Abstract

Redução ou depleção do DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido associada com a progressão do câncer. Embora o conteúdo mtDNA desequilibrada é conhecido por ocorrer no cancro da próstata, diferenças no conteúdo de mtDNA entre a American Africano (AA) e caucasianos americano (CA) homens não estão definidos. Nós fornecemos a primeira evidência de que os tumores em homens AA possuem nível de mtDNA em relação aos homens CA reduzida. O conteúdo mtDNA tumor média foi reduzida em homens AA. conteúdo mtDNA também foi reduzida em tecidos normais da próstata de homens AA comparação com os homens CA, sugerindo uma possível predisposição a câncer em homens AA. teor de mtDNA também foi reduzida no tecido da hiperplasia prostática benigna (BPH) de homens AA. Tumorais e tecidos de pacientes de BPH ≥60 anos de idade possuem reduzida mtDNA conteúdo em comparação com pacientes 60 anos de idade. Além disso, o conteúdo do mtDNA foi maior em tecidos normais de pacientes com doença maligna fase T3 em comparação com pacientes com doença de estádio T2. níveis de mtDNA em tecidos da próstata normais pareados foram quase dobrou em Gleason grau de 7 comparação com ≤7, ao passo que o conteúdo mtDNA reduzida foi observada em tumores de Gleason grau 7 comparação com ≤7. Juntos, nossos dados sugerem que os homens AA possuem níveis mais baixos do mtDNA em circunstâncias normais e tecidos tumorais em relação aos homens CA, o que poderia contribuir para maior risco e câncer de próstata mais agressivo nos homens AA

Citation:. Koochekpour S, T Marlowe , Singh KK, Attwood K, Chandra D (2013) Redução do DNA mitocondrial Associates conteúdo com mau prognóstico de câncer de próstata em homens Africano americano. PLoS ONE 8 (9): e74688. doi: 10.1371 /journal.pone.0074688

editor: Madhuri Kango-Singh, da Universidade de Dayton, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de abril de 2013; Aceito: 08 de agosto de 2013; Publicação: 23 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Koochekpour et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo recebeu apoio financeiro do National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número R01CA160685 e K01CA123142, e da Sociedade americana de Câncer Research Scholar Grant RSG-12-214-01 – CCG a DC eo P30 CA016056 Instituto Nacional do Câncer Centro de Suporte Grant ao Roswell Park Cancer Institute. Apoio adicional foi fornecida por R01MD005824, R21CA149137 e R21CA143589 a SK e R01 CA121904 e R21 CA153097 a KKS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Em termos de diagnóstico e de mortalidade, o câncer de próstata é um dos principais tipos de câncer entre os homens americanos. diagnósticos relacionados com o cancro da próstata aumentada e mortalidade são comumente associados com homens afro-americanos (AA) em comparação com Caucasiano americano (CA) homens [1] – [3]. Embora a dieta e história familiar provavelmente desempenham um papel importante nesta disparidade, fatores genéticos também podem ser fatores-chave que influenciam tumorigênese próstata. A mutação ou deleção do DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido associado a vários cancros, incluindo o cancro da próstata [4] – [6].

In vitro

e

in vivo

análises demonstram que a redução do teor de mtDNA está associada a aquisição de um fenótipo independente de androgénios e leva a progressão do câncer de próstata [6] – [8]. nível reduzido de mtDNA e mutações no mtDNA têm sido relatados em vários tipos de cancro da próstata, tais como [9], [10] da mama [11], renal [12], e no fígado [13]. Em contraste, o aumento do teor de mtDNA também tem sido relatada em outros tipos de cancro, incluindo o cancro da próstata [14] – [16]. A depleção ou diminuição de mtDNA inibe a apoptose, contribuindo assim para a progressão tumoral [17] – [19]. Além disso, a depleção de mtDNA leva ao desenvolvimento de resistência aos agentes anticancerígenos, incluindo a cisplatina e a adriamicina [20]. No entanto, o aumento dos níveis de mtDNA também estão associados com a resistência adquirida ao docetaxel em células de cancro da cabeça e pescoço [21]. Assim, a manutenção de um nível de estado estacionário de mtDNA em células cancerosas é fundamental para um resultado positivo durante a terapia do cancro.

Como mtDNA regula o processo de tumorigênese não está claramente definida, mas a evidência atual sugere que a mutação, redução ou supressão de mtDNA de chumbo para a fosforilação oxidativa com defeito (FOX), aumentou espécies reactivas de oxigénio (ROS) de produção, a indução da via glicolítica, aumento da expressão de proteínas prosurvival, que, finalmente, resulta na proliferação e tumorigénese [19] do cancro, [22] – [ ,,,0],24]. Assim, a modulação do teor de mtDNA em cancro, incluindo cancro da próstata, é importante para a compreensão do processo da doença. Embora os níveis desequilibrados de mtDNA foram relatados no câncer de próstata [7], [16], [24] – [26], níveis diferenciais de mtDNA em AA e pacientes com câncer de próstata CA ainda não foram relatados. Aqui, nós fornecemos a primeira evidência de que reduziu o teor de mtDNA podem contribuir para a incidência mais elevada, bem como agressiva fenótipo de câncer de próstata em homens AA em relação aos homens CA.

Resultados

tecidos tumorais

BPH e próstata têm níveis reduzidos de mtDNA

defeitos OXPHOS são uma das marcas em vários tipos de câncer. O sistema OXPHOS consiste em cinco complexos de múltiplas subunidades, e mtDNA codifica 7 subunidades do complexo I, 1 subunidade do complexo III, 3 subunidades do complexo IV, e 2 subunidades do complexo V [16], [27]. Portanto, para entender a importância de mtDNA na progressão do cancro da próstata, determinou-se o conteúdo mtDNA em amostras de tecido normal da próstata, hiperplasia benigna da próstata (HBP) de tecidos, tumores da próstata e células brancas do sangue (leucócitos). Observou-se que o teor de mtDNA mediana foi reduzida para ~72% em HBP em comparação com tecidos normais de próstata epiteliais em doentes com cancro da próstata (Tabela 1). Além disso, o conteúdo do mtDNA foi também reduzida para ~77% em tumores da próstata primários em comparação com os tecidos epiteliais de próstata normais. Curiosamente, o conteúdo do mtDNA foi significativamente reduzida em leucócitos em comparação com os tecidos epiteliais de próstata normais ou tumores (ver na Tabela 1-7, e a Figura 1 e 2). A informação demográfica paciente restante incluindo idade, raça, encenação, Gleason classificação, status de antigénio específico da próstata (PSA), eo número de pacientes envolvidos são mencionados na Tabela 1.

A, conteúdo mtDNA foi comparado por idade usando Wilcoxon teste da soma de classificação. B, o conteúdo médio de mtDNA em condições normais, BPH, e tumores de pacientes com 60 e ≥60 anos de idade estão representados graficamente para comparação. conteúdo C, mtDNA foi comparada por corrida usando Wilcoxon teste da soma de classificação. D, de conteúdo Median mtDNA em normal, BPH, e tumores de AA e CA pacientes são traçados para comparação.

pacientes com câncer de próstata ao longo de 60 anos porto reduzido teor de mtDNA em tumores, mas aumentou o conteúdo de mtDNA em normais da próstata tecidos

comparação Idade do conteúdo mtDNA em pacientes com câncer de próstata demonstraram que em tecidos epiteliais da próstata normais, o conteúdo mtDNA médio aumento ~229% em doentes ≥60 anos, em comparação aos pacientes 60 anos de idade. Da mesma forma, os valores médios foram também aumentadas em doentes ≥60 anos de idade (Figura 1 A e B). Em contraste com os tecidos epiteliais de próstata normais, o conteúdo do mtDNA foi reduzida em ambos os tecidos BPH e tumorais obtidas a partir de pacientes ≥60 anos de idade em comparação com os pacientes com idade 60 anos. Embora o teor médio de mtDNA em tumores foi ~ 7 vezes menor em doentes com idade ≥60 contra 60 anos de idade, os valores médios apresentaram redução única -16% em pacientes com câncer de próstata mais velhas (Figura 1A e B). É interessante notar que o conteúdo mtDNA em amostras de tumor mostrou alta variabilidade, o que é consistente com resultados anteriores que as células tumorais mostram altos níveis de mtDNA variabilidade [16]. Os níveis de mtDNA em glóbulos brancos também foram reduzidos em pacientes ≥60 anos de idade (Figura 1A).

primários da próstata Tumores e normal da próstata tecidos de Homens AA Possuir Redução mtDNA conteúdo em relação aos homens CA

O câncer de próstata é altamente agressivo em homens AA comparação com os homens CA; No entanto, os mecanismos subjacentes ainda não estão definidos. Diminuição no índice de mtDNA é um dos fatores-chave na progressão do cancro, incluindo no cancro da próstata [7], [25], [26]. No entanto, análises comparativas de mtDNA entre pacientes com AA e CA não foram tentadas. Para entender por que os homens AA mostram maior incidência ea agressividade do câncer de próstata em relação aos homens CA, analisamos o conteúdo mtDNA nestes dois grupos de pacientes com câncer de próstata. Observamos que, em tecidos epiteliais da próstata normais, os níveis de mtDNA em homens AA foram significativamente menores (54%) em comparação com os homens CA (p = 0,047). Embora o teor médio de mtDNA em tecidos tumorais da próstata dos homens AA era 6 vezes mais baixa em comparação com os homens da CA, os conteúdos do mtDNA mediana mostrou apenas -16% de redução. Da mesma forma, o conteúdo do mtDNA foi também reduzida para ~73% em BPH da AA em comparação com os pacientes de Ca (Figura 1C e D). Glóbulos brancos a partir desses dois grupos de pacientes não apresentaram quaisquer alterações significativas no conteúdo de mtDNA (Figura 1C).

Níveis mtDNA Superior em tecidos normais Correspondem a Staging Superior em cancro da próstata

Para estabelecer mais e avaliar a importância do mtDNA na progressão do cancro, comparamos diferentes estágios do câncer de próstata em ambos os grupos de populações combinadas. Surpreendentemente, observou-se maior teor de mtDNA em tecidos normais correspondentes na fase T3 (isto é, do tumor se espalhou através da cápsula prostática) em comparação com a fase T2 (isto é, fase benigna). Como os tumores estágio T3 têm pior prognóstico em relação à fase T2, mtDNA em tecidos normais de tumores T3 precisa de uma investigação mais aprofundada. Embora a razão para o aumento de mtDNA em tecidos normais a partir de tumores de grau superior e fase, não é conhecido, uma explicação plausível pode ser devida a acumulação de um maior número de mitocôndrias alterados ou defeituosos em células normais que não foram transformadas, causando, assim, maior quantidade de mtDNA em tecidos normais em maior grau e estágio. Curiosamente, o conteúdo mtDNA não foi afetada em tecidos tumorais ou em amostras de BPH. É importante ressaltar que o aumento dos níveis de mtDNA em glóbulos brancos no estágio T3 sugerem que o conteúdo mtDNA também poderia ser um possível marcador para o estadiamento e prever a agressividade do câncer de próstata (Tabela 2).

As análises dos níveis de PSA e conteúdo mtDNA demonstraram que a média conteúdo mtDNA foi positivamente associado com níveis de PSA em tecidos normais, ao passo que foi diminuída em tumores de pacientes com níveis de PSA 10. Nenhuma tendência específica foi observada em amostras de HPB (Tabela 3).

mtDNA conteúdo Inversamente Relaciona com Gleason Grau em pacientes com câncer de próstata

No que diz respeito ao grau de Gleason, o conteúdo mtDNA em tecidos epiteliais da próstata normal foi de quase dobrou em Gleason grau de 7 comparação com Gleason grau ≤7. Em contraste, os tumores de próstata mostraram redução valores médios de mtDNA em amostras com grau de Gleason ≥7; no entanto, não foi observada nenhuma diferença no conteúdo de mtDNA entre diferentes graus de Gleason em amostras de HPB (Tabela 4).

Quando comparamos os valores médios de teor de mtDNA em tumores entre o grau Gleason ≤3 e ≥4, observamos -30 % de redução no mtDNA em Gleason de grau menor em comparação com ≥4 grau ≤3, ao passo que não foi observada nenhuma alteração no teor de mtDNA mediana em tumores de Gleason de grande. Foram observados níveis aumentados de mtDNA em Gleason grau ≥4 em tecidos epiteliais normais pareados próstata de Gleason de grande porte; no entanto, os níveis medianos de mtDNA foram diminuídos em tecidos normais correspondentes de ≥4 em Gleason menor (Tabela 5 e 6).

Tendências diferenciais de mtDNA conteúdo na próstata Tumores e normais da próstata tecidos entre AA e Homens CA

a fim de estabelecer a importância do mtDNA em dissecar as disparidades de saúde de câncer de próstata, é essencial para medir os níveis de mtDNA em tecidos normais epiteliais da próstata não canceroso, bem como tecidos tumorais obtidas a partir de pacientes com AA e câncer de próstata CA. Observou-se que o conteúdo mtDNA foi reduzida em tecidos tumorais em comparação com tecidos da próstata normais compensadas em dados combinados de ambos os pacientes CA (p = 0,053) AA e. Em pacientes com cancro da próstata CA, o conteúdo do mtDNA foi 42% mais baixa em tecidos tumorais em comparação com tecidos epiteliais de próstata normais correspondentes (p = 0,068). Em pacientes com câncer de próstata AA, os níveis de mtDNA em tumores mostraram mudanças limitadas em comparação com tecidos normais correspondentes Quando comparamos os valores medianos. No entanto, o teor médio de mtDNA foi reduzida em tecidos tumorais em comparação com tecidos prostáticos normais correspondentes. No entanto, o conteúdo mtDNA em tumores de homens AA foi menor do que os dos homens CA (Figura 2).

A, Devido à natureza emparelhado dos dados, os valores médios do mtDNA foram comparados entre amostras tumorais e normais utilizando signed- Wilcoxon testes de classificação (painel superior da tabela). Normal, BPH e glóbulos brancos foram comparados por meio de testes de Kruskal-Wallis (painel do meio). Tumorais, BPH, e glóbulos brancos foram comparados com um outro usando testes de Kruskal-Wallis (painel inferior). B, valores medianos mtDNA da tabela superior do painel A são traçados para comparação.

BPH e glóbulos brancos apresentam redução dos níveis de mtDNA em relação ao normal próstata e tecidos tumorais

As análises de teor de mtDNA em soma das populações de pacientes com câncer de próstata demonstraram níveis significativamente mais baixos de mtDNA em BPH e glóbulos brancos em comparação com os tecidos da próstata normais (p = 0,001). Da mesma forma, o conteúdo do mtDNA foi reduzido nas amostras de HPB e glóbulos brancos, em comparação com tecidos normais em AA e CA pacientes individualmente (Figura 2). Comparação de conteúdo mtDNA médio entre BPH /tumores e glóbulos brancos mostraram diferenças significativas nos níveis de mtDNA. Da mesma forma, os pacientes CA e AA também demonstraram alterações significativas nos níveis de mtDNA em tumor /BPH e amostras de glóbulos brancos. níveis de mtDNA foram semelhantes nos glóbulos brancos entre AA e os pacientes CA (Figura 2).

Homens AA Possuir Redução mtDNA conteúdo tanto em indivíduos normais e tecidos tumorais da próstata em relação aos homens CA após ajuste para idade, Gleason Grau e PSA

Quando comparamos o conteúdo mtDNA em tumores obtidos de pacientes com AA e CA após o ajuste para idade ou grau de Gleason, ou PSA, embora sem significância estatística, observou-se uma ~7-8, ~ 5 ou 4-5 vezes diminuir no mtDNA, respectivamente, em pacientes com AA. Idade, Gleason grau, e ajustamento PSA de BPH não demonstraram alterações nos níveis de mtDNA em BPH de pacientes com AA, quando comparados aos pacientes CA (Tabela 7). Da mesma forma, não há tendências foram observadas em amostras WBC entre AA e os homens CA. Idade, Gleason, PSA e ajuste de tecidos normais da próstata combinados também demonstrado ~34%, 32%, e 46% de redução, respectivamente, nos níveis de mtDNA em tecidos normais da próstata de pacientes AA em comparação com os pacientes CA (Tabela 7). Estes dados sugerem que os doentes possuem níveis mais baixos de AA de mtDNA em tecidos normais da próstata, bem como em tecidos de tumor, o que poderia ser um factor que contribui para a incidência mais elevada e /ou agressividade do cancro da próstata em homens AA. Os níveis de significância de comparações de pares entre os tecidos da próstata normais, BPH, glóbulos brancos e tumores também são mostrados na Tabela 8.

Discussão

Nosso estudo fornece a primeira evidência de que os tecidos de tumor de próstata de AA homens Harbor reduziu os níveis de mtDNA em relação aos homens CA. Normais tecidos epiteliais da próstata de homens AA também mostram diminuição no índice de mtDNA, em comparação com os homens CA. Embora o significado exacto destes resultados requer mais investigação, os nossos dados sugerem que níveis reduzidos de mtDNA em homens AA pode ser associada com a incidência mais elevada e a natureza agressiva do cancro da próstata em homens AA. Estudos futuros com aumento do número de amostras de DNA de AA e pacientes CA pode fornecer uma maior compreensão sobre o impacto do conteúdo mtDNA reduzida sobre as disparidades de saúde de câncer de próstata. Não se sabe como o conteúdo mtDNA diminui em tumores de próstata de homens AA comparação com os homens CA, mas é possível que γ mtDNA polimerase (pol y), a única polimerase DNA na mitocôndria, que desempenha um papel essencial na replicação do DNA mitocondrial e reparar [28] , não pode ser totalmente funcional em células epiteliais normais e cancerosas da próstata a partir de homens AA. Sabe-se também que o p53 regula a integridade do mtDNA [29] através da sua interacção com pol γ [30]. Embora as mutações p53 são raros em câncer primário da próstata, maior estágio do tumor e grau, independente de androgénios, e câncer de próstata metastático estão associados com alto nível de mutações do gene p53 [31] – [33]. disfunção mitocondrial está associada com a supressão da actividade de p53 [34] e p53 regula a respiração mitocondrial [35], [36]. Estes resultados sugerem que os níveis reduzidos de mtDNA em células epiteliais da próstata e cancerosas normais de homens AA pode ser associada com defeitos de γ pol e as funções de p53.

Como a ocorrência de cancro da próstata em homens AA é maior do que em homens CA , assim como o cancro da próstata é mais agressivo em homens AA [1] – [3], o teor reduzido de mtDNA em células epiteliais de próstata normais e células tumorais a partir de homens AA sugere que a diminuição no índice de mtDNA pode ser um dos factores que contribuem para as disparidades de cancro da próstata em homens americanos. mtDNA humano codifica 13 subunidades da proteína da cadeia respiratória mitocondrial, 22 RNAs de transferência, RNAs ribossomais e 2 [27]. Assim, o teor reduzido de mtDNA pode causar a inibição da respiração mitocondrial devido à falta de OXPHOS funcionais [27], [37]. A falta de resultados de respiração no consumo de oxigénio reduzido, levando à degradação da redutase da 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA-redutase (HMGR) que em última análise, poderia contribuir para a maturação do oncogene Ras [38]. Ativação de resultados Ras na ativação constitutiva de múltiplas vias de sobrevivência sinalização tais como ERK, AKT e NF-

k

B. Portanto, reduziu mtDNA em células normais dos homens AA sugere que a população AA é suscetível a uma maior incidência de câncer de próstata. De facto, a incidência de cancro da próstata em homens AA é ~1.6 vezes maior do que a população CA [1], [2]. Diminuição no índice de mtDNA em células epiteliais da próstata dos homens AA irá resultar em diminuição da capacidade OXPHOS de células epiteliais da próstata transformadas, o que favorece um crescimento mais rápido e invasão [39]. Recentes descobertas utilizando modelos animais apoiar ainda mais a nossa conclusão de que mutações do mtDNA e redução do mtDNA de conteúdo resulta em desenvolvimento do tumor e encurta o tempo de vida dos animais [40].

Redução ou esgotamento de mtDNA e revogação da respiração mitocondrial inibe a apoptose induzida por vários agentes anticancerígenos [18], [41] – [44]. Observou-se uma redução nos níveis de mtDNA em tumores em comparação com tecidos epiteliais de próstata normais, sugerindo que o cancro da próstata nos homens AA é refractário aos agentes anticancerígenos. O teor de mtDNA relativamente superior em células de cancro da próstata CA é mais probabilidade de responder a terapia em comparação com células de cancro da próstata AA. mtDNA conteúdo aumentado também é conhecido proporcionar resistência a agentes anticancerígenos, tais como o docetaxel [21], que pode ser associada com baixo ROS devido ao aumento da actividade de F

0F

1-ATP sintase. Estes efeitos podem também ser devido a diferenças nos tipos de células de cancro. O teor de mtDNA relativamente mais elevada em pacientes CA pode conduzir a função mitocondrial aumentada e a respiração, causando assim reforçada, a morte celular por apoptose em pacientes em comparação com pacientes CA AA. Em contraste, maior teor de mtDNA em tumores de doentes com cancro da próstata CA pode conduzir à proliferação das mitocôndrias devido à indução de genes envolvidos na biogénese mitocondrial. Isto sugere que o teor de mtDNA relativamente mais elevada em doentes com cancro da próstata CA poderia causar a acumulação de abundantes mas morfologicamente alterados mitocôndria, o que pode induzir a apoptose ou alternativas formas de morte celular programada cancro em tumores da próstata. Estes resultados são consistentes com relatos anteriores de que o aumento mutações do mtDNA em tumores da tiróide induzir a acumulação de mitocôndrias defeituosas e alterados [45], [46]. O mecanismo exato do conteúdo de mtDNA diminuída em tumores de homens AA, bem como o teor de mtDNA relativamente mais elevada nos homens CA é desconhecida, mas porque o desenvolvimento do câncer é influenciada por fatores externos e ambientais, além de fatores genéticos, ambos os fatores podem estar desempenhando um papel na expressão diferencial de mtDNA em tecidos epiteliais de próstata normais e de tumores de estas duas populações.

Como a redução no mtDNA associada com a natureza agressiva do cancro da próstata em homens AA? Esgotamento de mtDNA induz cancro da próstata progressão [7], [24], [25]. A depleção de mtDNA previne a apoptose e promove a motilidade celular através de regulação positiva de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt2 sinalização [26]. Portanto, depleção do mtDNA prováveis ​​blocos apoptose, e promove a sobrevivência ea motilidade das células cancerosas através da activação Akt2. Os nossos dados indicam que os pacientes com cancro da próstata Gleason de grau PSA e AA são ajustados associada com a depleção de mtDNA em comparação com pacientes CA, apoiando assim a nossa conclusão de que a redução do mtDNA está associada com a inibição de apoptose e invasão de cancro da próstata em homens AA. Esgotamento de mtDNA induz transição epitelial-mesenquimal (EMT) [8], que é um indicador da progressão do câncer. depleção de mtDNA também reduz os níveis de PARP-1 [25], que promove a progressão do fenótipo neoplásico no cancro da próstata. Estes resultados suportam a nossa conclusão de que o teor reduzido de mtDNA em homens AA pode estar associada com o cancro da próstata mais agressivo.

Em conjunto, os nossos resultados fornecem a primeira evidência de que conteúdos mtDNA é diminuída em tecidos normais epiteliais da próstata e do cancro dos homens AA em relação aos homens CA. Esses achados podem ter importância na previsão dos resultados diferenciais de progressão do cancro da próstata e tratamento em homens americanos. Porque ambos os tecidos da próstata normais e tecidos tumorais de homens CA abrigar níveis mais elevados do mtDNA em relação aos homens AA, prevemos que os homens CA será mais propensos a responder a anticâncer terapia e ser mais suscetíveis ao efeito citotóxico de agentes anticancerígenos comparação com os homens AA. Portanto, uma compreensão clara dos mecanismos de mtDNA desequilíbrio em homens americanos pode fornecer abordagens novas e eficazes para a prevenção do câncer de próstata e terapia.

Materiais e Métodos

Fonte de tecido amostras, considerações éticas, e DNA genômico Extração

coleta de amostras foi realizada após a obtenção do consentimento informado por escrito dos pacientes para o uso de suas amostras para fins de diagnóstico e científicos. Todas as amostras clínicas foram fornecidos com base em um sistema codificado alfanumérico único e aleatório, sem se referir aos pacientes por nome ou usando qualquer outro termo identificador pessoal. Durante o processamento e análise de dados, as amostras foram atribuído um número aleatório diferente. A aprovação ética foi obtida a partir dos Institucionais Review Boards (IRBs) na Louisiana State University Center Ciências da Saúde (LSUHSC), Faculdade de Medicina, New Orleans, LA, e Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY. O estudo conformados com os princípios enunciados na Declaração de Helsinki. Todos os biospecimens tecido foram obtidos a partir das instalações nucleares biospecimen no Cancer Research Consortium Louisiana (LCRC) afiliado com Tulane Medical School e School of Medicine, Nova Orleans e LSUHSC, New Orleans (https://www.louisianacancercenter.org/collaborative-initiatives/shared-resources/biospecimen-core).

Normal sujeitos de pesquisa (a fonte de amostras BPH) neste estudo são definidos como os homens com nenhuma evidência de câncer de próstata. Os glóbulos brancos (WBCs) foram obtidos a partir de pacientes diagnosticados com cancro da próstata primário. tecidos da próstata frescos congelados pareados normais e malignas foram obtidas de pacientes americanos americanos e caucasianos africanas diagnosticados com tumores primários. Neste estudo, os tecidos normais da próstata são considerados como espécimes da próstata normais correspondentes tomadas de pacientes com cancro da próstata primário. Somente tecidos malignos com 70% ou teor de tumor superior foram considerados no estudo. DNAs genómicos foram extraídos usando a QIAGEN DNeasy Blood Kit de tecido, tal como recomendado pelo fabricante. Amostras de DNA genômico foram quantificados usando um NanoDrop 8000 Espectrofotômetro (Thermo Scientific).

Análises do mtDNA conteúdo usando PCR em tempo real

conteúdo mtDNA foi determinada como descrito anteriormente [47]. Em resumo, o ADN genómico total (contendo tanto ADN mitocondrial e nuclear) foi isolado a partir de tecidos normais correspondentes e da próstata, tumores, hiperplasia prostática benigna e de glóbulos brancos a partir de AA e doentes com cancro da próstata CA, como descrito acima. Após quantificação de amostras de ADN pela NanoDrop 8000 Espectrofotómetro conteúdo do mtDNA foi determinada utilizando o Applied Biosystems 7300-PCR em tempo real do sistema.

β-actina

e

citocromo c oxidase subunidade II (COX II)

foram utilizados para amplificação do nuclear e DNA mitocondrial, respectivamente. Primers para

β-actina

COX II

e foram usados ​​como descrito anteriormente [47], [48] e as sequências são as seguintes:

β-actina

(forward ): 5′-TCAC CCACACTGTGCCCATCTACGA-3 ‘,

β-actina

(reverso): 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′.

COX II

(para a frente): 5′-CCCCACATTAGGCTTAAAAACAGAT-3 ‘,

COX II

(reverso): 5′ TATACCCCCGGTCGTGTAGCG GT-3 ‘. As reacções de PCR em tempo real foram realizadas num volume total de reacção de 10 uL contendo 5 ul de 2X iTaq SYBR Green Supermix com ROX (Bio-Rad, Cat # 172-5850), 10 ng de DNA molde, 500 nM de cada um para a frente e reversa primers, e água livre de nuclease. Melting curva análises foram realizadas no final da amplificação para verificar a ausência de amplificação não específica ou um iniciador a formação de dímeros. Os valores do número de ciclos limite (CT) para cada reacção foram calculados usando o software SDS 7300 sistema. As curvas padrão foram geradas utilizando 10 ng a 10 pg de ADN preparado a partir de células não tratadas e LNCaP fornecida eficiência da PCR com base na equação E = 10

∧ (-1 /inclinação) -1 [49]. Os valores médios de Ct foram obtidos por amplificação de

COX II

(específico mtDNA-) e

β-actina (

específicas do nDNA). conteúdo mtDNA foi determinada como 2

∧ΔCt, ou fold diferença de mtDNA de nDNA [29], [47], [50].

Análises Estatísticas

conteúdo mtDNA foi relatado usando as médias, medianas e desvios-padrão. Outras características clínicas e demográficas foram reportados utilizando as frequências e frequências relativas. análises gráficas (parcelas QQ) encontrou o mtDNA conteúdo a ser não-normalmente distribuídos e, portanto, as abordagens não-paramétricas foram considerados para análise desta variável. Para cada grupo (normal, tumor, BPH, e glóbulos brancos), os conteúdos do mtDNA foi comparado entre a idade, a raça, o estágio do tumor, antígeno específico da próstata (PSA), soma Gleason, Gleason menor e Gleason major usando rank-sum de Wilcoxon ou Kruskal- Wallis exigir testes, conforme apropriado. Análises adicionais dentro de cada grupo incluiu comparações de conteúdos mtDNA entre os grupos raciais, enquanto o ajuste para idade, soma Gleason e PSA por meio de análise de duas vias de variância (ANOVA). Como o conteúdo mtDNA é distribuído não-normalmente, p-valores apropriados foram obtidos utilizando metodologias de bootstrap padrão. conteúdo mtDNA foi comparada de uma forma de pares entre os grupos na amostra geral e dentro de cada raça usando o Wilcoxon signed-rank (saudável vs tumor) ou Wilcoxon rank-sum (todas as outras comparações) Testes de exatas. Todas as análises de dados foram realizados em SAS v9.3 (Cary, NC) a um nível de significância de 0,05.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Neelu Yadav e os membros do laboratório Chandra para a leitura crítica do manuscrito. Pedimos desculpas aos colegas cujas publicações, inadvertidamente, não poderiam ser citados.