem sido demonstrado que regulam a sinalização necrótico. influxo excessivo de Ca extracelular

2 + para dentro das células pode estimular tanto a produção de espécies reactivas de oxigénio e de morte celular por necrose [24]. Nós medimos os efeitos da englerin A no intracelular Ca

2 + concentrações usando o indicador de cálcio Fluo-3. Este corante nos permitiu quantificar a quantidade de iões cálcio intracelulares após tratamento com englerin A (Fig. 5

B

). A relação Ca

2+ concentração não se alterou quando as células SF-295 foram incubadas com englerin A. Ionomicina, um conhecido indutor de Ca

2+ influxo para dentro da célula, os iões duplicou medidos [37]. Tratamento da-498 A células cancerosas renais com englerin Um aumento significativo de cálcio intracelular para uma extensão ainda maior, então ionomicina. Enquanto ionomicina duplicou a quantidade de cálcio intracelular, englerin A resultou em 4 vezes maiores concentrações.

Discussão

O aumento da incidência de tumores renais em todo o mundo apresenta um problema grave [1], [ ,,,0],38]. Para pacientes com tumores renais em estágio avançado, quimioterápicos eficazes são escassas e frequentemente utilizadas drogas como o sunitinib têm sido associados a efeitos secundários graves [9]. A pesquisa de novos agentes terapêuticos, por conseguinte, tem que ser focado em tratamentos que não só são eficazes no combate aos tumores, mas também suficientemente específica para não danificar as células não tumorais e para evitar efeitos secundários adversos. O produto natural englerin A é um composto que potencialmente se encaixa estes critérios. A sua elevada selectividade e potência contra células de cancro renal colocá-lo no foco de muitos grupos de pesquisa. No entanto, pouco se sabe sobre seu modo de ação, além de alvo dessas células com uma especificidade elevada [10]. A fim de avaliar completamente o uso de englerin A como um agente terapêutico e de antecipar eventuais efeitos secundários, é necessário entender o mecanismo pelo qual o composto afeta as células de cancro renal.

Aqui nós mostramos pela primeira vez como englerin A mata as células cancerosas renais. É importante, também relatam que englerin A é de facto específicos para células cancerosas renais, e não afecta as células normais de rim. No que respeita ao modo de acção, descobrimos que englerin Um induz uma forma de morte celular necrótica nas células sensíveis. marcadores de apoptose como externalização fosfatidil serina, a activação de caspases efectoras ou a clivagem de PARP não são sobre-reguladas após o tratamento com englerin A. permeabilização da membrana do plasma ocorre rapidamente e células não formam corpos apoptóticos. Ao mesmo tempo, os níveis de autophagy não são afectados pelo tratamento e o composto não parecem induzir processos pyroptosis semelhante. No entanto, o modo de morte celular inclui um aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e aumento dos níveis de íons de cálcio intracelulares quer como parte da sinalização necrótica ou um resultado destes.

A potência de um composto é uma importante medida de sua qualificação como uma droga. Metade concentrações máximas inibidoras (IC

50) na gama nanomolar ou inferior são desejáveis.