Abstract
As células cancerosas predominantemente utilizar glicólise para a produção de ATP, mesmo na presença de oxigênio abundante, um ambiente que normalmente resultaria na produção de energia através da fosforilação oxidativa. Embora o mecanismo molecular para este interruptor metabólico a glicólise aeróbica não foi completamente esclarecida, é provável que o dano mitocondrial para a cadeia de transporte electrónico e o resultante aumento da produção de espécies de oxigénio reactivas são importantes forças motrizes. Neste estudo, investigou-se o papel do factor de transcrição Ets-1 na regulação da função mitocondrial e do metabolismo. Ets-1 foi sobre-expressa utilizando um vector de expressão indutível por tetraciclina estavelmente incorporado na linha de células do cancro do ovário 2008, que não expressam níveis detectáveis de basais ets-1 de proteína. Microarray Analysis dos efeitos de Ets-1 sobre-expressão nestas células de cancro do ovário que mostra Ets-1-regula enzimas chave envolvidas na glicólise e vias de alimentação associados, o metabolismo dos ácidos gordos, e defesa antioxidante. Em contraste, Ets-1 down-regula genes envolvidos no ciclo de ácido cítrico, cadeia de transporte de elétrons, e as proteínas mitocondriais. No nível funcional, descobrimos que Ets-1 expressão está diretamente relacionada com o consumo de oxigênio celular pelo qual o aumento causas expressão diminuiu o consumo de oxigênio. Ets-1 sobre-expressão também causou aumento da sensibilidade a inibidores glicolíticas, bem como a inibição de crescimento num meio de cultura pobre em glucose. Colectivamente nossos resultados demonstram que Ets-1 está envolvido na regulação do metabolismo celular e resposta ao estresse oxidativo em células de cancro do ovário
Citation:. Verschoor ML, Wilson LA, Verschoor CP, Singh G (2010) Ets- 1 regula metabolismo energético em células cancerosas. PLoS ONE 5 (10): e13565. doi: 10.1371 /journal.pone.0013565
editor: Jen-Tsan Ashley Chi, da Universidade de Duke, Estados Unidos da América
Recebido: 04 de junho de 2010; Aceito: 24 de setembro de 2010; Publicação: 22 de outubro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Verschoor et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por subvenções do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
introdução
mais de 50 anos atrás, Otto Warburg proposto pela primeira vez que a lesão mitocondrial que leva a função da cadeia de transporte de elétrons deprimido e defeitos respiratórias é um passo importante no desenvolvimento e progressão da carcinogênese [1], [2]. Ao longo das duas últimas décadas, muitos estudos tenham mostrado que os tumores preferencialmente usar glicólise para produção de energia ao longo de fosforilação oxidativa, uma característica que se tornou uma marca de tumor fisiopatologia [3] – [5]. Conhecido como o efeito de Warburg, células cancerosas predominantemente utilizar glicólise para produção de ATP, mesmo na presença de oxigénio abundante, um ambiente que normalmente resultam na produção de energia através da fosforilação oxidativa [2], [6]. Alterações no DNA mitocondrial correspondem a um aumento da produção de ROS e fosforilação oxidativa prejudicada, resultando em diminuição da produção de ATP e aumento da dependência glicolítica [5], [7]. O aumento da produção de espécies de oxigénio reactivas, particularmente H
2O
2, por células cancerosas é provavelmente o resultado de disfunção mitocondrial, como as mitocôndrias são considerados para ser a fonte celular predominante de espécies reactivas de oxigénio [8]. Quatro a cinco por cento do O
2 consumida pela fosforilação oxidativa em mitocôndrias é normalmente convertido em espécies reactivas de oxigénio; portanto, defeitos no sistema da cadeia de transporte de elétrons nas células cancerosas resultaria na formação de espécies reativas de oxigênio excessivo [8] – [10]. Excessivamente produzido, H
2O
2 pode actuar como uma molécula de sinalização por oxidação de moléculas de cisteína nas proteínas, activando várias vias de sinalização, incluindo a MAPK, bem como vários factores de transcrição, incluindo AP-1, p53, NF-kB, e ets-1 [11] – [15]
ETS-1, um membro da família de proteínas Ets de factores de transcrição, regula a expressão de um conjunto diverso de proteínas através da sua interacção com as sequências de consenso específicas a montante de. genes-alvo [16]. A sobre-expressão de ETS-1 tem sido associado com uma multiplicidade de diferentes tipos de cancro, especificamente no que diz respeito à progressão e invasão tumoral [16] – [19]. Além disso, a sobre-expressão de ETS-1 também tem sido associada com mau prognóstico no cancro da mama [20], do ovário [21], carcinomas cervicais e [22]. Tradicionalmente, a ETS-1 é pensada para funcionar como um activador de transcrição e a sua expressão elevada em células endoteliais e do estroma se correlaciona com a invasividade de células tumorais e perda no cancro do ovário e da mama [23] – [25]. Nosso laboratório e de outros têm destacado a importância de Ets-1 na regulação dos diferentes aspectos do comportamento de células cancerosas, incluindo remodelação da matriz extracelular, invasão, angiogênese [26], e resistência aos medicamentos [27]. A ligação entre Ets-1 e invasividade cancro pode potencialmente ser explicada pela lista de genes alvo conhecidas regulados por este factor de transcrição. Vários genes de MMPs e integrinas, bem como activador de plasminogénio de urocinase (uPA), que são todos conhecidos mediadores da degradação da matriz extracelular e a migração de células, são conhecidos alvos para ETS-1 [28] – [31]. Muitos genes cruciais para a angiogênese e remodelação da matriz extracelular, tais como metaloproteinases de matriz (MMP-1, MMP-3, MMP-9), uPA e Integrinβ3, estão sob a regulação direta de Ets-1 [26]. Este factor de transcrição é, assim, considerado como um mediador importante do desenvolvimento de células cancerosas e a progressão do tumor.
Neste estudo demonstrámos que Ets-1 desempenha um papel na regulação do metabolismo da energia em células de cancro do ovário. Usando análise genômica de alto rendimento, descobrimos que Ets-1 regula, direta ou indiretamente, vários genes importantes envolvidos no metabolismo mitocondrial e vias de defesa antioxidante do nosso Ets-1 modelo de células de cancro do ovário sobre-expressão. Funcionalmente, mostrámos que a glicólise, fosforilação oxidativa, e sistemas respiratórios celulares são alteradas em resposta a mudanças no ETS-1. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que Ets-1 é um fator de transcrição chave envolvida na regulação metabólica e estresse oxidativo em células cancerosas.
Resultados
modelo de célula de Câncer de Ets-1 expressão do gene
Ets-1 foi sobre-expresso em 2008 células de cancro do ovário usando um sistema de tetraciclina-inducible, gerando 2008-ETS1 células. ETS-1 na expressão da proteína tratadas com tetraciclina 2008 e 2008-ETS1 foi analisado através de Western blotting (Figura 1). Ets-1 a expressão da proteína não foi detectável em 2008 lisados de células inteiras, mas foi facilmente detectado no lisado induzido 2008-ETS1. O aumento da expressão Ets-1 foi encontrado para ser um efeito específico como os níveis de proteína de dois membros da família Ets semelhantes, Ets-2 e PEA3 não foram alterados neste modelo de ETS-1 sobre-expressão (Figura 2).
2008 células de cancro do ovário foram transfectadas de forma estável para sobre-expressar Ets-1 num sistema indutível da tetraciclina. a expressão da proteína de células 2008 e 2008-ETS1 foi medida através de Western blot após a indução com tetraciclina (n = 3).
A expressão da proteína de fatores de transcrição da família ETS (A) Ets-2 e (B ) PEA3 foram comparados em 2008 e 2008 ETS1 células de cancro do ovário para determinar a especificidade do nosso modelo de expressão Ets-1. A análise Western blot mostrou que nenhum desses fatores de transcrição foi afetada por Ets-1 em células 2008.
Ets-1 regula a expressão gênica análise metabólica
Microarray de 2008 e 2008- células ETS1 revelou que 3.131 genes dos 28,869 genes sondados foram regulados positivamente ou regulados negativamente em resposta a Ets-1 sobre-expressão de pelo menos 1,45 vezes (p≤0.001) (GEO adesão banco de dados # GSE21129). Para este estudo, optou-se por relatar e examinar as mudanças na mRNAs selecionados cujas funções são relevantes para a atividade mitocondrial, metabolismo celular e estresse oxidativo. validação qRT-PCR em tempo real foi realizado utilizando 10 genes alvo que representam vários valores de alteração de dobragem, e os resultados foram normalizados para 4 genes housekeeping separadas. Embora tanto a expressão do gene PPARg e SDHB em 2008-ETS1 células não foram significativamente diferentes a partir de células 2008, as mudanças de dobragem determinadas a partir de tempo real de qRT-PCR foram associados com as mudanças de microarray de dobragem por um coeficiente de correlação de 0,99 (Tabela 1). Portanto, dobre mudanças maiores do que 1,45 foram considerados resultados válidos e foram incluídos neste estudo.
A expressão da G6PD, PDHA, HK, e CYC foram examinadas por Western blot para determinar se o gene diferenças de expressão observados estavam também presentes ao nível da proteína. Nós não encontraram diferenças significativas na expressão de proteínas, entre 2008 e 2008-ETS1 células para qualquer uma das enzimas examinados (dados não mostrados).
A capacidade glicolítica das células cancerígenas é regulado por Ets-1