Abstract

Objetivos

Este estudo teve como objetivo observar as mudanças na angiogénese tumoral após aquecida lipiodol (60 ° C) de infusão através da artéria hepática em um modelo de coelho de câncer VX2 fígado.

Materiais e Métodos

Vinte coelhos com tumores hepáticos VX2 foram aleatoriamente divididos em 2 grupos (10 coelhos em cada grupo). Sob anestesia, uma infusão arterial hepática trans-cateter foi realizada, e lipiodol (37 ° C; grupo de controlo) ou lipiodol aquecida (60 ° C; grupo tratado) foi injectada nas artérias hepáticas dos animais. Em seguida, as mudanças na angiogénese do tumor foram avaliados utilizando os seguintes marcadores e métodos. 1. níveis de receptores de factor de crescimento endotelial vascular (VEGFR) e a expressão do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) no tumor foram avaliados utilizando transferência de Western e de reacção em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (PCR). 2. celular antígeno nuclear de proliferação expressão (PCNA) no tumor foi avaliada através de coloração imuno-histoquímica. 3. As alterações morfológicas do tumor células endoteliais vasculares foram observadas utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

Resultados

níveis de VEGFR e mRNA VEGF e expressão de proteínas foram reduzidas no grupo tratado em comparação com o grupo de controle. proteína PCNA demonstrou níveis de expressão reduzidos no grupo tratado em comparação com o grupo de controlo. TEM indicou que o retículo endoplasmático de células endoteliais expandido, o chondriosome foi inchado, e as microvilosidades de células endoteliais foram reduzidos após a infusão lipiodol aquecida.

Conclusões

A angiogênese tumoral de coelhos com câncer VX2 foi inibida após arterial infusão lipiodol aquecida em comparação com infusão lipiodol

Citation:. Cao W, X Xu, Zhang J, Duan Y (2013) Tumor Angiogenesis depois aquecida lipiodol Infusion via da artéria hepática em um modelo de coelho de cancro do fígado VX2 . PLoS ONE 8 (4): e61583. doi: 10.1371 /journal.pone.0061583

editor: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de dezembro de 2012; Aceito: 11 de março de 2013; Publicação: 24 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo National Science Foundation Natural da China (No. 81170400; https://www.nsfc.gov.cn) e Projeção Província de Shaanxi Ciência e Tecnologia para o Desenvolvimento (No.2011K13-01-16; http: //www.sninfo.gov.cn). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Transcatheter quimioembolização (TACE) foi aceite como uma das formas mais eficazes de tratamento paliativo para os pacientes no meio e fases tardias de carcinoma hepatocelular (HCC), bem como para aqueles que não são bons candidatos para a cirurgia em países asiáticos, incluindo a China [1], [2], [3]. No entanto, a sobrevivência a longo prazo após um procedimento TACE não é satisfatória; a taxa de sobrevivência de cinco anos varia atualmente de 9% para 32% [4], [5]. TACE pode reduzir o tamanho do tumor [6], [7]. TACE No entanto, outros estudos têm encontrado para ser insatisfatória porque angiogénese tumoral pode aumentar após TACE, e apenas uma pequena proporção de HCCs sofreu necrose completa [8]. Por conseguinte, a inibição da angiogénese tumoral após a terapia TACE pode ser uma estratégia promissora para melhorar a eficácia do tratamento.

Recentemente, alguns estudos têm utilizado a termoterapia para suprimir o crescimento do tumor no fígado [9] e verificou que o tratamento com a 60 lipiodol ° C prolonga a sobrevivência dos coelhos com cancro VX2 pela inibição do crescimento tumoral. Além disso, esse tratamento afecta os níveis de AST sérica semelhantes a lipiodol a 37 ° C [10]. Os estudos in vivo também têm demonstrado que a infusão de solução salina aquecida através da artéria hepática pode alterar a permeabilidade vascular tumoral, afectando os níveis de VEGF ou VEGFR [11], [12], porque estas duas proteínas são dois factores importantes relacionadas com a angiogénese tumoral [13 expressão ], [14]. Portanto, o objetivo deste estudo foi observar as mudanças na angiogénese tumoral e analisar as causas subjacentes após trans-hepática, arterial, aquecida (60 ° C) lipiodol embolização através da artéria hepática em um modelo de coelho de câncer VX2 fígado.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care e use Committee (2.010.038) e em conformidade com as diretrizes institucionais.

Modelos animais

Vinte coelhos brancos machos da Nova Zelândia (pesando 3,0-3,5 kg, média de 3,2 ± 0,2 kg) foram selecionados aleatoriamente a partir do centro animal experimental da nossa universidade. células de carcinoma VX2 foram mantidas como uma linha de tumor no nosso laboratório.

foram anestesiados Os coelhos com pentobarbital de sódio por via intravenosa (25 mg /kg). Em seguida, os cabelos ao longo da região abdominal de coelhos foram removidos com 8% de sulfureto de sódio, e a região foi limpa com solução salina. Uma suspensão de tecido de tumor VX2 (cerca de 1,5-2 × 10

6 células) foi injectada através de uma agulha de calibre 18 para o lobo esquerdo do fígado por via percutânea com orientação de ultra-som. A ferida foi mantida estéril, e os sinais vitais de coelho (especialmente a taxa de respiração) foram acompanhados de perto durante a implantação. Em seguida, antibióticos (gentamicina 2,5 mg /kg) foram injectados por via intramuscular após a implantação. Os animais foram observados por ultra-sonografia (Acuson Corp, EUA) até que os tumores atingiram um diâmetro de 2 cm e foram então utilizados para a experimentação. A ultra-sonografia foi realizada pelo mesmo operador, com uma sonda 7v3c com uma frequência de 7,0 MHz.

Experimental Agrupamento

Vinte coelhos portadores de tumor foram aleatoriamente divididos em 2 grupos (n = 10 por grupo) ; cada grupo foi dada uma das duas preparações.

O grupo controle recebeu uma preparação de lipiodol (Aulnay Sous-Bios, França), à temperatura fisiológica (37 ° C).

O grupo de tratamento recebeu uma preparação obtida por aquecimento lipiodol a 60 ° C numa incubadora com temperatura constante.

cateterização arterial

foi feita uma incisão em coelhos anestesiados para expor a artéria femoral direita. Em seguida, um micro-cateter (2.7 /2.9 Pe Reshapable Tipo, Terumo, Japão) foi inserida na artéria femural e posicionado dentro da artéria hepática sob fluoroscopia.

A seguir, sob fluoroscopia, a preparação de perfusão (1 mL /corpo) para cada grupo foi gradualmente mão-injectados para a artéria hepática, com grande cuidado para manter a ponta do cateter na artéria hepática e evitar o efluxo da preparação. Após injecção intra-arterial, o cateter foi removido, a artéria femoral foi ligada, e a ferida foi fechada operativa. os sinais vitais do coelho, especialmente a sua taxa de respiração, foram cuidadosamente monitorizados durante o procedimento de angio. imagens DSA da coloração do tumor VX2 fígado foram adquiridos antes e após a infusão.

Animal Sacrifício

Às 24 horas após a infusão de preparação, os animais foram sacrificados com uma overdose de hidrato de cloral.

a imuno-histoquímica

amostras de tecido de tumor a partir de cada coelho foram fixados em formalina a 10% tamponada neutra e embebidos em parafina. Em seguida, as fatias de 3 a 5 um de espessura foram cortadas e processadas para coloração imuno-histoquímica.

Para detectar a expressão e localização da proteína PCNA em tecidos de tumor, as secções das amostras foram incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-PCNA (Abcam, Cambridge, UK) e, em seguida, com um anticorpo secundário anti-ratinho (Dako) durante 30 min à temperatura ambiente, após o que as reacções de ligação foram visualizados com 3-30 -diaminobenzidina tetrahidrocloreto substrato (DAB) . Os núcleos foram ligeiramente contrastadas com hematoxilina. A coloração imuno-histoquímica foi avaliada por 2 patologistas de uma maneira cega. a seção inteira de cada slide foi examinado sob microscopia de luz. Os níveis de proteína PCNA foram classificados em quatro grupos: 0, nenhuma coloração; 1+, coloração citoplasmática em menos de 10% das células; 2+, coloração citoplasmática em 10-50% das células; e 3+, coloração citoplasmática em mais de 50% das células

Tempo real quantitativa de Reacção em Cadeia da Polimerase

O tumor amostras foram recolhidas e armazenadas em RNAwait (Applygen, Beijin, China). – 70 ° C, após o que os coelhos foram sacrificados. O ARN total foi isolado a partir de amostras com reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o ADNc foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN total com a primeira cadeia de cDNA Synthesis Kit (Toyobo, Osaka, Japão). Os oligonucleótidos iniciadores para reacção em cadeia da polimerase (PCR) foram concebidos como se segue: VEGF, 5′-GCAGAAGAAGGAGACAATAAACC-3 ‘e 5′-GCACGCAGGAAGGCTTGAATA-3’; VEGFR-5’CCAGGGAGAAGCAGAGCCAC-3 ‘e 5′-TGCCAATACCAGCGGATGTG-3′; e β-actina, 5’- CGAGATCGTGCGGGACAT-3 ‘e 5′-CAGGAAGGAGGGCTGGAAC-3’. As reacções de PCR foram realizadas em triplicado utilizando SYBR Green PCR em tempo real master mix (Toyobo). Os níveis de expressão relativa de ARNm de VEGF foram quantificados usando o 2

-ΔΔCt método de [15].

Western Blotting

As amostras foram submetidas a lise em tampão de lise arrefecido em gelo (2 mM de EDTA , 10 mM de EGTA, 0,4% NaF, Tris-HCl a 20, 1% de NP-40, 1% de Triton X-100, inibidores de proteases, pH 7,5) utilizando um homogeneizador de vidro. As concentrações de proteínas foram medidas utilizando o ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL). As proteínas foram separadas por electroforese em dodecil sulfato de sódio poliacrilamida gel (SDS-PAGE) e transferidos para membranas de nitrocelulose Hybond ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). As análises de Western blot foram realizadas utilizando um anticorpo anti-VEGFR (Abcam, Cambridge, UK) e um anticorpo anti-VEGF (Santa Cruz, CA, EUA), e um anticorpo anti-β-actina foi utilizada como controlo interno. Em seguida, as amostras foram incubadas com uma peroxidase de rábano pareados por espécies (HRP) -conjugated anticorpo secundário. Os blots foram desenvolvidos com uma solução de substrato de quimioluminescência (Pierce, Rockford, IL) e exposto a filme de raios-X. Os IDVs foram calculados usando um sistema de análise de imagem computadorizada (Fluor Chen 2.0) e normalizado para a expressão de β-actina.

Depois de os tecidos de tumor foram obtidas Microscopia Electrónica de Transmissão (MET) , fracções microvasos impuro isolado a partir do tecido do tumor foram seleccionados e divididos em 1 mm

3 partes e fixas com 2,5% de glutaraldeído-4% de paraformaldeído durante vários dias a 4 ° C. Em seguida, utilizando procedimentos padrão, secções semi-finas e ultra-finas foram preparadas e coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo, e as mudanças no tumor células endoteliais vasculares foram observadas utilizando MET (JEM-1200EX, Jeol, Tóquio, Japão).

Análises estatísticas

Todos os resultados são indicados como a média ± DP para cada grupo. O teste t de Student foi realizado para comparar os dois grupos, e o teste U de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis de proteína PCNA entre os grupos. Um valor P inferior a 0,05 foi considerado significativo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 16.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Resultados

DSA Imagem

Depois de embolização, o fígado imagens DSA de os coelhos no grupo lipiodol (60 ° C) mostrou opacidade contornos na região do tumor, um sinal de completa oclusão da vasculatura do tumor, e os vasos normais proximais dos coelhos permanecem de patente (Fig. 1).

os tumores mostrou hipervascularização no fígado como determinado com DSA de imagem (a, seta preta). Após lipiodol (60 ° C) a injecção, os tumores são completamente ou em grande parte de vascularizado e mostrar na DSA como um defeito de enchimento lipiodol (B, seta preta).

achados imunohistoquímicos

imuno-histoquímica revelaram que a expressão da proteína PCNA foi detectada principalmente nas células de tumor VX2 viáveis ​​(Fig. 2). Descobrimos que os níveis de expressão PCNA no grupo tratado foram menores do que no grupo controle (Tabela 1)

Como detectada por imunohistoquímica, a expressão da proteína PCNA foi detectada principalmente em células de tumor VX2 viáveis ​​(marrom;. A, controle 400 ×;.. B, tratados 400 ×)

real-time PCR quantitativo e Western Blot achados

Como detectado por real-time PCR quantitativo (Fig 3) , os níveis de ARNm de VEGF e VEGFR no grupo tratado foi significativamente menor do que no grupo de controlo. As análises Western blot revelaram que os níveis da proteína de VEGF e VEGFR no grupo tratado expressão também foram significativamente mais baixos do que no grupo controlo (Fig. 3).

As alterações relativas na VEGFR ou proteína VEGF e os níveis de ARNm em tecido de tumor foram detectados após o tratamento em cada grupo (n = 10). A e B. Os níveis de expressão de ARNm de VEGF e VEGFR foram avaliadas utilizando PCR em tempo real quantitativo, tal como descrito nos Materiais e Métodos. C e D. VEGFR e os níveis de proteína de VEGF foram detectados utilizando a análise de mancha de Western (painel superior). β-actina foi detectado como um controlo de carga. níveis de VEGFR e expressão de VEGF foram quantificadas por densitometria e representada graficamente como a mudança de dobragem (painel inferior). Os valores são apresentados como a média ± SD de 3 ensaios independentes (*

P

. 0,05

vs

grupo controle).

Achados TEM

resultados TEM revelou que a perfusão lipiodol aquecida induzida retículo vascular endotelial endoplasmático para expandir ea chondriosome a inchar, e as microvilosidades de células endoteliais foram diminuiu (Fig. 4).

Estimulado pelo aquecida ( 60 ° C) de perfusão lipiodol, TEM resultados revelaram que o microvilosidades das células endoteliais do tumor diminuiu (a, 5000 ×), o retículo endoplasmático da célula endotelial vascular expandida e o chondriosome estava inchado (B, 10000 ×).

Discussão

TACE para tumor de-vascularização foi desenvolvido na década de 1970 [16]. Atualmente, a TACE é o tratamento mais amplamente utilizado primário para HCC irressecável e também é a terapia mais amplamente usado para pacientes em lista de espera para transplante de fígado. TACE atrasa significativamente a progressão do tumor [17], mas alguns estudos relataram um aumento nos níveis de VEGF no soro após TACE [18]. Os níveis elevados de VEGF 1-2 dias após TACE em doentes com HCC estão associados com metástase distante e os resultados desfavoráveis ​​[19].

Lipiodol tem sido usado como um veículo de agentes anti-tumorais em quimioterapia dirigida para o carcinoma hepatocelular, e lipiodol não é apenas usado para emulsionar medicamentos para TACE, mas também usado como um agente de embolização para embolização arterial trans-hepática e para tumor de-vascularização [17]. Uma vez que a expressão da proteína VEGF em tumores pode responder ao calor [11] e as tumorais viáveis ​​células endoteliais vasculares são sensíveis ao calor lesão [20], e a análise por espectrometria de massa de droga mostraram que a cisplatina não é afectada pelo calor [21], e doxorrubicina e mitomicina-C também não são degradados a temperaturas de 60 ° C [21], lipiodol aquecida como um novo agente embólico através de administração artéria hepática pode distribuir o calor e emulsionar drogas TACE convencionais (doxorubicina, mitomicina-C, cisplatina) para todo o tumor e pode afetar os níveis de expressão da proteína VEGF no tumor ou a vasculatura do tumor.

Prevenção tumor Angiogenesis Depois de aquecida lipiodol Injection

Após a injeção lipiodol aquecida, TEM revelou que a célula endotelial retículo endoplasmático tumor expandido, o chondriosome estava inchado, e as microvilosidades de células endoteliais foram reduzidos, o que são sinais de danos às células endoteliais. Estes sinais, embora indireta, apoiar o efeito do calor sobre as células endoteliais em tumores VX2; o lipiodol intra-arterial (60 ° C) injecções parecia resultar na destruição do leito capilar do tumor.

De facto, embora o calor é tóxica para células endoteliais vasculares de tumor, o efeito preciso de calor sobre as células varia com o medida de calor e duração. calor grave ou prolongada pode alterar proteínas intracelulares (como desnaturação do colágeno e lipídica bicamada descongelamento) e induzir a morte celular; Se o calor é leve ou de curta duração, que pode causar uma série de mudanças genéticas adaptativos nas células [22].

aquecida perfusão lipiodol pode não ser suficiente para induzir a morte de células endoteliais vasculares de tumor, mas pode causar um série de adaptação proteínas genéticas ou intracelulares alterações, como a mudança de expressão VEGFR no tumor células endoteliais vasculares. Uma vez que a mudança de expressão de VEGFR está intimamente relacionado com alterações da morfologia das células endoteliais [23], foram observadas as alterações morfológicas em células endoteliais de tumor vascular por TEM após a infusão lipiodol aquecida. Observou-se a diminuição do ARNm de VEGF e VEGFR e os níveis de expressão de proteína resultou a partir do tumor e células endoteliais respostas ao procedimento lipiodol de perfusão aquecido, respectivamente. O VEGF e diminuiu os níveis de proteína VEGFR pode ser atribuível a inibição da angiogénese tumoral.

prevenção do crescimento do tumor após a perfusão aquecida Lipiodol

Temperaturas acima de 42,5 ° C são eficazes para suprimir o crescimento de células de tumor [24], mas, se a temperatura é elevada acima de 45 ° C, o dano para as células hepáticas normais se torna irreversível [24]. Ao compreender a distribuição não homogénea dos vasos sanguíneos, o arrefecimento do fluxo de sangue do tumor e as diferenças de tamanho do tumor, conclui-se que a temperatura da lipiodol aquecida no interior dos tumores deve ser de pelo menos 43 ° C. Neste estudo, em primeiro lugar, que, gradualmente, mão-injectado sob fluoroscopia para evitar o refluxo durante a perfusão, em segundo lugar, utilizou-se o registador de temperatura matemática percutânea para a monitorização da temperatura de perfusão, de modo que a temperatura da lipiodol aquecida no interior dos tecidos do fígado não foram mais do que 45 ° C durante a perfusão aquecida, e em nosso estudo dos vasos normais proximal de coelhos ainda permanecem patente observado por DSA após a perfusão aquecida.

Usando imunohistoquímica, observou-se baixa expressão da proteína PCNA nas células tumorais após a perfusão lipiodol aquecida. De acordo com os nossos dados PCNA, o tratamento com 60 ° C lipiodol crescimento do tumor marcadamente inibida nos coelhos com carcinoma VX2, em comparação com os tratados com 37 ° C lipiodol.

tem sido relatado que a inibição da angiogénese tumoral aumenta antitumoral eficácia [25]. Porque anoxemic células tumorais têm sido mostrados para ser mais sensíveis ao calor do que as células normais [26], [27] e o lipiodol aquecida pode destruir o leito capilar do tumor, o lipiodol aquecida pode ser retida no tumor, e o calor pode ser distribuído a os capilares neogenetic de todo o tumor. Teoricamente, mais calor pode penetrar no espaço extracelular de células tumorais para alcançar um efeito terapêutico aumentado. Os capilares mais longos tumorais manteve-se na gama de 43 ° C a 45 ° C, o efeito curativo mais o calor teve em tecidos tumorais, e, em seguida, resultar na inibição do crescimento tumoral e angiogénese de tumor células ‘.

Limitações

Apesar de termos tentado aplicar um registrador de temperatura matemática percutânea para o monitoramento, não fomos capazes de medir com precisão a temperatura do lipiodol aquecida por todo o tumor. A mudança de viscosidade dos lipiodol com o aumento da temperatura e o impacto da alteração da viscosidade no tumor como alteração da biodistribuição não foram avaliados em nosso estudo, mas serão abordadas em estudos futuros.

tumor VX2 é bem conhecido para o desenvolvimento de necrose que podem alterar a taxa de neovascularização, por isso, neste estudo nós seleccionado tumores VX2 (14 dias após a implantação) para tratamento experimental, porque os tumores VX2 nesta fase tem uma comparativamente grande volume do tumor, mas de necrose tumoral pequena e, portanto, têm menos efeito sobre a taxa de neovascularização [10], [28].

Conclusões

eficazmente inibir a angiogênese do tumor após TACE tem sido um tema de pesquisa por algum tempo. Neste estudo, verificou-se que a diminuição da VEGF e os níveis de proteína VEGFR pode ser atribuível à inibição da angiogénese tumoral em coelhos com câncer VX2 após arterial aquecida infusão lipiodol, mas os benefícios clínicos desta abordagem precisa de mais avaliações, tais como mudança de viscosidade lipiodol e alteração biodistribuição com temperatura aumentada e assim por diante, deve ser considerado. Assim, este estudo poderia finalmente facilitar a investigação pré-clínica, e acreditamos que a injeção lipiodol aquecido pode efetivamente tratar HCC avançados ou recorrentes.